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1 중합효소연쇄반응과객담검체를 이용한 mycobacteria 의 검출민감성비교 연세대학교보건환경대학원 의생명과학전공 이정민

2 중합효소연쇄반응과객담검체를 이용한 mycobacteria 의 검출민감성비교 지도이혜영 교수 이논문을석사학위논문으로제출함 2007 년 06 월일 연세대학교보건환경대학원 의생명과학전공 이정민

3 이정민의석사학위논문을인준함 심사위원 심사위원 심사위원 연세대학교 보건환경대학원 2007 년 06 월

4 감사의 글 2년여동안의석사학위과정을무사히마치고논문을낼수있게해주신하나님께감사드립니다. 논문의연구계획에서부터완성이될때까지부족한저를끊임없는인내와큰배려로사랑을베풀어주신이혜영교수님께진심으로감사를드립니다. 그리고논문심사를통하여아낌없는지도를해주신김종배교수님, 김태우교수님께감사를드립니다. 늘열의로정성을다해가르침을주시는양용석교수님, 오옥두교수님, 박용석교수님께감사를드립니다. 논문계획에서부터마무리까지끊기있게조언을해준현주언니, 바쁜회사생활에도내일처럼도와준준환선배, 결혼준비로바쁜가운데논문작업을도와준재우, 시험을앞두고도조언과도움으로함께해준종민, 마지막논문작업을도와준종훈, 힘들때마다함께해준숙영이. 모두에게깊은감사를드립니다. 마지막으로이자리에있게해주신부모님과오빠에게감사를드리며늘기도로써힘이되어준저의사랑하는성진씨에게깊은감사를드립니다 년 6 월 이정민

5 차 례 그 림 차 례 ⅲ 표 차 례 ⅳ 약 기 호 표 ⅴ 국 문 요 약 ⅵ 제 1 장 서 론 1 제 2 장 연구재료 및 방법 4 1. 검 체 4 2. 항산성세균 배양 4 3. DNA 추출 객담 검체에서 DNA 추출 배양후 집락 검체에서 DNA 추출 5 4. Polymerase chain reaction 결핵균과 비정형 결핵균을 구분하기 위한 two-tube nested PCR 비정형 결핵균 동정을 위한 PCR-RFLP 6 5. Niacin test 7 제 3 장 결 과 9 1. 항산성 염색 양성 객담검체의 PCR 9 2. 항산성 염색 양성검체의 배양 항산성 염색 양성검체의 세균 분리배양과정을 통한 PCR 항산성 염색 양성검체의 세균 분리배양후 niacin test PCR-RFLP를 이용한 비정형 결핵균의 동정 객담 검체에서 추출한 DNA를 이용한 비정형 결핵균의 동정 25 - i -

6 5.2. 세균 분리배양 집락에서 추출한 DNA를 이용한 비정형 결핵균의 동정 26 제 4 장 고 찰 27 제 5 장 결 론 31 참 고 문 헌 32 Ab s t r a c t 35 - ii -

7 그림차례 Figure 1. Detection of Mycobacterium tuberculousis from acid fast bacillus smear-positive sputum specimens by two-tube nested PCR 10 Figure 2. PCR amplification of the rpob gene from acid fast bacillus smear-positive sputum specimens 11 Figure 3. PCR RFLP analysis of acid fast bacillus smear-positive sputum specimens 12 Figure 4. Detection of Mycobacterium tuberculousis from cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens by two-tube nested PCR 18 Figure 5. PCR amplification of the rpob gene from cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens 19 Figure 6. PCR RFLP analysis using cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens 20 Figure 7. The graph presents detection rate of mycobacteria from sputum and cultured colony of acid fast bacillus smear-positive specimens by two-tube nested PCR and PCR-RFLP 30 - iii -

8 표차례 Table 1. Primer sequences for Mycobacterium tuberculosis(mtb) and nontuberculous mycobacteria(ntm) 8 Table 2. Isolation of NTM using acid-fast bacillus smear-positive sputum specimens by PCR-RFLP with MspⅠ 13 Table 3. Detection rate of M. tuberculosis and NTM from the acid-fast bacillus smear-positive sputum specimens using two-tube nested PCR and PCR-RFLP 14 Table 4. Colony growth for medium from the acid fast bacillus positive specimen 16 Table 5. Isolation of NTM species from acid-fast bacillus smear-positive colony specimens using PCR-RFLP with MspⅠ 21 Table 6. Detection rate of M. tuberculosis and NTM from colony of the acid-fast bacillus smear-positive specimens using two-tube nested PCR and PCR-RFLP 22 Table 7. Niacin test of acid-fast bacillus smear-positive colony specimens 24 - iv -

9 약기호표 DNA : deoxyribonucleic acid bp : base pairs ATCC : American Type Culture Collection AIDS : aquired immune deficiency syndrome EtBr : ethidium bromide PCR : polymerase chain reaction PCR-RFLP : polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism UV : ultra violet Taq : Thermopilus aquaticus HIV : human immunodeficiency virus EDTA : ethylenediamine tetra-acetic acid TBE : tris borate EDTA - v -

10 국문요약 중합효소연쇄반응과객담검체를이용한 m y c o b a c t e r i a 의검출민감성비교 결핵 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 감염은아직까지전세계에서높은유병률과사망의주요원인이되고있으며비정형결핵 (nontuberculous mycobacteria, NTM) 은최근후천성면역결핍증 (AIDS) 이나, 종양, 이식등으로면역력이저하된환자들의임상검체에서분리빈도가증가함에따라분리균주의임상적의의가중요시되고있다. 이에항산균염색을이용한객담도말검사는결핵균과비정형결핵균을구별할수없다는제한점이있고, 균분리배양검사는시간이오래걸린다는단점이있어, 본연구에서는이러한제한점을가진기존의검사법을대신하여분자생물학적방법인중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 을이용하여세균분리배양검사와비교하여보았다. Mycobacteria를동정하는데항산균염색과 3% Ogawa 배지를이용하였고, 세균분리배양후 M. tuberculosis를확인하기위해서 niacin test를실시한결과집락의 DNA를추출하여 PCR후동정된 M. tuberculosis와 niacin 양성이일치함을확인할수있었다. 또, 이실험에서항산성균염색이 2+ 이상인객담검체와집락검체각각에서 DNA 를추출하여결핵균을동정하는방법으로 M. tuberculosis complex에특징적으로존재하는 insertion sequence(is) 6110의특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을증폭한 two-tube nested polymerase chain reaction을시행하였고, 비정형결핵균동정법으로는 mycobacteria에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp 부분을증폭한후, 제한효소 MspⅠ을첨가 PCR-restriction fragment length polymorphism(rflp) 을시행하였으며, 결핵균과비정형결핵균모두동정률에거의차이가없었다. 1+ 인경우는객담검체에서 PCR한결과가 31.2% 에서집락검 - vi -

11 체의 PCR한 결과 93.7% 까지 결핵균과 비정형결핵균의 동정률이 높아졌고, trace 인 경우 객담검체에서 PCR 결과가 2% 에서 집락검체에서 PCR한 결과가 97.9% 까 지 결핵균과 비정형 결핵균의 동정률을 높일 수 있었다. 이 실험에서 항산성균 염색 1+ 이하 일때 객담검체와 집락검체로 PCR을 실시하면 결핵균과 비정형 결 핵균의 동정률에 차이가 있고, 배양만으로는 결핵균의 동정은 가능하지만 비정형 결핵균의 동정이 가능하지 않으므로 배양검사와 PCR 검사 모두를 병행하므로써 보다 신속하고 정확한 검사결과를 내는데 도움될 것이다. 핵심이 되는말 : 결핵, 비정형 결핵, 항산균 염색, 배양, PCR, PCR-RFLP, 제한효소 MspⅠ - vii -

12 제 1 장서론 항산성세균 (Mycobacterium) 은 acid fast bacilli(afb) 라고도하며보통염색으로는쉽게염색되지않으며가온하여일단염색이되면산이나, 알코올, 알카리에강하고탈색이되지않는성질을가지고있으므로항산성 (acid fastness) 또는항산성세균 (AFB) 이라고한다. 항산성세균중에는 Mycobacterium 균속인 Mycobacterium tubersulosis( 결핵균 ), Mycobacterium lepre( 나균 ), atypical mycobacteria( 비정형결핵균 ) 와약한항산성균으로 Nocardia, Gordona, Tsukamurella 및 Rhodococcus가있다. 포유동물에결핵을일으키는균들을결핵균군 (Mycobacterium tuberculosis complex) 이라부르며, M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti, M. canetti 등이속한다. 사람에감염되는결핵균은 Lehmann와 Neumann이 1896년에 Mycobacterium tuberculosis라고명명했다. 또한비정형결핵균으로예전에는 mycobacteria other than tuberculosis (MOTT), environmental mycobacteria, opportunistic mycobacteria 등으로불리어오다최근에는 NTM(nontuberculous mycobacteria) 으로지칭되고있다 (Falkinham 1996). 결핵감염은아직까지전세계에서높은유병률과사망의주요원인이되고있으며, 이중결핵균 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 은비말에의해전파되며흡입된소수의세균이폐포표면에부착되면폐포대식구에의해탐식되어증식하기시작한다. 감염후숙주내의정상면역력을가진개체이면활성화된 T 림프구와대식구가주축이되는세포개재면역이발현된다. 그결과 tuberculin 양성이되고결핵균이증식하고있는폐조직이반고형의괴사, 즉건락괴사가일어나그속의균들이대식구로부터유리된다. 반고형의건락병변이연화되어액화하면기관지로결핵균이배출되면서결핵의증상이나타난다. 폐결핵의주증상은기침해소, 객담, 전신쇄약, 발열로고생을하며그외에도경림프선결핵 ( 연주창 ), 장결핵, 신장결핵등의질병을일으킨다 ( 이건섭외 1999). 또한비결핵 mycobacteria(nontuberculous mycobacteria, NTM) 는최근임상검체 - 1 -

13 에서 분리빈도가 증가함에 따라 분리 균주의 임상적 의의도 중요시 되고 있다 (Falkinham 1996; Kennedy et al. 2003; Sakatani 1999). 후천성 면역결핍증 (aquired immune deficiency syndrome, AIDS) 이나, 종양, 이식 등으로 면역력이 저하된 환 자들에서 발병빈도가 계속증가하고 있다 (Horsburgh et al. 1991). 신속발육균의 종 류로는 M. abscessus, M. fortuitum, M. chelonaei 등이 속하며, 이들 신속 발육군 (rapid grower) mycobacteria는 토양이나 자연수에 존재하는 환경유래의 오염균으로 중증의 감염을 일으키는 경우가 종종 있다 ( 심영수 1999). 특히 M. abscessus는 주로 연부조직 감염이나 폐 감염을 일으키며 병원성이 강한 것으로 보고 되어 있다 (Metchock et al. 1999; Ingram et al. 1993). M. abscessus에 의한 감염의 경우 대부분의 항결핵제에 내 성을 나타내고 종 내에서도 항균제 감수성이 달라 일반적으로 항균제 감수성 검사가 요구된다. 우리나라에서는 1999년 이후 드물게 국소 조직과 장기에 국한된 연부조직 과 폐 감염의 보고가 있었다 ( 임재준 외 1999; 이효원 외 2002; 김연숙 외 2000). 결핵균과 비결핵균의 분리빈도가 증가함에 따라 정확한 동정이 요구되고 있는데, 대표적인 검사법으로 도말검사 (AFB stain), 배양법, 분자생물학적 방법을 들 수 있다. Mycobacteria를 감별동정하는 도말검사는 기법이 간편하고 저렴하여 쉽게 할 수 있고 결과가 빨라 환자관리에 편리할 뿐 아니라 이 방법으로 진단되는 환자가 바로 결핵을 전파하는 전염원이라 역학적 측면에서도 중요하다. 그러나 직접도말 검사는 객담 1 ml 내에 10 4 개 이상의 균이 있어야 검출이 가능할 정도로 감수성이 낮고, 결핵유병률이 높은 지역에서는 문제가 안되지만 결핵이 많지 않은 지역에서 는 도말표본에서 보이는 항산성세균이 결핵균이 아닌 경우가 많아서 특이성도 문 제가 되고 있다. 반면에 세균 분리배양검사는 균동정이 가능해 특이성도 높고 비교적 소수의 세균도 검출이 가능해 감수성도 높은 편이지만, 검사과정이 복잡해 비용도 많이 들고 잘 훈련된 요원에 의해서만 행할 수 있으며 검사결과가 3 4 주 이상 걸리 는 단점이 있다 ( 김상재 외 1992). 따라서 요즘은 뛰어난 감수성과 특이성에 이어 결과의 신속함을 가진 분자생 물학적 방법인 중합효소연쇄반응 (polymeras chain reaction, PCR) 도 사용하고 있 - 2 -

14 으나 PCR은비용과검체내세균수크기를알려주지못하는단점이있다. 이에본연구에서는 mycobacteria의동정에있어, 보다정확하고신속하게동정하기위해서항산성세균양성검체를이용하여세균분리배양검사와 PCR 방법을비교해보았다

15 제 2 장연구재료및방법 1. 검체 2006 년 8월부터 2007 년 3월까지서울시소재의한대학병원에서결핵환자로의심되는객담검체를 Ziehl-Neelsen's 법에따라항산성염색한결과 trace 이상의양성으로결과가판독된 266 개의검체를사용하였다. 2. 항산성세균배양 객담내에는 결핵균보다 발육속도가 빠른 잡균이 많이 있으므로 이들을 제거 하기 위해서 4% NaOH 처리를 이용한다. 강한 alkali는 객담내 오염균을 사멸할 뿐 아니라 객담을 액화시키므로써 항산균이 배지에 접촉할 수 있게 해준다. 신속발육 항산성세균은 5 7 일 이내에 발육하지만, 신속발육 이외의 항산성 세균은 4 주이상 발육이 관찰되므로 4 주에 중간결과를 보고하고 8 주까지 배양 한다. 3. D N A 추출 객담검체에서 D N A 추출 객담검체를 4% NaOH 로동량첨가하여잘섞은다음 15 분후 3,000 rpm 에 서 20 분간원심분리한후상층은버린다. 침전물에증류수 1 ml을가하고잘섞 은후 microcentrifuge tube 에 1 ml를넣고 12,000 rpm 에서 3 분간원심분리후상 - 4 -

16 층은버리고침전물을추출한다. 각침전물에 Insta Gene Matrix(Bio-RAD, Hercules, California, USA) 200 μl를첨가후잘섞는다. 이후 56 heat block 에 30 분방치한후 8 분간끊인다음즉시 ice-water에식힌후 12,000 rpm에서 3 분원심분리하여상층액을 DNA template로사용하였다. 즉시사용하지않을시에는 -20 에보관한다 배양후집락검체에서 D N A 추출 3% Ogawa 배지에서자란균집락검체는 200 μl의 Insta Gene Matrix액에풀어 56 heat block에 30 분방치한다. 이후 8 분간끊인다음즉시 ice-water 에식힌후 12,000 rpm에서 3 분원심분리하여상층액을 DNA template로사용하였다. 4. P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n 결핵균과비정형결핵균을구분하기위한 t w o - t u b e n e s t e d P C R F i r s t P C R 선택된 primers가 든 반응 혼합액 (mixture, 45 μl ) 에 Insta Gene Matrix에 의 해 추출된 DNA 산물 5 μl를 가하고 Thermal cycler(geneamp PCR system 9700, Perkin-Elmer Cetus, Boston, Massachusetts, USA) 를 이용해 표적 DNA를 증폭 합성하였다. 반응 혼합액 조성은 M. tuberculosis complex(m. tuberculosis, M. bovis) - 5 -

17 에 특징적으로 존재하는 IS 6110의 547 bp를 증폭하기 위하여 primer로 pr-5인 5 -CTC AAG GAG CAC ATC AGC-3 와 pr-6인 5 -TCA TAG GAG CTT CCG ACC-3 를 각각 1 μl씩 첨가하고, Taq DNA polymerase(perkin-elmer Cetus Corp., Norwalk, California, USA) 를 0.25 μl, dntp(datp, dctp, dgtp, dttp) 각각 1.0 μl씩, 10x reaction buffer 5.0 μl, 증류수 μl를 첨가하였다 (Table 1). 반응주기는 pre-denaturation 94 5 분, denaturation 94 1 분, annealing 60 1 분, elongation 72 1 분을 30 cycle을 시행하였다 S e c o n d P C R 선택된 primers가든반응혼합액 (mixture, 48 μl ) 에 First PCR product 2 μl를가하고 Thermal cycler를이용해표적 DNA를증폭합성하였다. 반응혼합액은조성은 M. tuberculosis complex(m. tuberculosis, M. bovis) 에특징적으로존재하는 IS 6110의 285 bp를증폭하기위하여 primer로 pr-7인 5 -CTA CGG TGT TTA CGG TGC CC-3 와 pr-8인 5 -TAG GCG TCG GTG ACA AAG GC-3 를각각 1 μl씩첨가하고, Taq DNA plymerase를 0.25 μl, dntp(datp, dctp, dgtp, dttp) 각각 1.0 μl씩, 10x reaction buffer 5.0 μl, 증류수 μl를첨가하였다 (Table 1). 반응주기는 pre-denaturation 94 5 분, denaturation 94 1 분, annealing 62 1 분, elongation 72 1 분을 30 cycle을시행하였다. 반응이끝난다음, 반응물 10 μl를취해 2% agarose gel에서전기영동한후 ethidium bromide(etbr, 0.5 μg / ml ) 로염색하여 302 nm의 UV transilluminator (Spectroline Co., Albany, New York, USA) 로 DNA bands를관찰하였다 비정형결핵균동정을위한 P C R - R F L P - 6 -

18 NTM 동정을 위하여 추출된 DNA산물에 mycobacteria에 공통적으로 존재하 는 rpob 유전자 중 일부인 360 bp를 증폭하기 위하여 primer로 RPO1 인 5 -TCA AGG AGA AGC GCT ACG A-3 와 RPO2 인 5 -GGA TGT TGA TCA GGG TCT GC-3 를 PCR하였다 (Table 1). 증폭된 PCR산물 15 μl에 MspⅠ(Boehringer Manheim Biochemicals, Germany) 0.5 μl (10 U/ μl ), 10x Msp Ⅰ buffer 2 μl, 멸균된 증류수 2.5 μl를 넣 어 20 μl의 혼합물을 잘 섞어주고, 13,000 rpm ( 약 10,000 g) 에서 3~5 초간 원심 분리 하였다. 37 항온수조에서 90 분간 반응한 후 PRA(PCR-RFLP assay) size marker 와 각 효소반응액 (10 μl ) 을 4% metaphor TBE agarose gel(fmc Bioproducts, Maine, USA) 에 점적한 후 100 V에서 60~75 분간 전기영동 탱크에 얼음을 담아 전기영동하였다. Gel을 EtBr로 염색한 후 UV transilluminator로 분절편을 확인하였다. 결과 판독은 mycobacteria 동정 algorithm을 참고하여 균을 동정하였다 (Lee et al. 2000). 5. N i a c i n t e s t 1-2 ml의멸균증류수나식염수를항산균표면에첨가하여배지속에접촉하게하였다 분동안실온에서 ( 또는 37 ) niacin이추출되도록한다음추출물의상층액 0.5 ml를마개가있는깨끗한시험관에옮겨넣고, 0.5 ml의 10% cyanogen bromide 수용액을첨가후 0.5 ml 4% anilin alcohol을넣었다. 실시할때마다양성 (M. tuberculosis) 과음성균주 ( 또는균을접종하지않은배지 ) 를대조시험으로같이실시하였다

19 Table 1. Primer sequences for Mycobacterium tuberculosis(mtb) and nontuberculous mycobacteria(ntm) PCR Primer Sequence(5' 3') Target pr-5 CTC AAG GAG CAC ATC AGC Two-tube nested PCR pr-6 pr-7 TCA TAG GAG CTT CCG ACC CTA CGG TGT TTA CGG TGC CC MTB pr-8 TAG GCG TCG GTG ACA AAG GC PCR-RFLP RPO1 TCA AGG AGA AGC GCT ACG A RPO2 GGA TGT TGA TCA GGG TCT GC NTM - 8 -

20 제 3 장결과 1. 항산성염색양성객담검체의 P C R 객담 검체에서 DNA를 추출한 후, 결핵균과 비정형결핵균을 구분하기 위하여 two-tube nested PCR과 rpob gene의 360 bp부분을 증폭하는 PCR을 시행하였다. 우선, M. tuberculosis complex에 특징적으로 존재하는 IS 6110의 특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을 증폭한 two-tube nested PCR을 시행하였다. 그 결과 MTB는 285 bp 부분에 band를 나타내고 (Fig 1), band가 나타나지 않은 검체는 NTM 검체로 잠정 결론내렸다. 이 후, 잠정 NTM 검체는 mycobacteria에 공통 적으로 존재하는 rpob 유전자 중 일부인 360 bp 부분을 증폭한 후 (Fig 2), Msp Ⅰ을 첨가 PCR-RFLP를 시행하여 NTM 동정결과를 확인할 수 있었다 (Fig 3, Table 2). 항산성 염색 결과가 trace인 48 검체로 PCR을 시행한 결과 MTB가 1, NTM이 0, 음성이 47 검체에서 확인되었고, 항산성 염색 결과가 1+ 인 16 검체에서는 MTB가 5, NTM이 0, 음성인 검체가 11 로 확인되었다. 또한 항산성 염색 결과 가 2+ 인 104 검체에서는 MTB가 100, NTM이 3, 음성 1 검체로 확인되었고, 항 산성 염색 결과가 3+ 인 98 검체에서는 MTB가 96, NTM이 2, 음성인 검체가 0 으로 확인되었다 (Table 3)

21 M N P 2000 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 285 bp 100 bp F i g 1. D e t e c t i o n o f Mycobacterium tuberculousis f r o m a c i d f a s t b a c i l l u s s m e a r - p o s i t i v e s p u t u m s p e c i m e n s b y t w o - t u b e n e s t e d P C R. PCR products were run on a 2% agarose gel stained with ethidium bromide(etbr). Lane M, DNA size marker(bioneer, Alameda, California, USA); lanes 1, 3, 4, M. tuberculousis; lane 2, negative; lane N, negative control, distilled water; lane P, positive control, M. tuberculosis(atcc standard strain)

22 N P M F i g 2. P C R a m p l i f i c a t i o n o f t h e rpob g e n e f r o m a c i d f a s t b a c i l l u s s m e a r - p o s i t i v e s p u t u m s p e c i m e n s. PCR products were run on a 2% agarose gel. Lane M, DNA size marker; lanes 1 5, positive; lane N, negative control, distilled water; lane P, positive control, M. tuberculosis(atcc standard strain)

23 M N P F i g 3. P C R R F L P a n a l y s i s o f a c i d f a s t b a c i l l u s s m e a r - p o s i t i v e s p u t u m s p e c i m e n s. Amplified DNAs were digested with MspⅠ and run on a 4% metaphore agarose gel. Lane M, PCR-RFLP size marker; lane 1, M. intracellulare; lane 2, M. intracellulare; lane 3, M. abscessus; lane 4, M. intracellulare; lane 5, M. abscessus; lane N, negative control, distilled water; lane P, positive control, M. avium

24 Table 2. Isolation of NTM using acid-fast bacillus smear-positive sputum specimens by PCR-RFLP with MspⅠ Specimens No. Identified NTM species PCR product size(bp) DNA fragment size(bp) 1 M. intracellulare , 95, 80 2 M. intracellulare , 95, 80 3 M. abscessus , 95, 80 4 M. intracellulare , 95, 80 5 M. abscessus , 95, 80 c Positive control M. avium 105, 80, 50, 45 c Negative control distilled water

25 Table 3. Detection rate of M. tuberculosis and NTM from the acid-fast bacillus smear-positive sputum specimens using two-tube nested PCR and PCR-RFLP AFB No. of sample MTB NTM Negative D/R(%) -/ Total D/R : Detection rate

26 2. 항산성염색양성검체의배양 항산성 염색 trace 이상인 검체의 순수분리 동정을 위하여 3% Ogawa 배지에 배양을 시행하였다. 항산성 염색 결과가 trace인 48 검체로 배양한 결과 양성인 검체가 47, 음성 인 검체가 1, 항산성 염색 결과가 1+ 인 16 검체에서는 양성이 15, 음성이 1 검체 이며, 항산성 염색 결과가 2+ 인 104 검체에서는 양성이 104, 음성이 0, 항산성 염 색 결과가 3+ 인 98 검체에서는 양성이 98 검체, 음성이 0 으로 확인되었다 (Table 4)

27 Table 4. Colony growth for medium from the acid fast bacillus positive specimen AFB No. of sample Growth Non-growth -/ Total * The culture was performed at 3% Ogawa medium

28 3. 항산성염색양성검체의세균분리배양과정을통한 P C R 항산성염색 trace이상인검체를배양하여분리한세균집락의 DNA를추출하여결핵균과비정형결핵균을구분하기위하여 two-tube nested PCR과 rpob gene의 360 bp부분을증폭하는 PCR을시행하였다. 우선, M. tuberculosis complex에특징적으로존재하는 IS 6110의특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을증폭한 two-tube nested PCR을시행하였다. 그결과 MTB는 285 bp 부분에 band를나타내고 (Fig 4), band가나타나지않은검체는 NTM 검체로결론내렸다. 이후, NTM 검체는 mycobacteria에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp 부분을증폭한후 (Fig 5), MspⅠ을첨가 PCR-RFLP를시행하여 NTM 동정결과를확인할수있었다 (Fig 6, Taable 5). 항산성염색결과가 trace인 48 검체로 PCR을시행한결과 MTB가 40, NTM 이 7, 음성이 1 검체에서확인되었고, 항산성염색결과가 1+ 인 16 검체에서는 MTB가 12, NTM이 3, 음성인검체가 1 으로확인되었다. 또한항산성염색결과가 2+ 인 104 검체에서는 MTB가 100, NTM이 4, 음성 0 검체로확인되었고, 항산성염색결과가 3+ 인 98 검체에서는 MTB가 96, NTM이 2, 음성인검체가 0 으로확인되었다 (Table 6)

29 M N P 2000 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 285 bp F i g 4. D e t e c t i o n o f Mycobacterium tuberculousis f r o m c u l t u r e d c o l o n y o f a c i d - f a s t b a c i l l u s s m e a r - p o s i t i v e s p e c i m e n s b y t w o - t u b e n e s t e d P C R. PCR products were run on a 2% agarose gel. Lane M, DNA size marker; lanes 1, 2, 6, M. tuberculousis; lanes 3, 4, 5, negative; lane N, negative control, distilled water; lane P, positive control, M. tuberculosis(atcc standard strain)

30 N P M F i g 5. P C R a m p l i f i c a t i o n o f t h e rpob g e n e f r o m c u l t u r e d c o l o n y o f a c i d - f a s t b a c i l l u s s m e a r - p o s i t i v e s p e c i m e n s. PCR products were run on a 2% agarose gel. Lane M, DNA size marker; lanes 1 16, positive; lane N, negative control, distilled water; lane P, positive control, M. tuberculosis(atcc standard strain)

31 M N P M F i g 6. P C R R F L P a n a l y s i s u s i n g c u l t u r e d c o l o n y o f a c i d - f a s t b a c i l l u s s m e a r - p o s i t i v e s p e c i m e n s. Amplified DNAs were digested with MspⅠ and run on a 4% metaphore agarose gel. Lanes M, PCR-RFLP size marker, 25/100 bp mixed DNA ladder; lane 1, M. intracellulare; lane 2, M. intracellulare; lane 3, M. abscessus; lane 4, M. intracellulare; lane 5, M. abscessus; lane 6, M. avium; lane N, negative control, distilled water; lane P, positive control, M. avium

32 Table 5. Isolation of NTM species from acid-fast bacillus smear-positive colony specimens using PCR-RFLP with MspⅠ Specimens No. Identified NTM species PCR product size(bp) DNA fragment size(bp) 1 M. intracellulare , 95, 80 2 M. terrae , 62, 57 3 M. avium, 105, 80, 50, intracellulare 175, 95, 80 4 M. gordonae type Ⅰ , 95, 45 5 M. abscessus , 95, 80 6 M. avium , 80, 50, 45 7 M. avium , 80, 50, 45 8 M. intracellulare , 95, 80 9 M. abscessus , 95, M. fortuitum Ⅱ , 105, M. fortuitum Ⅱ , 105, M. intracellulare , 95, M. intracellulare , 95, M. abscessus , 95, M. intracellulare , 95, M. abscessus , 95, 80 c Positive control M. avium 105, 80, 50, 45 c Negative control distilled water

33 Table 6. Detection rate of M. tuberculosis and NTM from colony of the acid-fast bacillus smear-positive specimens using two-tube nested PCR and PCR-RFLP AFB No. of sputum specimens MTB NTM Negative D/R(%) -/ Total D/R : Detection rate

34 4. 항산성염색양성검체의세균분리배양후 n i a c i n t e s t 항산성염색 trace 이상인검체의순수분리동정을위하여 3% Ogawa 배지의배양을통해확인된세균집락에 niacin test를실시하여 MTB 검체를분리하였다. 세균분리배양후 MTB를확인하기위해서 niacin test를실시한결과항산성염색 trace인경우집락 (colony) 이양성인 47 검체중 40 검체, 1+ 인경우 colony 가양성인 15 검체중 12 검체, 2+ 인경우 colony가양성인 104 검체중 100 검체, 3+ 인경우 colony가양성인 98 검체중 96 검체가 niacin test 양성임을확인할수있었다 (Table 7)

35 Table 7. Niacin test of acid-fast bacillus smear-positive colony specimens AFB Culture positives Niacin test Niacin test positives Negatives -/ Total

36 5. P C R - R F L P 를이용한비정형결핵균의동정 객담 검체에서 추출한 D N A 를 이용한 비정형 결핵균의 동정 항산성염색 trace이상인객담검체의 DNA를추출하여 mycobacteria에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp를증폭하였다 (Fig 2). MspⅠ을첨가한후, PCR-RFLP를이용한다양한크기의절편은이전의연구를통하여밝혀진바있는 algorithm을이용하여비정형결핵균동정을확인할수있었다 (Fig 3, Table 2)

37 5. 2. 세균분리배양집락에서추출한 D N A 를이용한비정형 결핵균의 동정 항산성염색 trace이상인검체를배양한후, 집락 (colony) 의 DNA를추출하여 mycobacteria에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp를증폭하였다 (Fig 5). MspⅠ을첨가한후, PCR-RFLP를이용한다양한크기의절편은이전의연구를통하여밝혀진바있는 algorithm을이용하여비정형결핵균동정을확인할수있었다 (Fig 6, Table 5)

38 제 4 장고찰 항산균염색을이용한객담도말검사는결핵균과비정형결핵균을구별할수없다는제한점이있고 (American Thoracic Society 2000), 균분리배양검사는시간이오래걸린다는단점이있어, 본연구에서는이러한제한점을가진기존의검사법을대신하여요즈음사용되고있는분자생물학적방법인 PCR을이용하여세균분리배양검사와비교하여보았다. 실험에서항산성세균염색이 2+ 이상인객담검체와집락검체각각에서 DNA를추출하여 MTB를동정하는방법으로 M. tuberculosis complex에특징적으로존재하는 IS 6110의특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을증폭한 two-tube nested polymerase chain reaction을시행하였고, NTM 동정법으로는 mycobacteria에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp 부분을증폭한후, 제한효소 MspⅠ을첨가 PCR-RFLP를시행한결과, MTB와 NTM 동정률에거의차이가없었다. 반면 1+ 인경우는객담검체에서 PCR한결과가 31.2% 에서집락검체의 PCR한결과 93.7% 까지 MTB와 NTM의동정률이높아졌고, trace인경우객담검체의 PCR 결과가 2% 에서집락검체의 PCR한결과 97.9% 까지 MTB와 NTM의동정률을높일수있었다. 이것으로항산성세균염색 2+ 이상일때는객담검체와집락검체의 PCR 결과에서 MTB와 NTM의동정에별차이가없으며, 1+ 이하일경우는 MTB와 NTM의동정에차이가있음을알수있다 (Fig. 7). 세균분리배양검사결과항산성균양성 266 검체중 264 검체가집락을형성하였으며, 항산성세균염색 trace와 1+ 검체에서는각각 1개씩배양되지않았다. 이는객담검체에서 DNA를추출하여 PCR한것과배양을통해집락의 DNA를추출하여 PCR한것어느곳에도동정되지않은것으로원인이규명되지않은문제점으로남아있다 (Table 4). 세균분리배양후 MTB를확인하기위해서 niacin test를실시한결과항산성

39 염색 trace인경우 40 검체, 1+ 인경우 12 검체, 2+ 인경우 100 검체, 3+ 인경우 96 검체가 niacin test 양성임을확인할수있었으며 (Table 7), 이결과와집락의 DNA를추출하여 PCR한 MTB가일치함을확인할수있었다. 여기서는다양한종류의 NTM 검체가발견되었는데, 우선객담검체에서 DNA를추출하여 PCR-RFLP를이용하여 M. intracellulare와 M. abscessus가동정되었으며, 배양을통해집락의 DNA를추출하여 PCR-RFLP를이용한것에는 M. intracellulare, M terrae, M. avium, M. gordonae type Ⅰ, M. abscessus, M. fortuitum Ⅱ 등이동정되었다. 또한객담검체에서 DNA를추출하여 PCR-RFLP를이용하여동정된 NTM의항산성염색의강도는 2+ 이상에서나타남을확인할수있고, 배양을통해집락의 DNA를추출하여 PCR-RFLP로동정된 NTM은항산성세균염색의강도와는무관했다. Mycobacteria에는약 70 여종이있으며이중일부는폐결핵, 피부와연조직감염, 림프절감염, 파종성 ( 산재성 ) 감염을일으키고있어정확한동정이요구되고있다 (Vareldzis et al. 1994; Wolinsky et al. 1992). 이번실험에서동정된 NTM 균중 M. abscessus는신속발육균에속하며병원성이강한것으로보고되어있다 (Metchock et al. 1999). 국내에서도면역저하환자의증가에따라 M. abscessus 에의한감염이증가하고있으며, M. abscessus에의한감염의경우대부분의항결핵제에내성을나타내고, 종내에서도항균제감수성이달라일반적으로항균제감수성이요구된다. 최근에는연부조직감염에서진행하여균혈증을보인환자의검체를포함하여피부조직과객담, 혈액등으로부터 M. abscessus를분리동정하여감염경로와경과, 치료, 및세균의특성에대하여보고된바도있다 ( 김정현외 2004). 이에세균분리배양을하는데있어신속발육균이 MTB 검체에섞일수있으므로배양기간을 6주이상충분히둔후, MTB와 NTM 동정을병행하는것이최선의방법일것이다. 하지만이방법을모두사용하기에는비용면에서경제적이지않으므로앞으로생각해볼문제이기도하다. 또한항산성염색 trace 이상의양성 266 검체를임의로추출한것임으로 MTB와 NTM의분리빈도에따른통계처리를나타내는데실험에사용된전체검체수의부족한문제점이있으며, 동정된 16 개의 NTM 검체역시발병률이높은 NTM 검체를나타내는데적절하지

40 못한 문제점이 있다. 그러므로 좀 더 많은 수의 비교실험이 지속적으로 연구되어 야 할 것이다. 이 실험에서 항산성균 염색 1+ 이하 일때 객담검체와 집락검체로 PCR을 실 시하면 결핵균과 비정형 결핵균의 동정률에 차이가 있고, 배양만으로는 결핵균의 동정은 가능하지만 비정형 결핵균의 동정이 가능하지 않으므로 배양검사와 PCR 검사 모두를 병행하므로써 보다 신속하고 정확한 검사결과를 내는데 도움될 것이 다

41 (%) Detection rate of m ycobacteria / (AFB. stain) Detection of MTB and NTM from sputum specim ens Detection of MTB and NTM from colony specimens F i g. 7. T h e g r a p h p r e s e n t s d e t e c t i o n r a t e o f m y c o b a c t e r i a f r o m s p u t u m a n d c u l t u r e d c o l o n y o f a c i d f a s t b a c i l l u s s m e a r - p o s i t i v e s p e c i m e n s b y t w o - t u b e n e s t e d P C R a n d P C R - R F L P

42 제 5 장결론 결핵 (MTB) 감염은아직까지전세계에서높은유병률과사망의주요원인이되고있으며비정형결핵 (NTM) 은최근후천성면역결핍증 (AIDS) 이나, 종양, 이식등으로면역력이저하된환자들의임상검체에서분리빈도가증가함에따라분리균주의임상적의의가중요시되고있다. 이에본실험에서는객담검체와배양한집락검체를이용하여 PCR과균분리배양검사를비교하여보았다. 검사방법으로배양, niacin test, PCR을이용하였다. PCR은결핵균을동정하는방법으로 M. tuberculosis complex에특징적으로존재하는 IS 6110의특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을증폭한 two-tube nested PCR과비정형결핵균을동정하는방법으로 mycobacteria에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp 부분을증폭한후, 제한효소 MspⅠ을첨가 PCR-RFLP을시행하였다. 항산성세균염색 2+ 이상일때객담과집락검체모두 MTB와 NTM의동정에거의차이가없었으며, 1+ 일때객담검체 31.2% 에서집락검체 93.7% 로 MTB와 NTM의동정률이높아졌고, trace일경우객담검체 2% 에서집락검체 97.9% 까지 MTB와 NTM의동정률이향상되었다. 그러므로항산성균염색 1+ 이하일때객담검체와집락검체로 PCR을실시하면결핵균과비정형결핵균의동정률에차이가있고, 배양만으로는결핵균의동정은가능하지만비정형결핵균의동정이가능하지않으므로배양검사와 PCR 검사모두를병행하므로써보다신속하고정확한검사결과를내는데도움될것이다

43 참고문헌 American Thoracic Society Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adult and children. Am J Respir Crit Care Med 161: Falkinham, JO Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin Microbiol Rev, 9: Grosset J, Vareldzis BP, Kantor ID, Crofton J, Laszlo A, Felten M Drug resistant tuberculosis : Laboratory issues(world Health Organization recommendations). Tubercle Lung Dis, 75: 1-7. Horburgh CR Jr Mycobacterium avium complex infection in the acquired immunodeficiency syndrome. N Engl J Med, 324: Ingram CW, Tanner DC, Durack DT, Kernodle W, Corey GR Disseminated infection with rapidly growing mycobacteria. Clin Infect Dis, 16: Kennedy MP, O'Conor TM, Ryan C, Sheehan S, Cryan B, Bredin C Nontuberculous mycobacteria: incidence in Southwest Ireland from 1987 to Respir Med, 97: Lee HY, Park HJ, Cho SN, Bai GH, Kim SJ Specific identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the

44 rpob gene. J Clin Microbiol, 37: Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ, Jr Chapter 25. Mycobacterium. In:Patrick RM, Ellen JB, Michael AP, Fred CT, Robert HY, editor. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington: ASM press, Sakatani M Nontuberculous mycobacteriosis; the present status of epidemiology and clinical studies. Kekkaku, 74: Wolinsky E Mycobacterial disease other than tuberculosis. Clin Infect Dis, 15: 김상재, 박영길, 조상현, 심명섭 핵산중합연쇄반응에의한병리검체내결핵 균의검출. Ⅰ. Primers 선택과반응조건. 대한미생물학회지, 27(1): 김연숙, 홍일철, 김춘관, 김신우, 김성민, 백경란 Mycobacterium abscessus 에의한피부및연부조직감염 1 예. 감염, 32: 김정현, 최원호, 강정옥, 최태열 대한임상미생물학회지, 7(1): 심영수 비결핵마이코박테리움증. In; 천효영. 결핵. 4 판. 서울 : 고려의학, 이건섭, 김승곤, 김신무, 정경석, 김영권, 정태화, 오흥백 진단병원미생물학. 서울 : 고려의학. 이효원, 김미나, 심태선, 배길한, 배직현 면역적격자에서비결핵마이코박테리

45 아의폐감염. 결핵및호흡기질환, 53: 임재준, 오명돈, 유철구, 송영욱, 김영환, 서정욱등 전신성홍반성낭창환 자에서발생한 Mycobacterium abscessus 에의한폐렴 1 예. 결핵및호흡기 질환, 46:

46 A b s t r a c t I d e n t i f i c a t i o n a n d s e n s i t i v i t y c o m p a r i s i o n o f m y c o b a c t e r i a u s i n g p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a n d s p u t u m s p e c i m e n Lee, Jung Min Dept. of Biomedical Life Science The Graduate School of Health and Environment Yonsei University Although Mycobacterium tuberculosis complex strains remain responsible for the majority of diseases caused by mycobacterial infections worldwide, the increase in HIV(human immuno deficiency virus) infections resulted in the emergence of other non-tuberculous mycobacteria as clinically significant pathogens. In this study, M. tuberculosis was detected by two-tube nested polymerase chain reaction(pcr) and non-tuberculous mycobacteria was detected by PCR-restriction fragment length polymorphism(rflp) with MspⅠ. The two-tube nested PCR results were confirmed by niacin test after culture for M. tuberculosis. For acid-fast stain > 2+ case, detection of mycobacteria was similar for both sputum and cultured colony specimens. However, it was different for acid-fast stain < 1+ case. In conclusion, it is necessary to use both culture and PCR tests for the faster and more accurate mycobacteria identification

47 Key words: Mycobacterium tuberculosis, nontuberculous mycobacteria, acid-fast stain, culture, polymerase chain reaction, PCR-restriction fragment length polymorphism, restriction enzyme MspⅠ