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상렬 구
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1 Polymerase Chain Reaction 과반응산물의정제 김상태서울대학교천연물과학연구소 A. Polymerase Chain Reaction Polymerase chain reaction (PCR) 은 genome 상의특정 DNA 염기서열을 denaturation, primer annealing, DNA polymerase에의한 extension을반복함으로서 in vitro 상에서수시간내에적어도 10 5 배로증폭할수있는기술이다. 그원리는 Khorana 등 (Kleppe et al., 1971) 에의해최초로개발되었고, 십여년후 Taq. DNA polymerase의발견에의해 Cetua사의 Mullis 등에의하여실용화되었다 (Mullis and Faloona, 1997; Panet and Khorana, 1974). PCR 기술의개발은현대분자생물학발전에가장큰역할을한중요한사건이고, 이업적이인정되어 Kary Mullis는 1993년 Novel 화학상을받았다. 1. 기본원리 DNA polymerization -- DNA polymerization (primer extension) 은 1) denaturation이일어난 template DNA 2) 3' 말단을갖고있고, template와 specific하게결합한 primer, 3) DNA polymerase, 4) 적정농도의 dntp pool 5) 적정농도의 Mg ++ 이존재하고, DNA Figure 1.

2 polymerase 가활동할수있는적당한온도조건에서일어난다 (Fig. 1). Taq. DNA polymerase -- Mullis 이전의 DNA 증폭기술은 E. coli등에서뽑아낸 DNA polymerase를사용하였기때문에 denaturation 과정중열변성에의하여 DNA polymerase가불활성화된다. 그렇기때문에 PCR의각 cycle을수행하면서각 cycle마다새로 DNA polymerase를추가하는방법으로 DNA의증폭이수행되었다. 심해화산분출구주변에서식하는 Thermus aquaticus 균으로부터 Taq. polymerase (Chien et al., 1976; Powell et al., 1987; Chehab et al., 1987; Kogan et al., 1988) 를추출하여 PCR에사용함으로서기술적인커다란진보가있었다. 즉 Taq. polymerase는모든 DNA가완전히 denaturation이이루어지는 의온도에서도열변성이이루어지지않기때문에 1) cycle의각 denaturation 단계후새로 DNA polymerase를넣어줄필요가없어졌고, 2) 높은온도에서도 enzyme이활성을유지하기때문에 primer의정확한결합을위한비교적높은 annealing 온도를선택할수있게되었다. PCR의과정 (Fig. 2) -- 추출된 total DNA가 의온도에서모두 single strand로분리되고, annealing의온도로온도가내려가면 ( 일반적으로 55 내외 ) 증폭의 target 구간에양끝에 specific 하게 design된 primer가붙는다. Taq. DNA polymerase가잘작동할수있는온도인 72 로온도를높여주면 primer extension이일어난다. DNA polymerization의속도와증폭구간의길이를가만하여충분한시간동안 ( 일반적으로 3kb 이하인경우 30초-1분 ) primer extension을시켜 denaturation 된 DNA의한가닥에서일어난 primer extension이반대가닥에붙은 specific primer의자리넘어로 extension이일어나게한다. 두번째 cycle에서다시 denaturation의온도가되면네가닥의 denaturation이일어난 DNA single strand들이되며, 다시 annealing, extension의과정을반복된 cycle을거치면서 target DNA로부터동일한염기서열을갖는수많은 DNA 가닥들이복제되게된다. 2. PCR 반응의구성요소 DNA polymerase -- PCR을위해가장흔히쓰이는 DNA polymerase는 Thermus aquaticus에서추출된것이며, Thermus thermophilus, Bacillus stereothermophilus 등도많이쓰이고, polymerization의정확도를높이기위한 proof-reading 기능을보강한것, 열변성에의하여 polymerization 기능이 switch on 되어 hot start PCR의역 Taq. DNA polymerase의특성반응산물의 3 end에 adenine을붙여주어 cohesive end를만든다. 이러한특성을이용하여 Taq. polymerase는 TA-cloning에도이용된다. 할을하는것등많은제품이나와있다. 일반적으로 100ul의반응에있어서 unit의농도로사용한다 (Perkin-Elmer Cetus; Lawyer et al. 1989). Promega사의 Taq. polymerase를예를들면 1 unit는 74 에서각각 10nM의 dntp을 30분동안결합시킬수있는 enzyme의양을말하며, 일반적으로 5 unit/ul의농도로제공된다. 그러므로이경우 100ul의반응에있어서 ul의 Taq. polymerase를사용한다. Deoxynucleotide Triphosphates -- 일반적으로 dntp들은각각 200uM의농도로사용하며, 보다저농도의 dntp들을사용하는것이 primer가잘못결합된 non-target site로부터

4 extension 이일어나는것을방지한다고알려져있다 (Innis et al., 1988) Template DNA -- 정제된 DNA는일반적으로 target molecule들을포함하는양으로한다. 1ug의 human single-copy genomic DNA 는 3X10 5, 10ng의 yeast DNA 는 3X10 5, 1ng의 E. coli DNA는 3X10 5 의 target을포함한다. 예를들어고등식물의 chloroplast내의 rbcl gene ( 약 1.4kb) 을증폭시킬경우 100ul 반응의경우 1-50ng 정도의 DNA를사용하는것이적당하다. 정제된 DNA에 EDTA가많은양이들어있을경우에는 Taq. polymerase activity에영향을미치므로, DNA를추출, 정제후최종단계의 elution시에 DW를사용하거나 TLE (Tris-low EDTA; TE 0.1 ) 를사용하는것이좋다. PCR을위한 DNA 정량법 UV spectrophotometer에의해 OD값을재는방법은번거로울뿐아니라일반적으로고도로순수한 DNA일경우에만이정확한값이측정된다. 그러므로이미농도를알고있는 marker와동일한양의 DNA를 EtBr을함유한 agarose gel상에 loading하여농도를상대비교하여측정하는 spot test가더욱효율적이다. Primers -- specific priming을위해서는일반적으로약 18mer 이상의 oligonucleotide를사용하는데. 고등식물의경우에는 genome size가약 5X10 8-6X10 9 정도이므로 18mer 의 primer를사용했을경우 4 18 =6.9X10 10 이므로 genome상에무작위적으로같은 sequence가나타날확률이거의없으며, 최소 15 mer (4 15 =1.1X10 9 ) 이상의 oligonucleotide를사용해야한다. 사용할두 primer는비슷한 Tm 값을갖는것이좋으며, self-complement sequence의존재여부, primer dimer 형성가능성등을고려하여야한다. target N mer의 oligonucleotide와 상보적인 sequence가있을확률 6 mer 1/4 6 = 1/4X mer 1/4 9 = 1/2.6X mer 1/4 12 = 1/1.7X mer 1/4 15 = 1/1.1X mer 1/4 18 = 1/6.9X mer 1/4 21 = 1/4.4X10 12 DNA의 specific priming region에 secondary structure가존재하여 PCR에실패할경우 dgtp 대신 7-deaza-2'-deoxyGTP를사용하는것이매우유용하다. Primer들의농도조건은일반적으로 uM이적당하다 uM 정도의 working solution을만들어보관하는것이편리하다. 관련 web site: Reaction Buffer -- Taq. polymerase를위한여러가지 buffer 조성들이알려져있지만 Saiki et al. (1988) 의조성과같거나이것으로부터변형된것들이대부분이다. 고농도의 dntp의사용시이들은 magnesium ion 과결합하기때문에이때는 magnesium 농도를높여주어야한다. 너무낮은 Magnesium ion 농도하에서는 PCR 반응을일으키지못하며, 너무높은농도하에서는 pseudo band를형성시키거나 mis-paring을일으킨다. 1-4 mm 정도의농도를사용하며, 일반적으로 Taq. polymerase의상품에 10X PCR buffer의조성 Saiki et al. (1988): Suh lab: Tris ph mM 20mM KCl 50mM 50mM MgCl2 1.5mM 1.5mM gelatin 0.01% - NP % - Tween % 0.001% 포함된 buffer는 10X농도로제공되며, magnesium ion 이이미들어있는경우는최종반응농도가 1.5 mm 인것이대부분이다.

5 Figure 3. Sample volume과 Reaction Tube -- 일반적으로 500ul 또는 200ul volume tube에서 25ul-100ul 의 volume으로 PCR reaction을수행한다. 더 100ul 이상의반응은좋지않으며이것은외부로부터의열이전체반응부피에모두전달되는데에시간이걸리기때문이다. Tube는일반적으로 sterilized된것, siliconized 된것은필요하지않는데, DNase, RNase, 그리고각종 PCR inhibitor들이없음이보증된 tube를사용하는것이좋다. tube의벽이두꺼우면온도전달시간이늦어져반응에직접적영향을미친다. 일반적으로 200ul tube는대부분 PCR 전용으로나오기때문에문제되지않지만 500ul scale tube를사용하는 PCR의경우일반적으로사용하는 500ul microcentrifuge tube를사용하면안되며, PCR 전용으로제작된 thin wall tube를사용하는것이좋다. PCR 반응의온도조건과 cycle 수 -- 목련과식물의 ndhf gene의 PCR의경우를예를들면 (Kim et al., 2001) 95 에서 10분간 pre-denaturation과정을거친후, 95 에서의 denaturation 1분, 55 에서의 annealing 1분, 72 에서의 extension 3분의과정을 30 cycle의과정을거치고, 마지막으로 72 에서 7분간추가의 extension과정으로 PCR이수행되었다. PCR 반응은기하급수적인복제과정이므로반응의초기상태가전체반응에매우큰영향을미친다. 일반적인반응조건에있어서 (Fig. 3) 정상적인 denaturation-annealing-extension의 cycle에선행하여약 3분간 95 에서유지시켜

6 template DNA를완전히 denaturation 시킨후반응을시작한다. 불완전한 denaturation 상태에서 polymerase가작동하면원하지않는 PCR product를생성하게된다. 이를예방하기위하여 hot start PCR 방법을사용하기도하는데, 이것은 pre-denaturation 과정후 Taq. polymerase를넣어주는방법을말한다. Hot start PCR의효과를내는많은변형된방법이개발되었는데, 1) paraffin에 Taq. polymerase가싸여있는 tablet을넣고 PCR 함으로서 pre-denaturation 과정중 paraffin이녹아서그때부터 Taq. polymerase가반응물과섞일수있도록하는방법, 2) Taq. polymerase와결합하는 antibody를이용하는방법으로, 반응전모든 Taq. polymerase가 antibody와결합하여 polymerase 기능을할수없게만들어준후 pre-denaturation 과정에서열에의하여 antibody가떨어져 polymerase의기능을회복할수있게하는방법, 3) 그리고최근에는 Taq. polymerase 자체가열변성에의해분자적구조가바뀐후에만이활성을나타내는변형된 Taq. polymerase (Gold TM Taq.; Perkin-Elmer) 가개발되었다. Annealing 온도는사용하는 primer들의 Tm 값보다낮아야만하는데, 너무낮은온도는 mis-pairing에의하여 primer가 specific site가아닌곳에서붙기도하여 pseudo-band 가나타나는결과를가져오기도하며, 온도가 Tm 값과비슷하거나그이상일경우에는 primer가 template에붙지못하여반응이일어나지못한다. 두 primer 의 Tm 값중낮은 Tm 값보다 2-3 낮은온도를선택하는것이가장바람직하다. 실험이잘수행되지않을때에는 2 정도차이가나는 series의온도조건으로테스트를수행한후적당한온도조건을골라본실험을수행하는것도바람직한방법이다. Taq. polymerase의 activity가가장높은온도는 72 이므로일반적으로모든 extension 과정은 72 에서수행한다. 몇몇경우에있어서는 (Kim et al., 1994) 최초 cycle의 extension 시간을 30초로수행한후 cycle 당 3초씩 extension 시간을증가시키기도하는데, 이것은 cycle이반복됨에따라서 polymerase가붙는 priming 된 target의수가증가되므로이를보상하여충분히 extension 시키기위함이다. 모든 cycle이끝나면일반적으로 72 에서 7분정도 extension 시간을더주어충분한 extension으로모든 DNA 가닥이 double strand 상태로되도록한다. 일반적인조건하에서약 30 cycle이지나면 plateau effect (Fig. 5) 에의하여 product의기하급수적증가가감소하게된다. 이것은 1) buffer 속의 dntp나 primer들이소진되거 Long PCR의경우 : 일반적인 Taq. polymerase 들은최대약 5kb 정도의 PCR product를위한반응에사용된다. Takara사의 LA Taq. 은 20-40kb 까지증폭할수있다고선전되고있다. 이경우에있어서 30-35mer 정도의 primer들이사용되고따라서 Tm값이매우높아져서 annealing 온도와 extension 온도를동일하게하는 two-stage PCR을하는경우도있다. 나, 2) dntp나 enzyme의변성, 3) 반응부산물 (pyrophosphate 등 ) 의축적등이그원인이다. 일반적으로 cycle 정도가적정 cycle 횟수이다. 반응산물의확인 -- 2kb 이하의 PCR product의경우일반적으로 EtBr을첨가한 1.5% agarose gel에서 5ul 정도 loading 하여확인한다. 이때 size와농도를알고있는 marker와함께 loading하여예상한 size의 PCR product가만들어졌는지, 그리고 product의농도가 sequencing과정에적당한지확인한다.

7 Figure 5. B. PCR product purification PCR 반응산물에는여러가지반응후잔유물과부산물이존재하여 sequencing과정을방해하기도한다. 특히반응후여분의 primer는 sequencing 과정에서사용하는 primer 와혼합되어 sequencing 결과에나쁜영향을미친다. 그러므로 PCR 반응산물은 sequencing 하기전에일반적으로다음의세가지중하나와같은정제과정을거친다. 1. glass milk에의한정제 PCR 반응산물을모두 agarose gel 에 loading 한후에 gel 상에형성된 band를잘라낸다. 특정조건에서 DNA를흡착하는성질을갖는 silica를이용하여 PCR product 만을정제해낸다 (e. g. GENECLEAN Kit, Bio 101 Inc.). 이방법은가장깨끗하게 PCR product를정제해낼수있는방법이지만, phylogenetic study 와같이 sample의수가많은실험에있어서는실용적이지못하다. 주로 PCR product의 cloning 같은 sequencing 이외의목적의정제에많이쓰인다. 2. column membrane 방식특정조건하에서 double strand DNA 만을부착시키는성질을갖는 membrane에 DNA를붙인후 DNA 이외의물질들을씻어내주고, membrane으로부터 DNA를다시분리시키는과정을거친다 (e. g. QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN). 이방법은 glass milk에의한방법보다는훨씬간편하고, 또매우순수한 DNA를얻을수있기는하지만가격이매우비싸서경제적이지못하다.

8 3. Polyethylene Glycol (PEG) 에의한방법 sequencing을위하여가장간편하고경제적으로 PCR product를정제할수있는방법이고많은 molecular systematics lab에서일반적으로사용하는방법이다 (Soltis and Soltis, 1997). 정제의과정은아래와같다. Preparing Double-stranded PCR products for sequencing Preparation: PEG/NaCl 20% Polyethylene Glycol (PEG) 8000/2.5 M NaCl 3 g PEG g NaCl to final volume of 15 ml with dh2o * Heating helps dissolve PEG % ethanol should be kept in -20C For the final suspension of DNA pellet, use 0.1X TE or dh2o. 1. If mineral oil is used for your PCR, be careful not to get any mineral oil. Mineral oil is extremely bad for PEG extraction. 2. Add same amount of PEG/NaCl solution to each PCR tube. 3. Vortex briefly and place 37C water bath for 15 min. 4. Microcentrifuge for 15 minutes. 5. Pipet off supernatant. 6. Wash pellet with 200 ul cold 80% ethanol by slowly pipetting up and down once. 7. Spin for 10 min in cold microcentrifuge. 8. Pipet off ethanol. 9. Repeat steps 6 to Dry down in Speed Vac with heater on (low setting) for 15 min. 11. Resuspend in ul 0.1x TE or dh2o. 12. Check on mimi-gel (2 ul is enough).

9 REFERENCES AND LITERATURE CITED Chien, A., D. B. Edgar, and J. M. Trela Journal of Bacteriology. 127: Chehab, F. F., M. Doherty, S. Cai, Y. W. Kan, S. Cooper, and E. M. Rubin Nature. 329: 293. Erlich, H. A PCR technology-principles and applications for DNA amplification. M stockton Press, New York. Innis, M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White PCR protocols-a guide to method and applications. Academic Press, San Diego. Innis, M. A., K. B. Myambo, D. H. Gelfand, and M. A. D. Brow DNA sequencing with Thermus aquatius DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: Kim, K.-J. and R. K. Jansen Comparisons of phylogenetic hypotheses among different data sets in dwarf dandelions (Krigia, Asteraceae): additional information from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA. Pl. Syst. Evol. 190: Kim, S., C.-W. Park, Y.-D. Kim, and Y. Suh Phylogenetic relationships in family Magnoliaceae inferred from ndhf sequences. Amer. J. Bot. 88: Kogan, S. C., M. Doherty, and J. Gitschier New England Journal of Medicine, 317: 985. Kleppe, K., E. Ohstuka, R. Kleppe, L. Molineux, H. G. Khorana J. Mol. Biol. 56: 341. Lawyer, F. C., S. Stoffel, R. K. Saiki, K. Myambo, R. Drummond, and D. H. Gelfand Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 264: McPherson, M. J., P. Quirke, and G. R. Taylor PCR A practical approach. Oxford University Press, Oxford. Mullis K. and F. Faloona In Methods in enzymology. Vol. 155 (ed. R. Wu), p Academic Press, New York. Panet, A. and H. G. Khorana. (1974) Journal of Biological Chemistry. 249: Powell, L. M., S. C. Wallis, R. J. Pease, Y. H. Edwards, T. J. Knott, and J. Scott Cell. 50: 831. Soltis, D. E. and P. S. Soltis Phylogenetic relationships in Saxifragaceae sensu lato: a comparison of topologies based on 18S rdna and rbcl sequences. Amer. J. Bot. 84:

cdna의신장반응이저해된다. 이와같이 AMV 유래 RTase 와 MoMLV 유래 RTase 는모두일장일단을가지나필자는 MoMLV 유래 RTase 를선호한다. 또두효소는최적 ph, 최적염농도등에서도차이가있으므로주의해야한다. 최근 Myers 등은 RTase 활성과 PCR

cdna의신장반응이저해된다. 이와같이 AMV 유래 RTase 와 MoMLV 유래 RTase 는모두일장일단을가지나필자는 MoMLV 유래 RTase 를선호한다. 또두효소는최적 ph, 최적염농도등에서도차이가있으므로주의해야한다. 최근 Myers 등은 RTase 활성과 PCR RT-PCR 법 II. 역전사효소반응 ( 주 ) 다인바이오연구소 현재분자생물학분야에서 RNA 수준의 gene expression ( 유전자발현 ) 과 cdna (complementary DNA) cloning에널리이용되고있는 RT-PCR (Reverse transcription ploymerase chain reaction) 은생명정보가 DNA에서 RNA로전달된다는분자생물학분야의