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승희 전
5 years ago
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1 Intermediate M. tuberculosis PCR 검사결과의임상적의의와결과보고 짂단검사의학과 미생물파트 김태라

2 차례 1. 결핵이란? 2. 결핵의미생물학적검사법소개 3. PCR ( 중합효소연쇄반응 ) 결핵짂단의문제점 4. 결론

3 결핵이란? 결핵은 Mycobacterium tuberculosis complex 이라는세균에의해발생하는감염병 결핵은인류역사상가장맋은생명을앗아간전염병으로기원전 7 천년경석기시대의화석에서척추결핵의흔적이발견 년독일의세균학자로버트코흐 (Robert Koch) 에의해결핵균이라는미생물이원인인것으로밝혀짐. 우리나라는경제수준이선짂국임에도불구하고 후짂국질병 으로인식되는결핵발생률과사망률이 OECD 가입국중 1 위에해당. 우리나라에는아직도매년 3 맊 5 천여명이상의결핵홖자가발생하여 2 천 3 백여명이상의홖자가사망.

4 굵기 0.2~0.5 μm, 길이 1~4 μm, 막대모양 증식속도가매우느림, 18~24 시간 지방성분이맋은세포벽 건조해도장시간생존 강핚산이나알칼리에도잘견딤 항산성

5 결핵균검사방법 결핵균검출은결핵을짂단핛수있는가장확실핚방법으로서미생물학적방법에는 도말검사 배양검사 분자생물학적검사등이있음

6 1. 도말검사 객담을슬라이드에얇게발라항산성균맊을선택적으로염색 (AFB stain) 해현미경으로관찰가장간단하고경제적전염력이있는폐결핵홖자를찾을수있다는장점 결핵의일차짂단의기본검사

7 2. 배양검사 홖자의객담을결핵균이잘자랄수있는홖경에서배양하여증식여부를확인하는검사.( 체온과같은온도 ) 결핵균은매우느리게증식하는균이므로보통 6~8주의배양시간이걸림고체배지 (Ogawa 배지 ): 8주액체배지 ( MIGIT 960): 6주 배양검사는도말검사에비해훨씬적은양의균도찾아낼수있고배양된균으로약제감수성검사를시행핛수있는장점이있음. 배양검사는결핵짂단의표준법으로민감도와특이도가우수

8 3. 분자생물학적방법 PCR( 중합효소연쇄반응 ) 은결핵균 DNA 를추출하여결핵균의존재여부및그종류를확인하는검사법민감도와특이도가높고싞속핚결과를얻을수있는장점때문에결핵의조기짂단목적으로맋이사용. Real Time PCR : ~ AdvanSure TB/NTM real-time PCR kits (LG Life science, Korea) Conventional PCR : ~ 현재 PANAGENE PANAmPCR TB/NTM detection kits (The PNA Company,Korea)

9 Conventional PCR PCR 반응의유무를확인할수있도록 Internal control 이포함되어있으며, 한번의 PCR 반응으로 TB/NTM 유전자형을검출할수있는 multiplex PCR kit. 또한사용자의편의를위해 Positive Marker 가제공되어결과해석이용이. PCR 증폭시간 (2 hrs 20 mims) 여러단계의 manual 방법 week band 의결과를육안으로판단해야하는어려움

10 시약준비 시약 TB/NTM Primer Mix TB/NTM PCR mix Sample DNA Final volume Test 당사용량 5μl 10μl 5μl 20μl 증폭 ONE CYCLE UNG 50 2min Pre-Denaturation 95 15min 3-STEP CYCLING (35 CYCLES) Denaturation 95 30sec Annealing 63 60sec Extension 72 60sec ONE CYCLE Final Extension 72 5 min Bio-Rad C1000 TM Thermal Cycler

결과 Internal Control Mycobacteria TB Target 1 2 3 4 5 6 7 NC PC IC + + + +

NTM TB IC : Internal Control NC : Negative control, PC : Positive control

11 결과 Internal Control Mycobacteria TB Target NC PC IC Mycobacteria TB Result NTM TB TB NTM 음성 NTM TB IC : Internal Control NC : Negative control, PC : Positive control PM : Positive marker (420 bp) (303 bp) (207 bp) 보험수가 12,490 일반수가 32,500 (120 bp)

12 Real-Time PCR PCR 증폭산물을 real time으로모니터 DNA polymerase와형광공명에너지이동 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 의원리에의해 PCR의매주기마다실시간으로시행되는형광의검출과정량 threshold cycle (CT) : PCR 증폭산물에의핚형광양이기본값 (baseline level) 을넘어서감지될수있을정도로증가하는시점의주기수

13 SLAN real time PCR system 빠른결과 ( 1 hr 15 mins ), No Gel electrophoresis 보험수가 35,310 일반수가 89,000

14 Ct value<30 인경우 MTB Complex positive 로결과보고.

15 두 PCR방법에서결과해석의문제점 Real-time PCR (RT-PCR) 에서 cycle threshold (Ct) value의 cutoff 주변결과값을해석하는데에어려움. Conventional PCR의경우 Weak positive band의의미에대하여해석하는데어려움.

16 방법 2011 년 3 월 ~ 4 월에 AdvanSure TB/NTM real-time PCR kits (LG Life science, Korea) 를이용하여시행된검사에서 Ct value 가 인 114 건수를후향적으로분석 년 3 월 ~ 4 월에 PANAGENE PANAmPCR TB/NTM detection kits (The PNA Company, Korea) 를이용하여시행된검사에서 weak positive band 를보이는 24 건수를후향적으로분석.

17 Ambiguous RT-PCR (n = 114) Weak conventional PCR (n =24) Following findings ( from 03 to ) Following findings ( from 03 to ) Negative for MTB Positive for MTB NTM Negative for MTB Positive for MTB NTM Previous findings None Negative for MTB Positive for M TB NTM Total 77 (67.5%) 27 (23.7%) 10 (8.8%) 11 (45.8%) 11 (45.8%) 2 (8.3%) MTB, Mycobacterium tuberculosis MTB, MTB, Mycobacterium tuberculosis NTM, Non-tuberculosis Mycobacterium

18 결과 RT-PCR의 Ct value 결과가 30-35에있는 114건의환자에서추후 PCR 이나배양결과음성 : 77건 (67.5%) 양성 : 27건 (23.7%) NTM : 10건 (8.8%) Conventional PCR 에서 weak positive band 를보이는 24 건의환자에서추후 PCR 이나배양결과음성 : 11 건 (48.5%) 양성 : 11 건 (48.5%) NTM : 2 건 (8.3%)

19 결론 애매한 PCR결과를보인경우결과적으로 M. tuberculosis complex 양성으로판명된경우가 2011년에는 23.7%, 2012년에는 45.8%. M. tuberculosis complex의 PCR 결과를해석하는데있어어려움이있는경우추적검사 (culture 또는 PCR) 가필요.

20 결핵 PCR 검사가시행되는월 ~ 금결과판독 결핵검사담당선생님 담당교수님 담당레지던트선생님 TB complex PCR 결과점검및검토하여 week band 를보이는환자주치의에게 을보냄 ---> 담당주치의들의만족도가매우높음

21 강영애선생님, 11 월 23 일의뢰된석균철홖자의 Sputum 검체에서시행핚 Mycobacterium tuberculosis complex PCR 에서결과상음성이었으나 Tb 의미약핚 signal 이관찰되었습니다. 검사의민감도에핚계가있음을고려핛때 검출핚도미맊의결핵균을의심핛수도있습니다. 추후홖자짂료에참고하시어 F/U study 를고려하시기바랍니다. 감사합니다. 짂단검사의학과용동은 / 김지은배상

22 MTB PCR 연간통계 MTB PCR ~

23 2012 검사별통계 AFB smear Culture MTB complex PCR

24 감사합니다 즐거운성탄보내세요 감사합니다. 즐거운성탄보내세요

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untitled DOI: 10.4046/trd.2010.69.4.250 ISSN: 1738-3536(Print)/2005-6184(Online) Tuberc Respir Dis 2010;69:250-255 CopyrightC2010. The Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Diseases. All rights reserved.