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경실 제갈
5 years ago
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1 Real Time PCR

2 목차 1. PCR 및 Real Rime PCR 원리 2. Real Time PCR 검출방법 3. Real Time PCR 정량방법 4. Takara Real Time PCR 시약 5. 금일실험내용

3 Polymerase Chain Reaction Taq DNA Polymerase - Thermostable DNA polymease from Thermus aquaticus

4 PCR 원리 1 Cycle Heating Cooling Extension Cycling Primer Polymerase Target DNA Cycling

5 PCR 장비 TP350 Takara PCR Thermal Cycler Dice Touch

6 2 배씩증폭되는 PCR 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle N Cycle CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000 2 n

7 곡선으로표현한 PCR 증폭 Plateau Stage (End-point)

8 일반 PCR 분석방법전기영동 Agarose Gel 을이용한전기영동분석의한계는? 낮은정밀도낮은특이성크기에따른분류밖에할수없는실험자에의한오류가능성높음교차오염결과값을수치화하기어려움 End-Point PCR 은정량분석이불가능하다

9 Real Time PCR 원리 Threshold cycle, C t

10 Real Time PCR 검출방법

11 형광검출법 real-time PCR 은 PCR products 를형광을통해검출한다. 형광검출법은여러가 지가있으며, 그중에서가장대표적인것이 SYBR Green I 을이용한검출법 과형광 Probe 를이용한검출법이다.

12 SYBR 방법 Intercalator 를이용하는방법 (SYBR Green I)

13 Probe 방법 형광표지 probe 를이용하는방법

14 Real Time PCR 방법 Probe 방법 SYBR Green 특이성 SYBR 보다높다 Probe 방법보다낮다 여러개의유전자를 1 번에분석 가능 - Melting Curve - 가능 실험셋팅 ( 편리성 ) 조건설정이어렵움쉽게실험이가능 비용비싸다싸다 각방법별대표적인 다카라제품 Probe RR390 SYBR RR820 RR420 14

15 SYBR 의단점을보완하기위한 Melting Curve

16 Real Time PCR 정량방법

17 Real Time PCR 정량방법 절대정량 (Absolute) produces data with quantity amounts Requires a standard whose concentration(or copy number) is known absolutely Identical amount of sample must be assayed for all unknowns (complex) 상대정량 (Relative) makes comparisons of quantity (no units) Requires endogenous control target (standard curve not used) Normalizes for amount of sample added Standard Curve method Comparative method(or Ct)=> 2 Ct

18 Real Time PCR 정량방법 절대정량 (Absolute) produces data with quantity amounts 농도또는 copy number 를정확히알고있는표준샘플이필요 표준샘플을이용표준곡선을그린후알고자하는샘플의값을알아내는방법 상대정량 (Relative) makes comparisons of quantity (no units) Control 유전자필요 (Housekeeping gene, endogenous control) 각샘플별비교를통해결과값을얻음 (or Ct)=> 2 Ct. Housekeeping gene 이란? 어떤세포에서항상발현되고세포의생명활동에필수적인기능을수행하는유전자의총칭. 형질발현이나 DNA 복제, 세포분열, 에너지대사, 물질대사등에관여하는유전자들이이에속함.

19 절대정량 샘플종류표준샘플량 Ct 값 표준샘플희석 (10 배 ) 기울기 PCR 효율 0.9 목적유전자 목적유전자 목적유전자

20 상대정량 Cell line A Cell line A + 약품처리 mrna Housekeeping gene mrna Actin Target Actin Target

21 상대정량 Relative Quantification (Drug-induced gene expression) Control cell lines Actin Target A > B (2 1 : 2 times much) Sample A : 16 Ct Sample B : 17 Ct => Delta Ct = 1 Ct Control cell lines + 약품처리 A Actin Target A > B (2 4 : 16 times much) Sample A : 17 Ct Drug A treatment induced decreased target X gene expression Sample B : 21 Ct => Delta Ct = 4 Ct

22 상대정량 Relative Quantification (Tissue distribution / Delta Ct Methods) Brain tissue Actin Target X Actin : 17 Ct Target : 21 Ct => Delta Ct = 4 Ct Liver tissue Actin Target X Actin : 22 Ct Target : 26 Ct => Delta Ct = 4 Ct 두조직에서목적유전자의양은같다.

23 상대정량

24 Real Time PCR 시약

25 일반적인 Real Time 실험절차 Cell / Tissue RNA 추출 cdna 합성 (PrimeScript, EcoDry) Real-time PCR 결과분석

26 cdna 합성 First strand cdna 합성 Total RNA/mRNA prep cdna(1st strand) qpcr 반응 5 mrna DNA 증폭 Template Primer SYBR RT dntp primer cdna(1st strand) Real Time PCR

27 Takara 시약에만있는기능 Tli RNaseH Takara qpcr Premix 의정확한정량 : Tli RnaseH 활용 타사제품에는없는오직다카라제품에만있는강점 - 특화된 Tli RNaseH 기능홍보 27

28 Tli RNaseH 효과 RR081 RR820 Tli RNaseH 가 mrna 를제거해주어 Ct 값이낮게나왔다. Ct 값 : RR820<RR081 Ct 값이작다 = 유전자양이많다 = 효율이좋다 RR081+RNaseH RNaseH 를인위적으로처리하 였더니 RNaseH 가들어있는 시약과 Ct 값이같았다. Ct 값 : RR820=RR081 28

29 qpcr 효소선택가이드 Sensitivity Fast qpcr SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) <Code RR420> SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) <Code RR820> SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) <Code RR091> Specificity 제품추천가이드 - qpcr 실험을처음하는고객에게첫번째추천시약 RR820 - 민감도 /Fast/ 긴단편의 qpcr 실험에 RR420 을추천 - RR420, RR820 보다높은반응특이성을원하는고객에게 RR091 29

30 RR820 과최상의조합 PRTSS 실험결과향상을위한 tool TAKARA Perfect Real Time Support System Human, rat, mouse, cow, dog, chicken의 Refseq등록유전자에대한프라이머서열보유 온라인으로간편하게검색 Takara 제품과는반응조건의최적화과정불필요

31 제품선택가이드 qpcr 시약선택가이드 폭넓은타겟에서특이성높은스탠다드시약 SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNAseH Plus) (Code RR820A) 길이가다소긴타겟증폭이나고속모드기기적용 SYBR Premix Ex Taq (Tli RNAseH Plus) (Code RR420A) Primer dimer 등비특이적인증폭이있거나반응특이성을극대화할경우 SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) (Code RR091A) 게놈 DNA 또는 CpG islands 영역을증폭할경우 SYBR Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time) (Code RR071A) 31

32 실험내용 사용시약 : RR820 Template: Mouse brain cdna( 약품처리한 cell, 약품처리하지않은 cell) Primer(gene): Housekeeping gene(actb), 목적유전자 (B2m) A 조 ( 약품처리한 cell) B 조 ( 약품처리하지않은 cell) Template 1 μl 1 μl Primer(F+R) 1 μl 1 μl Enzyme(SYBR) 10 μl 10 μl D.W 8 μl 8 μl Total 20 μl 20 μl A 조 B 조 강솔, 정병일, 박선미, 김정호, 서경호, 한정우, 정의현 전승진, 이언학, 한인규, 최지만, 최주연, 이인호

33 PCR 온도설정 2 1 Q1. 1 번과 2 번의빈칸을채워주세요. Q2. 고객이온도설정이왜 2step 인가요라고물어보면어떻게대답해야할까요? Q3. 2 번과정을추가하는이유는?

Slide 1

PrimeScript 1st strand cdna Synthesis Kit 1 Central Dogma replication transcription 0 processing translation 오늘의내용은? 조직추출 RNAiso Plus 5 mrna 우리가관심있는 mrna가차지하는비율이극히일부이기때문에관심있는 mrna를증폭해서그것을눈으로확인할정도로만들어주는것이다.