임상병리검사과학회지 : 제 28 권제 1 호 임상가검물에서 Nested-PCR 과 PCR - dot blot 법을 이용한결핵균검출의비교 서울의과학연구소 서울임상병리검사센터 (SCL) 이성수 검미영 박영석 Comparison of Nested-PCR with

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희원 갈
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1 임상병리검사과학회지 : 제 28 권제 1 호 임상가검물에서 Nested-PCR 과 PCR - dot blot 법을 이용한결핵균검출의비교 서울의과학연구소 서울임상병리검사센터 (SCL) 이성수 검미영 박영석 Comparison of Nested-PCR with PCR-Dot Blot for the Detection of Mycobacierium tuberculosis in Clinical Samples Lee, Seong-Soo, Kim, Mi-Young, Park, Young-Suk Seoul Mediclll Scienæ Institute Seoul Cliniclll Lllboratories( SCL) The polymerase chain reaction (PCR) technique has widely been used in the direct diagnosis of Mycobacterium tuberculosis(m. tuberculosis) from variety of clinical samples. Recently, with development of molecular biological techniques, several PCR methods, in cluding nested - PCR, PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) and PCR-dot blot hybridization, have been applied for the clinical diagnosis of M. tuberculosis. 1n this study, we evaluated the sensitivity of nested - PCR in comparison with the PCR-dot blot for the determination of M. tuberculosis. Two pairs of primers for nested - PCR were designed from 1S6110 locus of M. tuberculosis. Biotin labeled probe designed in the inner area of PCR product was used for PCR-dot hybridization. 1n a total of 59 sputum samples, thirty five samples (59.3 %) were positive in nested - PCR. On the other hand, fifteen samples (25.4 %) were positive by PCR - dot blot analysis. From the results, nested - PCR is a more simple, cost effective and sensitive method for the detec tion of M. tuberculosis than PCR - dot blot analysis. Key words : Mvcobacterium tubercu/osis, nested - PCR, PCR - dot blot 1. 서료르 중합효소연쇄반응 (PCR) 이임상실험실의 진단목적으로사용되기시작한것은불과수 L- 년내의일이나그방법의개발과활용도는과 거의어떤방법보다급진전하고있다 ) 특히항원이나항체를간접적인방법 25) 으로검 출하던감염증분야에서 PCR 의활용은확고 - 80-

2 한실험실적진단방법으로자리잡고있다. 최 근에는분자생물학기술의신속한발전과아울 러장비의개발로, PCR 원리를이용한보다 신속하고정밀한검사방법이계속개발되고 있다. 따라서단순한 PCR 방법을이용한분석 보다는검사의목적에따라 PCR-RFLP, nested - PCR, PCR - dot blot 등임상실험실 에서각종병원미생물을검출하는방법에대하여많은보고가이루어지고있다 6-9) 저자 들은결핵균, Chlamydia, C 형간염등임상미 생물분야에서 PCR 검사법의유용성에관하 여보고하여왔다 ) 특히객담에서 1 차 PCR 법을이용한결핵균의검출을결핵균배 양법과비교하여 PCR 의우수성을증명하였으 며, 소변, 척수액등결핵균수가적게분포할 가능성이있는각종체액에서 1 차 PCR 방법 2. 실험방법 1) Primer 및 probe 의합성 결핵균 DNA 의증폭을위한 PCR primer 는 M. tuberculosis 의특이적인부위로알려진 염 기서열에서설정하였다. 1 차 PCR 을위한 pnmer 로는 TB 1( 이, TB2( ) 를사용하 였으며, nested - PCR 을위한 pnmer 로는 TB3 ( ), TB4( ) 를사용하였다 24) PCR - dot blot 에서사용한 probe 는 PCR 산물의 내측에위치하는 TB5( ) 를사용하였다. 본실험에서사용된 pnmer 및 probe 의합성은 392 DNA/RNA 합성기 (Applied Biosystem, U. 8. A.) 를이용하여합성하였다. 2) DNA 추출 과 nested-pcr 방법을비교하여 nested- DNA 는 proteinase K 와 phenol/ chlorof orm 을 PCR 방법의유용성을입증한바있다 2) 최근이용하여추출하였다. 점성이높은객담을 4N PCR 을이용한병원균의검출에있어서상품 NaOH 와동량혼합하여점도를저하시킨후 3, 화된 kit 에서는 PCR - dot blot 방법이많이응 용되고있으므로, 저자들은결핵균검출률에 있어서 nested-pcr 과 PCR - dot blot 방법간 의예민도및정확성을비교하기위하여, 1 차 PCR 을시행한뒤얻어진산물을재증폭하는 nested-pcr 방법과 l 차 PCR 을시행한후 화학형광발광물질로표식한 DNA probe 로 교잡을하는 PCR - dot blot 방법을 59 예의 임상검체로동시에시행하여, 비교분석한후 유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 1. 실험재료 II. 실험재료및방법 결핵균표준균주로는 M. tuberculosis( A TCC 27294) 를사용하였으며, 임상검체로는결핵으 로의심되는환자의객담으로서본원에의뢰된 59 예를대상으로하였다. 800 rpm 에서원심분리하였다. 상충액을제거 HCl ph 7.5, 1 mm EDTA, 1 % Triton X- 100) 200 띠에부유시킨후 proteinase K 를최 종농도가 400 명 Iml 되도록혼합하였다 C 에서 1 시간반응시킨후 phenol/ chlorof orm 을 동량넣은다음 1 분간혼합하여 12,000 rpm 에 서 10 분간원심분리한후상충액을취해 chloroform 을동량넣고 12,000 rpm 에서 10 분 간원심분리하였다. 원심분리후상충액을취 하여최종농도 0.2 M sodium acetate 와 2 배 부피의 100% 에탄올을넣어혼합하였다. -20 에서 1 시간이상방치한후 18,000 rpm 에서 20 분간원심분리하여침전물을 70% 에탄올에 세척하고건조시켰다. 건조된침전물은 TE buffer(tris EDTA, ph 7.6) 에재용해시키고 이중일부를 PCR 반응에서주형으로사용하 였다 15) 3) 중합효소연쇄반웅및전기영동 PCR 반응액조성은다음과같다. 총부피 20 한침전물을세포완충용액 (50 mm Tris -81-

3 t1l 에 10 x buffer(50 mm KCl, 10 mm Tris HCl ph 8.8, 1.5 mm MgClz, 0.1 % Triton X- 100), 0.5 unit Taq DNA polymerase, 0.2 mm dntp, 20 pmol primer 와주형을넣었다. 1 차 PCR 에서는 DNA 추출물중에서 5 띠를주형으 로사용하였고 nested-pcr 에서는 1 차 PCR 산물중에서 1 띠를주형으로이용하였다. 1 차 PCR 반응은 95 0 C 에서 3 분간가열한후 94 0 C 에 서 denaturation 1. 5 분, 62 0 C 에서 annealing 1.5 분, 72t 에서 extension 2 분을 1 주기로하여 35 회반복하였고 nested-pcr 에서는 95 0 C 에서 3 분간가열한후 94 0 C 에서 1 분, 68 0 C 에서 l 분, 72 0 C 에서 1 분을 1 주기로하여 28 회를 자동 thermal cycler( GeneAmp PCR system 9600, Perkin Elmer Cetus 1nc.) 를이용하여실 행하였다. PCR 을시행한후반응의확인을위 하여증폭된 DNA 에 6 x loading buffer(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15 % Ficoll 400 ) 를넣어 2 % agarose gel 에서 전기영동을한후 ethidium bromide 로염색하 여 UV 상에서 PCR 에의해증폭된 DNA 를확 인하였다 23) 4) PCR 산물의제한효소분석 PCR 산물의결핵균특이성을확인하기위하여 nested-pcr 산물 10 띠에제한효소 (Asu I, Hhal) 10 unit 를넣은후 3TC 에서 6 시간이상 반응시키고, 12% polyacrylamide gel 에서전기 영동을하여증폭된 DNA 단편을분석하였다. 5) PCR - dot blot CD Nylon membrane 상에 DNA 고정 1 차 PCR 산물을알칼리변성 (0.4 M NaOH, 10 mm EDTA) 한후, 냉장보관된 2M ammonium acetate(ph 7.0) 를넣은다음 dot blotter(bio-rad, Bio-Dot Microfiltration Apparatus, U.S.A.) 를이용하여 nylon membrane 상 에 DNA 를옮긴후 80 0 C 에서 2 시간동안건 Hybridization Biotin 으로표식한 probe( 50 ng/ml) 를 95 0 C 에서 10 분간변성시켜 hybridiza tion 용액 (1 mm EDT A, 7 % SDS, 0.25 M disodium phosphate ph 7.2, 5% dextran sulfate) 과혼 합한후 hybridizer(techne Ltd., U. K.) 를이 용하여 65 0 C 에서 2 시간동안 hybridiza tion 하 였다. Hybridization 과정을거친 membrane 을 실온에서 2 x SSC( 0.3 M sodium chloride, O. 03 M sodium citrate dihydrate ph 7.0), 1.0% SDS 로세척하고 65 0 C 에서 1 x SSC, 1 % SDS 로세척한후다시실온에서 1 x SSC 로세척 하였다 화학형광발광물질의검출 Hybridization 한 membrane 을 blocking 완충 액 (0.2 % 1 - Block reagent, 1X PBS, 0.5% SDS) 으로세척한다음 blocking 완충액에 AVIDx- AP(Tropix, 1nc. Massachusetts, U.S. A.) 를 1 : 5, 000 으로희석한용액에 20 분간섞 어준후 blocking 완충액, 세척완충액 (1 x PBS, 0.5 % SDS), assay 완충액 (0.1 M diethanolamine, 1 mm MgC1 2 ) 으로각각 2 회씩세 척한다음 membrane 을화학형광발광기질액 (0.1 M diethanolamine, 1 mm MgClz, 0.25 mm CSPD ; Tropix, Inc. Massachusetts, U. S. A. ) 으로골고루섞어주었다. 모든과정이끝난 membrane 은건조되지않게 plastic wrap 에싸 서 X-ray 필름상에 20 분간노출시킨후현 상하였다 11, 13) 1. PCR 의특이도 m. 실험성적 본실험에사용된 1S6110 primer 의특이도를 보기위하여사용한결핵성항산균표준균주중 M. tuberculosis(atcc 27294) 를사용하여 1 차 PCR 에서 324 bp, nested - PCR 에서는 239 bp 의 특이한 DNA band 를확인할수있었다 (Fig. 1)

M 1 2 3 4 M I 2 Fig. 1. Identification of M. tuberculosis by specific Fig. 2. DNA fragments of nested - PCR digested primer based on IS6110 by Asu! and Hha!

tuberculosis infected M : Molecular standard marker(phix174/hae m) cells(324 bp) Lane 2 : First PCR negative control Lane 3 : Nested - PCR of M.

4 M M I 2 Fig. 1. Identification of M. tuberculosis by specific Fig. 2. DNA fragments of nested - PCR digested primer based on IS6110 by Asu! and Hha! restriction enzymes on 12 % M : DNA size marker (PhiX174/Hae m ) polyacrylamide gel electrophoresis. Lane 1: First PCR of M. tuberculosis infected M : Molecular standard marker(phix174/hae m) cells(324 bp) Lane 2 : First PCR negative control Lane 3 : Nested - PCR of M. tuberculosis infected cells(239 bp) Lane 4 : Nested - PCR negative control. Lane 1 : DNA fragment of nested-pcr product digested with Asu!(1 10, 59, 46, 24 bp) Lane 2: DNA fragment of nested - PCR product digested with Hha!(1 85, 54 bp) 2. 제한효소를이용한 PCR 산물의확인였다 (Table 1). 따라서 nested-pcr 은 PCRdot blot 보다 2 배 이상의양성률을나타내어 내의염기서열의증폭을확인하기위매우높은민감도를가지고있는것으로나타해 nested-pcr 산물을제한효소 Asul과났다. Hh a! 으로절단한결과 AsuI' 에의해서는 4 개의서로다른 DNA 절편 (1 10, 59, 46, 24 bp) 을나 T able 1. Comparison of detection of M. tuberculosis 타내었고, 제한효소 Hh a/' 에의해서는 2 개의 in 59 specimens by nested - PCR and PCR - dot blot Detection rate of M. tuberculosis nested-pcr PCR - dot blot Positive rate(%) 35/59(59.3%) 15/59(25.4%) Negative rate(%) 24/59(40.7%) 44/59 (74.6%) DNA 절편 (1 85, 54 bp) 을 나타내어 결핵균 에 특이한 PCR 산물임을 확인하였다 (Fig. 2). 3. 임상 검체에서으 I nested - PCR 과 PCRdot blot 결과의비교 총 59 예의임상검체중 nested-pcr에서는 35 예에서양성을나타내어 59.3% 의양성률을보였다. 한편, PCR - dot blot의경우 15 예에서양성을나타내어 25.4% 의양성률을보 N. 고찰 1988 년 8ail 이등에의해서처음으로소개된 중합효소연쇄반응은 DNA 염기서열중원 - 83-

하는어느특정한부위를수백만배이상증폭에많은검체를검사할수있다는장점이있으 시켜증폭된산물을전기영동에의하여확인할나, 실험과정을수행하는데있어검사과정이 수있는분자생물학적기법으로서, 분자생물학 의발전에많은진전을가져왔을뿐만아니라, 이를임상적으로활용함에따라질병진단에 많은응용이시도되고있다 10, 13, 14) 본연구에서 는결핵균의신속하고정확한검출을위하여 nested-pcr

5 하는어느특정한부위를수백만배이상증폭에많은검체를검사할수있다는장점이있으 시켜증폭된산물을전기영동에의하여확인할나, 실험과정을수행하는데있어검사과정이 수있는분자생물학적기법으로서, 분자생물학 의발전에많은진전을가져왔을뿐만아니라, 이를임상적으로활용함에따라질병진단에 많은응용이시도되고있다 10, 13, 14) 본연구에서 는결핵균의신속하고정확한검출을위하여 nested-pcr 방법과 PCR - dot blot 방법으로, 동시에동일한검체 59 예로실험을실시하여 예민도와정확성을분석하였다. 먼저 nested PCR 은기존의 1 차 PCR 을보완한방법으로서, 임상검체에서 DNA를추출한후결핵균내의특이적인부위로알려진 IS6110의 위치에서 1 차 PCR을실시하고, 다시그내부 의 위치에서 1 차 PCR 산물을주형 으로이용하여 nested-pcr 을실시하였다 19) 그결과, nested - PCR 에서 59.3% 의양성률을 나타내었다 (Table 1). Nested-PCR 로증폭된 결핵균 DNA 의확인을위하여중합효소연쇄 반응 - 제한효소절펀다형성 (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphisms : PCR - RFLP) 을이용하여분석하였다. 증폭된 PCR 산물에두가지제한효소, AsuI 과 Hhal 을처리하여반응한후잘라진 DNA 단편의길이를 12 % polyacrylamide gel 을이용 하여분석한결과, 결핵균에특이한 PCR 증폭 산물임이확인되었다 (Fig. 2). 다음으로, PCR - dot blot 방법의원리는특 정한 DNA 염기서열을방사선동위원소나형 광화학발광물질둥으로표식한 DNA probe 를이용하여병원체의 DNA 또는 RNA 를검출 할수있는방법으로서 l6l7), 본실험에서결핵 균 PCR - dot blot 을시행하는데필요한주형은 1 차 PCR 산물을이용하였고, probe 는 PCR 산 물내의염기서열을이용하였으며, 형광화학 발광물질인 biotin 으로 probe 를표식하여 PCR -dot blot 을실시하였다. PCR - dot blot 을실 행한결과 25.4% 의양성률을나타내어 nested - PCR (59.3%) 보다낮은양성률을나타내었 r:t (Table 1). PCR-dot blot 의경우에는한번 복잡하고, 많은시간이소모되며, 시약조제의 번거로움등의단점이있다. 이에비해 nested -PCR 의경우방법이간단하며, 신속한검사가 가능하고결과의판독이용이하다는장점을가 지고있다. 이상의결과로볼때, nested - PCR 방법은 1 차 PCR 방법이나 PCR - dot blot 에비 하여신속하고정확한진단이가능하므로임상 검사실에서매우잘활용할수있을것으로사 료된다. v. 결론 본실험에서는결핵균의검출을위하여 nested-pcr 과 PCR - dot blot 을동시에시행하였 으며, 각각의민감도를비교분석하여다음과 같은결과를얻었다. 1) 총 59 예의 nested-pcr 을실시하여서 239 bp 의 DNA 단편을확인할수있었으 며, 35 예 (59.3% ) 가양성으로나타났다. 2) 화학발광물질을이용한 PCR - dot blot 에서는총 59 예중 15 예 (25.4% ) 에서양 성을나타내어, PCR - dot blot 보다는 nested-pcr 에서약 2 배이상의양성률 을보였다. 본실험의결과, 임상검체의결핵균동정을 위해서는신속하고민감도가높은 nested PCR 방법이유용하다는것을알수있었다. 나 아가균수가적은뇌척수액, 소변등각종체액 에서도 PCR - dot blot 방법보다효과적으로활 용될수있으리라사료된다. REFERENCES 1. 김미영, 이무주, 최철석 : 질내가검물및소 변에서 nested-pcr 을이용한 Chlamydia trachomatis 의검출. 대한임상병리학회. 추계 학술대회 김미영, 이무주, 최철석, 이경옥 : 체액에서 - 84-

6 nested-pcr 을이용한결핵균검출에관한 고찰. 임상병리검사과학회지 27 : , 박남일, 김법완 : 이중중합효소연쇄반응 을이용한요중결핵균핵산검사. 뇨기과학회지 5 : , 대한비 4. 서상철, 은상진, 김한길, 송경은, 서장수, 최 성만, 이원길, 김재식, 김중명 : 결핵의진단 법으로서중합효소연쇄반응의가치. 북의대지 35 : 14-35, 윤경한, 이태윤, 조상래, 김득순, 정동현, 김 주덕 : 가검물내결핵균검출에있어서 DNA 분리방법에따른중합효소연쇄반 옹의민감도비교. 대한미생물학회지 26 : , 이무주, 김미영 : 자궁경부세포에서 nested-pcr 을이용한 human papilloma virus 의측정. 대한임상병리학회. 추계학술대회 최철석, 김은아, 이경옥 : 임상가검물에서 중합효소연쇄반응을이용한결핵균진단 의평가. 대한미생물학회지 28 : , 최철석, 이경옥, 이규범 : PCR 을이용한결 핵균진단에있어서효과적인 DNA 추출 법. 대한미생물학회지 29 : , 최철석, 김은아, 이경옥, 이규범, 이연태 : 임상혈청에서중합효소연쇄반응을이용 한 HCV-RNA 의측정. 대한바이러스학회 지 24:87-92, Brisson NA, Aznar C, Chureau C, Nguyen S. Pierre C. Bartoli M. Bonete R. Pialoux G, Gicquel B and Garriqe G. : Diagnosis of tuberculosis by DNA amplification in clini cal practice evaluation. Lancet 338 : Bronstein 1 and McGrath P. Chemiluminesce light up. Nature 338: , Bronstein 1, Voyta JC, Lazzari KG, Murphy 경 0, Edwards B and Kricka LJ. : Rapid and sensitivity detection of DNA in southern blots with chemiluminescence. BioTechniques 8 : , Cousins DV, Wilton SD, Francis BR and Gow BL. : Use of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 30 : , Hong YK.: Epidermiology of tuberculosis - result of study in Korea. J Kor Med Assoc. 34 : , Kirby KS. : Isolation of nucleic acids with phenolic solvents. In: Gross man L and maldave K (Ed). Methods in enzymology. Academic press, London. 16. Kreike CM, de Konin JRA and Krens F A. : Nonradioactive detection of singlecopy DNA - DNA hybrids. Plant Mol Biol Reporter 8(3) : , Lanzillo. : Preparation of digoxigenin -labeled probes by polymerase chain reaction. BioTechniques 8 : , Leary JJ, Bridgati DJ and Ward DC.: Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin -labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-Blots. Pro. Natl. Acad. Sci. (USA) 80 : , Miyazaki Y, Koga H, Kohno S and Kaku M. : Nested polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. J Clin Microbiol. 31: , Pao CC, Y ou JB, Maa JS, Fiss EH and Chang CH.: Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA amplification. J Clin Microbiol. 28: , Sail 이 RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT and Erlich H. : Primer di

7 rected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239 : , Shankar P, Manjunath N, Mohan KK, Prasad K, Behari M, Shriniwas and Ahuja GK.: Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction. Lancet 337 : 5-7, Southern EM. : Detection specific sequence among DNA fragments segregated by gel electrophoresis. J Mol Bio. 98 : Thierry D, Brisson NA, Vincent LF, Ngu yen S and Guesdon JL. : Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS and its application in diagnosis. J Clin Microbiol. 28: , Yanez MA, Coppola MP, Russo DA, Delaha E, Chaparas SD and Yeager H Jr. : Determination of mycobacterial antigens in sputum by enzyme immunoassay. J Clin Microbiol. 23 : ,

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