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규한 기
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1 ORIGINAL ARTICLE Korean J Clin Lab Sci. 2015, 47(2): pissn eissn Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 2, Jun Identification of Mycobacteria Using Polymerase Chain Reaction and Sputum Sample Hyung Seok Jang Department of Pathology, Hanyang University Medical Center, Seoul , Korea 객담을이용한 Mycobacteria 의검출과중합효소연쇄반응의민감성비교 장형석 한양대학교서울병원병리과 Although Mycobacterium tuberculosis complex strains remain responsible for the majority of diseases caused by mycobacterial infections worldwide, the increase in HIV (human immuno deficiency virus) infections has allowed for the emergence of other non-tuberculous mycobacteria as clinically significant pathogens. M. tuberculosis was detected by two-tube nested polymerase chain reaction (PCR) and non-tuberculous mycobacteria was detected by PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) with Msp I. Result of niacin test is equal to result of two-tube nested PCR after culture for M. tuberculosis. In this study, acid fast bacilli stain (AFB. stain) >2+ case, Detection of Mycobacteria is similar to result before culture and after culture. AFB. stain <1+ case, result of mycobacteria is distinguished. Conclusionly, these results suggest that identification of mycobacteria must go side by side both culture and PCR for more fast and accuracy. Keywords: Mycobacterium tuberculosis, nontuberculous mycobacteria, acid fast bacilli stain, Polymerase chain reaction, PCR-restriction fragment length polymorphism Corresponding author: Hyung Seok Jang Department of Pathology, Hanyang University Medical Center, Seoul , Korea Tel: himylife@hanmail.net This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright 2015 The Korean Society for Clinical Laboratory Science. All rights reserved. Received: March 20, 2015 Revised: None Accepted: April 9, 2015 서론항산성균 (Mycobacterium) 은 acid fast bacilli (AFB) 라고도하며보통염색으로는쉽게염색되지않으며가온하여일단염색이되면산이나, 알코올, 알카리에강하고탈색이되지않는성질을가지고있으므로항산성 (acid fastness) 또는항산성균 (AFB) 이라고한다. 항산성균중에는 Mycobacterium 균속인 Mycobacterium tubersulosis ( 결핵균 ), Mycobacterium leprae ( 나균 ), atypical mycobacteria ( 비정형결핵균 ) 과약한항산성균으로 Nocardia, Gordona, Tsukamurella 및 Rhodococcus가있다. 결핵감염은아직까지전세계에서높은유병률과사망의주요원인이되고있으며, 이중결핵균 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 은비말에의해전파되며흡입된소수의균이폐포표면에부착되면폐포큰포식세포에의해탐식되어증식하기시작한다. 감염후숙주내의정상면역력을가진개체이면활성화된 T 림프구와큰포식세포가주축이되는세포개재면역이발현된다. 그결과 tuberculin 양성이되고균이증식하고있는허파조직이반고형의괴사, 즉건락괴사가일어나그속의균들이대식구로부터유리된다. 반고형의치즈괴사병변이연화되어액화하면기관지로결핵균

2 84 Hyung Seok Jang. Identification of Mycobacteria Using Polymerase Chain Reaction and Sputum Sample 이배출되면서결핵의증상이나타난다. 또한비결핵 mycobacteria (nontuberculous mycobacteria, NTM) 는최근임상검체에서분리빈도가증가함에따라분리균주의임상적의의도중요시되고있다 (Falkinham J.O. 1996; Kennedy et al. 2003) (Sakatani M. 1999). 후천성면역결핍증 (aquired immune deficiency syndrome, AIDS) 이나, 종양, 이식등으로면역력이저하된환자들에서발병빈도가계속증가하고있다 (Horsburgh et al. 1991). 비결핵항산균폐질환의원인균분포는지역에따라차이를보이는데서구와일본에서는 MAC (mycobacterium avium complex) 에이어 M. kansasii 가두번째로흔한비결핵항산균폐질환의원인균임에비해, 지금까지의국내보고와유사하게본연구에서도 MAC에이어 M. abscessus 가두번째로흔한 NTM으로나타났다 (Choi et al. 2013). 신속발육균의종류로는 M. abscessus, M. fortuitum, M. chelonaei, 등이속하며, 특히 M. abscessus는주로연부조직감염이나폐감염을일으키며병원성이강한것으로보고되어있다 (Metchock et al. 1999) (Ingram et al. 1993). M. abscessus에의한감염의경우대부분의항결핵제에내성을나타내고종내에서도항균제감수성이달라일반적으로항균제감수성검사가요구된다. 결핵균과비결핵균의분리빈도가증가함에따라정확한동정이요구되고있는데, 대표적인검사법으로도말검사 (AFB stain), 배양법, 분자생물학적방법을들수있다. Mycobacteria 를감별동정하는도말검사는기법이간편하고저렴하여쉽게할수있고결과가빨라환자관리에편리할뿐아니라이방법으로진단되는환자가바로결핵을전파하는전염원이라역학적측면에서도중요하다. 그러나직접도말검사는객담 1 ml내에 10 4 개이상의균이있어야검출이가능할정도로감수성이낮고, 결핵유병률이높은지역에서는문제가안되지만결핵이많지않은지역에서는도말표본에서보이는항산성균이결핵균이아닌경우가많아서특이성도문제가되고있다. 반면에균분리배양검사는균동정이가능해특이성도높고비교적소수의균도검출이가능해감수성도높은편이지만, 검사과정이복잡해비용도많이들고검사결과가 3 4 주이상걸리는단점이있다. 따라서요즘은뛰어난감수성과특이성에이어결과의신속함을가진분자생물학적방법인중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 도사용하고있으나 PCR은비용과검체내균수크기를알려주지못하는단점이있다. 이에본연구에서는 mycobacteria 의동정에있어, 보다정확하고신속하게동정하기위해서항산성균양성검체를이용하여균분리배양검사와 PCR 방법을비교해보았다. 재료및방법 1. 검체 2011년 8월부터 2012년 3월까지서울시소재의한대학병원에서결핵환자로의심되는객담검체를 Ziehl-Neelsen's 법에따라항산성염색한결과 trace 이상의양성으로결과가판독된 266개의검체를사용하였다. 2. DNA 추출 1) 객담검체에서 DNA 추출객담검체를 4% NaOH로동량첨가하여잘섞은다음 15 분후 3,000 rpm에서 20 분간원심분리한후상층은버린다. 침전물에증류수 1 ml을가하고잘섞은후 microcentrifuge tube에 1 ml를넣고 12,000 rpm에서 3 분간원심분리후상층은버리고침전물을추출한다. 각침전물에 Insta Gene Matrix (Bio-RAD, Hercules, California, USA) 200 μl를첨가후잘섞는다. 이후 56 o C heat block에 30 분방치한후 8 분간끊인다음즉시 ice-water에식힌후 12,000 rpm에서 3 분원심분리하여상층액을 DNA template 로사용하였다. 즉시사용하지않을시에는 20 o C에보관한다. 2) 배양후집락검체에서 DNA 추출 3% Ogawa 배지에서자란균집락검체는 200 μl의 Insta Gene Matrix (Bio-RAD, Hercules, California, USA) 액에풀어 56 o C heat block 에 30분방치한다. 이후 8분간끊인다음즉시 ice-water 에식힌후 12,000 rpm에서 3분원심분리하여상층액을 DNA template로사용하였다. 3. Polymerase chain reaction (PCR) 1) 결핵균과비정형결핵균을구분하기위한 two-tube nested PCR (1) First PCR 선택된 primers가든반응혼합액 (mixture, 45 μl) 에 Insta Gene Matrix에의해추출된 DNA 산물 5 μl를가하고 Thermal cycler (GeneAmp PCR system 9700, Perkin-Elmer cetus, Boston, Massachusetts, USA) 를이용해표적 DNA 를증폭합성하였다. 반응혼합액조성은 M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis) 에특징적으로존재하는 IS 6110의 547 bp를증폭하기위하여 Primer로 pr-5인 5'-CTC AAG GAG CAC ATC AGC-3' 와 pr-6인 5'-TCA TAG GAG CTT CCG ACC-3' 를각각 1 μl씩첨가하고, Thermohilus aquaticus (Taq.) DNA중합효소 (Perkin-Elmer

3 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 2, Jun Cetus Corp., Norwalk, USA) 를 0.25 μl, dntp (datp, dctp, dgtp, dttp) 각각 1.0 μl씩, 10x Reaction buffer 5.0 μl, 증류수 μl를첨가하였다. 반응주기는 pre-denaturation 94 o C 5 분, denaturation 94 o C 1 분, annealing 60 o C 1 분, elongation 72 o C 1 분을 30 cycle을시행하였다. (2) Second PCR 선택된 primers가든반응혼합액 (mixture, 48 μl) 에 First PCR product 2 μl를가하고 Thermal cycler (GeneAmp PCR system 9700, Perkin-Elmer cetus, Boston, Massachusetts, USA) 를이용해표적 DNA를증폭합성하였다. 반응혼합액은조성은 M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis) 에특징적으로존재하는 IS 6110의 285 bp를증폭하기위하여 Primer로 pr-7인 5'-CTA CGG TGT TTA CGG TGC CC-3' 와 pr-8인 5'-TAG GCG TCG GTG ACA AAG GC-3' 를각각 1 μl씩첨가하고, Taq. DNA 중합효소 (Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, USA) 를 0.25 μl, dntp (datp, dctp, dgtp, dttp) 각각 1.0 μl 씩, 10x Reaction buffer 5.0 μl, 증류수 μl를첨가하였다. 반응주기는 pre-denaturation 94 o C 5 분, denaturation 94 o C 1 분, annealing 62 o C 1 분, elongation 72 o C 1 분을 30 cycle을시행하였다. 반응이끝난다음, 반응물 10 μl를취해 2% agarose gel에서전기영동한후 ethidium bromide (EtBr, 0.5 μg/ml로염색하여 302 nm의 UV transilluminator (Spectroline Co., New York, USA) 로 DNA bands를관찰하였다. Gel을 EtBr로염색한후 UV transilluminator로분절편을확인하였다. 결과판독은 mycobacteria 동정 algorithm 을참고하여균을동정하였다 (Lee et al. 2000). 결과 1. 항산성염색양성검체의 PCR 객담검체에서 DNA를추출한후, 결핵균과비정형결핵균을구분하기위하여 two-tube nested PCR과 rpob gene의 360 bp부분을증폭하는 PCR을시행하였다. 우선, M. tuberculosis complex에특징적으로존재하는 IS 6110의특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을증폭한 two-tube nested PCR을시행하였다. 그결과 MTB는 285 bp 부분에 band 를나타내고 (Fig. 1), band가나타나지않은검체는 NTM 검체로잠정결론내렸다. 이후, 잠정 NTM 검체는 mycobacteria 에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp 부분을증폭한후, Msp I을첨가 PCR-RFLP 를시행하여 NTM 동정결과를확인할수있었다 (Fig. 2). 항산성염색결과가 trace인 48 검체로 PCR을시행한결과 MTB 가 1, NTM이 0, 음성이 47 검체에서확인되었고, 항산성염색결과가 1+ 인 16 검체에서는 MTB가 5, NTM이 0, 음성인검체가 11로확인되었다. 또한항산성염색결과가 2+ 인 104 검체에서는 MTB 가 100, NTM이 3, 음성 1 검체로확인되었고, 항산성염색결과가 2) 비정형결핵균동정을위한 PCR-RFLP NTM 동정을위하여추출된 DNA산물에 mycobacteria 에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp를증폭하기위하여 primer로 RPO1 인 5'-TCA AGG AGA AGC GCT ACG A-3' 와 RPO2 인 5'-GGA TGT TGA TCA GGG TCT GC-3' 를 PCR하였다. 증폭된 PCR산물 15 μl에 Msp I (Boehringer Manheim Biochemicals, Germany) 0.5 μl (10 U/μl), 10x Msp Ⅰ buffer 2 μl, 멸균된증류수 2.5 μl를넣어 20 μl의혼합물을잘섞어주고, 13,000 rpm ( 약 10,000 g) 에서 3 5 초간원심분리하였다. 37 o C 항온수조에서 90 분간반응한후 PRA (PCR-RFLP assay) size marker와각효소반응액 (10 μl) 을 4% metaphor TBE agarose gel (FMC, Bioproducts, Maine) 에점적한후 100 V에서 분간전기영동탱크에얼음을담아전기영동하였다. Fig. 1. Detection of Mycobacterium tuberculousis from acid fast bacillus smear-positive sputum specimens by two-tube nested PCR. PCR products were run on a 2% agarose gel stained with Ethidium Bromide (EtBr). Lanes; M, DNA size marker (Bioneer, Alameda, California, USA), the DNA ladder consists of 13 double stand DNA fragments ranging in sizes from 100 to 1,000 bp in 100 bp increments, and additional fragments of 1,200, 1,600, 2,000 bp. The 500, 1,000 and 2,000 bp bands are two to three times brighter for easy identification; 1, M. tuberculousis; N, negative control, distilled water; P, positive control, M. tuberculosis (ATCC standard strain).

86 Hyung Seok Jang. Identification of Mycobacteria Using Polymerase Chain Reaction and Sputum Sample Fig. 2. PCR RFLP analysis of acid fast bacillus smear-positive sputum specimens.

4 86 Hyung Seok Jang. Identification of Mycobacteria Using Polymerase Chain Reaction and Sputum Sample Fig. 2. PCR RFLP analysis of acid fast bacillus smear-positive sputum specimens. Amplified DNAs were digested with Msp Ⅰ and run on a 4% metaphore agarose gel. Lanes; M, PCR-RFLP size marker; 1, M. intracellulare; 2, M. intracellulare; 3, M. abscessus; 4, M. intracellulare; 5, M. abscessus; N, negative control, distilled water; P, positive control, M. avium. Fig. 3. Detection of Mycobacterium tuberculousis from cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens by two-tube nested PCR. PCR products were run on a 2% agarose gel. Lanes; M, DNA size marker; 1, M. tuberculousis; N, negative control, distilled water; P, positive control, M. tuberculosis (ATCC standard strain). 3+ 인 98 검체에서는 MTB가 96, NTM이 2, 음성인검체가 0으로확인되었다. 2. 항산성염색양성검체의균분리배양과정을통한 PCR 항산성염색 trace 이상인검체의순수분리동정을위하여 3% ogawa 배지에배양을시행하였다. 항산성염색결과가 trace인 48 검체로배양한결과양성인검체가 47, 음성인검체가 1, 항산성염색결과가 1+ 인 16 검체에서는양성이 15, 음성이 1 검체이며, 항산성염색결과가 2+ 인 104 검체에서는양성이 104, 음성이 0, 항산성염색결과가 3+ 인 98 검체에서는양성이 98 검체, 음성이 0 으로확인되었다항산성염색 trace이상인검체를배양한집락 (colony) 의 DNA 를추출하여결핵균과비정형결핵균을구분하기위하여 two-tube nested PCR과 rpob gene의 360 bp부분을증폭하는 PCR을시행하였다. 우선, M. tuberculosis complex에특징적으로존재하는 IS 6110의특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을증폭한 two-tube nested PCR을시행하였다. 그결과 MTB는 285 bp 부분에 band 를나타내고 (Fig. 3), band가나타나지않은검체는 NTM 검체로결론내렸다. 이후, NTM 검체는 mycobacteria 에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp 부분을증폭한후 (Fig. 4), Msp I을첨가 PCR-RFLP 를시행하여 NTM 동정결과를확인할수있었다 (Fig. 5). 항산성염색결과가 trace 인 48 검체로 PCR을시행한결과 MTB 가 40, NTM이 7, 음성이 1 검체에서확인되었고, 항산성염색결과가 1+ 인 16 검체에서는 MTB가 12, NTM이 3, 음성인검체가 1 으로확인되었다. 또한항산성염색결과가 2+ 인 104 검체에서는 Fig. 4. PCR amplification of the rpob gene from cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens. PCR products were run on a 2% agarose gel. Lanes; M, DNA size marker; 1 16, positive; N, negative control, distilled water; P, positive control, M. tuberculosis (ATCC standard strain). MTB가 100, NTM이 4, 음성 0 검체로확인되었고, 항산성염색결과가 3+ 인 98 검체에서는 MTB가 96, NTM이 2, 음성인검체가 0 으로확인되었다. 고찰 항산균염색을이용한객담도말검사는결핵균과비정형결핵균을구별할수없다는제한점이있고 (American Thoracic Society 2000), 균분리배양검사는시간이오래걸린다는단점이있어, 본연구에서는이러한제한점을가진기존의검사법을대신하여분자생물학적방법인 PCR을이용하여균분리배양검사와비교하여보았다. 객담검체에서 DNA를추출하여 PCR한결과, 항산성균염색이 trace와 1+ 에서는낮은동정률을보인반면, 2+ 이상에서는대부분동정되는것을확인할수있다. 반면배양을통해집락의 DNA를추출하여 PCR한결과는항산성균염색의강도와는상관없이대부

Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 2, Jun. 2015 87 A B C Fig. 5. (A) PCR RFLP analysis using cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens.

abscessus; 4, M. intracellulare; 5, M. abscessus; 6, M. avium; N, negative control, distilled water; P, positive control, M. avium. (B) PCR RFLP analysis using cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens.

5 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 2, Jun A B C Fig. 5. (A) PCR RFLP analysis using cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens. Amplified DNAs were digested with Msp Ⅰ and run on a 4% metaphore agarose gel. Lanes; M, PCR-RFLP size marker, 25/100 bp mixed DNA ladder; 1, M. intracellulare; 2, M. intracellulare; 3, M. abscessus; 4, M. intracellulare; 5, M. abscessus; 6, M. avium; N, negative control, distilled water; P, positive control, M. avium. (B) PCR RFLP analysis using cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens. Amplified DNAs were digested with Msp Ⅰand run on a 4% metaphore agarose gel. Lanes; M, PCR-RFLP size marker, 7, M. avium; 8, M. intracellulare; 9, M. abscessus; 10, M. fortuitum Ⅱ; 11, M. fortuitum Ⅱ; N, negative control, distilled water; P, positive control, M. avium. (C) PCR RFLP analysis using cultured colony of acid-fast bacillus smear-positive specimens. Amplified DNAs were digested with Msp I and run on a 4% metaphore agarose gel. Lanes; M, PCR-RFLP size marker; 12, M. intracellulare; 13, M. intracellulare; 14, M. abscessus; 15, M. intracellulare; 16, M. abscessus; N, negative control, distilled water; P, positive control, M. avium. 분동정되는것을확인할수있다. 이결과로항산성균염색이 2+ 이상인경우는배양전후 PCR 동정결과에차이가거의없고, 1+ 이하에서만현격한차이가있음을확인할수있다. 균분리배양검사결과항산성균양성검체들이대부분집락을형성하는데항산성균 trace와 1+ 검체에서각각 1개씩배양되지않았으며, 이는객담검체에서 DNA를추출하여 PCR것과배양을통해집락의 DNA를추출하여 PCR한것으로어느곳에서도동정되지않았다. 이는검체가오염으로인한것인지, 검체가소량으로인한것인지로추측되는문제점으로남아있다. 균분리배양후 MTB를확인하기위해서 niacin test를실시한결과항산성염색 trace인경우 40 검체, 1+ 인경우 12 검체, 2+ 인경우 100 검체, 3+ 인경우 96 검체가 niacin test 양성임을확인할수있었다. 이결과와집락의 DNA를추출하여 PCR한 MTB가일치함을확인할수있었다. 본실험에서항산성균염색이 2+ 이상인경우는배양전후 PCR 동정결과에차이가거의없고, trace인경우는배양전 PCR 결과가 2% 에서배양후 97.9% 까지, 1+ 인경우는배양전 PCR 결과가 31.2% 에서배양후 93.7% 까지높일수있었다. 또한배양만으로는 MTB의동정은가능하지만 NTM의동정이가능하지않으므로배양검사와 PCR 검사모두를병행하므로써신속하고보다정확한검사결과를내는데도움될것이다. 항산성 A염색 trace 이상의양성 266 검체를임의로추출한것임으로 MTB와 NTM의분리빈도에따른통계처리를나타내는데실험에사용된전체검체수의부족한문제점이있으며, 동정된 16 개의 NTM 검체역시발병률이높은 NTM 검체를나타내는데적절하지못한문제점이있다. 여기서는다양한종류의 NTM 검체가발견되었는데, 우선객담검체에서 DNA 를추출하여 PCR-RFLP 를이용하여 M. intracellulare 와 M. abscessus가동정되었으며, 배양을통해집락의 DNA를추출하여 PCR-RFLP를이용한것에는 M. intracellulare, M terrae, M. avium, M. gordonae type I, M. abscessus, M. fortuitum II 등이동정되었다. 또한객담검체에서 DNA를추출하여 PCR-RFLP를이용하여동정된 NTM균의항산성염색의강도는 2+ 이상에서나

6 88 Hyung Seok Jang. Identification of Mycobacteria Using Polymerase Chain Reaction and Sputum Sample 타남을확인할수있고, 배양을통해집락의 DNA를추출하여 PCR-RFLP 를이용한동정된 NTM 균은항산성균염색의강도와는무관했다. Mycobacteria 에는약 70 여종이있으며이중일부는폐결핵, 피부와연조직감염, 림프절감염, 파종성 ( 산재성 ) 감염을일으키고있어정확한동정이요구되고있다 (Vareldzis et al. 1994) (Wolinsky et al. 1992). 이번실험에서동정된 NTM 균중 M. abscessus 는신속발육균에속하며병원성이강한것으로보고되어있다 (Metchock et al. 1999). 국내에서도면역저하환자의증가에따라 M. abscessus에의한감염이증가하고있으며, M. abscessus에의한감염의경우대부분의항결핵제에내성을나타내고, 종내에서도항균제감수성이달라일반적으로항균제감수성이요구된다. 최근에는연부조직감염에서진행하여균혈증을보인환자의검체를포함하여피부조직과객담, 혈액등으로부터 M. abscessus를분리동정하여감염경로와경과, 치료, 및균의특성에대하여보고된바도있다. 이에균분리배양을하는데있어신속발육균이 MTB 검체에섞일수있으므로배양기간을 6주이상충분히둔후, MTB와 NTM 동정을병행하는것이최선의방법일것이다. 또한이전에는 NTM 균주들을단순히오염균으로만여겼지만, 최근에는인체감염의원인균으로의의가증가하고있어, NTM 균주의신속하고정확하게진단할수있는검사법의개발이필요하며, 국내임상검체에서새롭게동정되는 NTM 균주에대한연구가필요한실정이다 (Choi et al. 2014). 위에결과들로 MTB과 NTM 동정모두에있어실험에사용된검체수가분리빈도를나타내기에는부족하므로좀더많은수의비교실험이지속적으로연구되어야할것이며, 균분리배양검사나 PCR의어느한가지방법만이용할것이아니라두가지검사를모두병행함으로써좀더신속하고정확한검사결과에도움이될것이라고생각된다. 용하여균분리배양검사와비교하여보았다. Mycobacteria 를동정하는데항산균염색과 3% ogawa 배지를이용하였고, 균분리배양후 M. tuberculosis 를확인하기위해서 niacin test를실시한결과집락의 DNA를추출하여 PCR후동정된 M. tuberculosis 와 niacin 양성이일치함을확인할수있었다. 또, 이실험에서항산성균염색이 2+ 이상인객담검체와집락검체각각에서 DNA를추출하여결핵균을동정하는방법으로 M. tuberculosis complex에특징적으로존재하는 insertion sequence (IS) 6110의특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을증폭한 two-tube nested polymerase chain reaction을시행하였고, 비정형결핵균동정법으로는 mycobacteria 에공통적으로존재하는 rpob 유전자중일부인 360 bp 부분을증폭한후, 제한효소 Msp I을첨가 PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) 을시행하였으며, 결핵균과비정형결핵균모두동정율에거의차이가없었다. 1+ 인경우는객담검체에서 PCR한결과가 31.2% 에서집락검체의 PCR한결과 93.7% 까지결핵균과비정형결핵균의동정율이높아졌고, trace인경우객담검체에서 PCR 결과가 2% 에서집락검체에서 PCR한결과가 97.9% 까지결핵균과비정형결핵균의동정율을높일수있었다. 이실험에서항산성균염색 1+ 이하일때객담검체와집락검체로 PCR을실시하면결핵균과비정형결핵균의동정율에차이가있고, 배양만으로는결핵균의동정은가능하지만비정형결핵균의동정이가능하지않으므로배양검사와 PCR 검사모두를병행하므로써보다신속하고정확한검사결과를내는데도움될것이다. Acknowledgements: None Funding: None Conflict of interest: None References 요약결핵 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 감염은아직까지전세계에서높은유병률과사망의주요원인이되고있으며비정형결핵 (nontuberculous mycobacteria, NTM) 은최근후천성면역결핍증 (AIDS) 이나, 종양, 이식등으로면역력이저하된환자들의임상검체에서분리빈도가증가함에따라분리균주의임상적의의가중요시되고있다. 이에항산균염색을이용한객담도말검사는결핵균과비정형결핵균을구별할수없다는제한점이있고, 균분리배양검사는시간이오래걸린다는단점이있어, 본연구에서는이러한제한점을가진기존의검사법을대신하여분자생물학적방법인중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 을이 1. American Thoracic Society Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adult and children. Am J respir Crit Care Med 161: Choi S R, Kang M J, Park G-H, Kim D-H, Jeong D-W, Seo E-H, et al. Species Identification of Nontuberculous Mycobacteria (NTM) by PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PRA) of the rpob Gene from Three Hospitals of Busan- Kyeongnam Area, Korean J Clin Lab Sci. 2013, 45(2): Choi Y-I, Kim H-Y. Usefulness of PCR to Mycobacterium Tuberculous and Nontuberculous Mycobacteria from Paraffinembedded Tissues. Korean J Clin Lab Sci. 2014, 46(2): Horburgh CR Jr Mycobacterium avium complex infection in the acquired immunodeficiency syndrome. N Engl J Med, 324: Ingram CW, Tanner DC, Durack DT, Kernodle W, Corey GR Disseminated infection with rapidly growing myco-

7 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 2, Jun bacteria. Clin Infect Dis, 16: Kennedy MP, O'Conor TM, Ryan C, Sheehan S, Cryan B, Bredin C Nontuberculous mycobacteria: incidence in Southwest Ireland from 1987 to Respir Med, 97: Lee HY, Park HJ, Cho SN, Bai GH, Kim SJ. Specific identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpob gene. J. Clin. Microbiol. 2000;37: Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ, Jr Chapter 25. Mycobacterium. In:Patrick RM, Ellen JB, Michael AP, Fred CT, Robert HY, editor. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. washington:asm press, Sakatani M Nontuberculous mycobacteriosis. the present status of epidemiology and clinical studies. Kekkaku, 74: Vareldzis BP. Grosset J. Kantor ID. Crofton J. Laszlo A. Felten M Drug resistant tuberculosis. Laboratory issues(world Health Organization recommendations). Tubercle lung Dis, 75: Wolinsky E Mycobacterial disease other than tuberculosis. Clin Infect Dis, 15:1-12.

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hwp 중합효소연쇄반응과객담검체를 이용한 mycobacteria 의 검출민감성비교 연세대학교보건환경대학원 의생명과학전공 이정민 중합효소연쇄반응과객담검체를 이용한 mycobacteria 의 검출민감성비교 지도이혜영 교수 이논문을석사학위논문으로제출함 2007 년 06 월일 연세대학교보건환경대학원 의생명과학전공 이정민 이정민의석사학위논문을인준함 심사위원 심사위원 심사위원