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은영 엽
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1 Korean J Clin Microbiol Vol. 12, No. 1, March, 2009 Evaluation of Combined Use of BacT/ALERT 3D Liquid Culture System and PCR-RFLP for Detection and Identification of Mycobacteria from Bronchial Specimens Hae-Sun Chung, Chang-Seok Ki, Jang Ho Lee, Nam Yong Lee Department of Laboratory Medicine and Genetics, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea Background: We evaluated BacT/ALERT 3D liquid culture system (biomeŕieux, USA) and PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) for recovery and direct identification of mycobacteria, and the results were compared with a conventional culture system using an egg-based solid medium. Methods: A total of 3,037 bronchial specimens (2,309 bronchial washing fluids and 728 bronchoalveolar lavages) were collected. Decontaminated specimens were inoculated to both BacT/ALERT MP liquid media and Ogawa solid media (3%, Shinyang, Korea). Recovery rate and detection time were compared between the two systems. Liquid media from positive cultures were centrifuged and the pellets were tested for direct identification of mycobacteria by PCR-RFLP using Myco-ID (M&D Inc., Korea). Results: A total of 518 isolates, including 215 M. tuberculosis (MTB) and 303 non-tuberculosis mycobacteria (NTM), were recovered. The liquid media detected 492 isolates (16.2%), including 195 MTB and 297 NTM), whereas the solid media detected 416 isolates (13.7%), including 187 MTB and 229 NTM (P<0.001); 102 isolates (28 MTB and 74 NTM) were recovered only by the liquid media, while 26 (20 MTB and 6 NTM) isolates were recovered only by the solid media. The mean time to detection was 18.1 days by the liquid media and 29.3 days by the solid media (P<0.001). The overall time to species identification from inoculation was 21.8 days. Direct PCR-RFLP from the liquid media identified 39.1% of MTB, 6.3% of M. avium, of M. abscessus, and 12.6% of M. intracellulare respectively. Conclusion: Combined use of a liquid culture system and PCR-RFLP improved the recovery rate and shortened the detection time. However, solid media is still necessary to maximize the diagnostic efficiency. (Korean J Clin Microbiol 2009;12:37-42) Key Words: Mycobacteria, Culture, Liquid media, PCR- RFLP, Bronchial specimen 서 마이코박테리아에는결핵균 (Mycobacterium tuberculosis, MTB), 나병균 (M. leprae) 과이들을제외한비결핵항산균 (nontuberculous mycobacteria, NTM) 등이포함된다. MTB에의한폐결핵과 NTM에의한 NTM 폐질환은대표적인폐마이코박테리움감염 (Mycobacterial pulmonary infection) 으로써, 전세계적으로중요한질환이며많은관심의대상이다 [1-3]. 특히우리나라는폐결핵의유병률이높고, 최근에는 NTM 폐질환의중요성도강조되고있다 [4]. Received 5 August, 2008, Revised 12 December, 2008 Accepted 25 February, 2009 Correspondence: Nam Yong Lee, Department of Laboratory Medicine and Genetics, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, 50 Ilwon-dong, Gangnam-gu, Seoul , Korea. (Tel) , (Fax) , ( ) micro.lee@ samsung.com 론 폐마이코박테리움감염의효과적인관리에있어서신속하고정확한진단은필수적이다. 그러나기존의전통적인검사방법인항산균염색과배양검사는한계가있었다. 항산균염색은저렴하고간편하며검사결과를빨리얻을수있는장점이있으나, MTB와 NTM을구별할수없고민감도와특이도가낮은단점이있다. 배양검사의경우, 가장확실한방법이며표준진단법 (gold standard) 방법이지만오랜시간이필요하다는단점이있다. 배양배지는크게고체배지와액체배지로구분되는데, 특히고체배지의경우검출시간이길고액체배지에비해민감도가낮다. 그에비해액체배지는검출시간이빠르고검출률이높으며, 장비를이용하여더편리하게우수한성과를얻을수있다. 그러나액체배지는오염률이높고, 배양양성시 MTB와 NTM을구별할수없으며, 비용이높다는등의단점도있다. 현재시판되어이용되고있는액체배지배양장비로는 BACTEC MGIT 960 system (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA), VersaTRECK (ESP culture system Ⅱ; Trek 37

2 38 Korean J Clin Microbiol 2009;12(1):37-42 Diagnostics, Inc., Westlake, OH, USA), BacT/ALERT 3D liquid culture system (biomeŕieux, Durham, NC, USA) 등이있다 [5,6]. 마이코박테리아배양시 Center for Disease Control (CDC), Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), College of American Pathologists (CAP) 등에서는액체배지와고체배지를포함하여두개이상의배지를사용하도록권고하고있다 [1,7-9]. 그러나국내에서는아직액체배지의사용이제한되어있는실정이다 [10]. 본연구에서는기관지검체에서액체배지배양자동화장비 BacT/ALERT 3D liquid culture system과중합효소연쇄반응-제한절편길이다형성 (PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 을이용하여마이코박테리아의검출및동정을시행하고, 기존의고체배지배양과비교하였다. 재료및방법 1. 재료 2006년 4월부터 2007년 9월까지결핵균도말및배양검사가의뢰된총 3,037건의기관지검체 ( 기관지세척액 2,309예, 기관지폐포세척액 728예 ) 를대상으로하였다. 2. 검체전처리 50 ml의원추형시험관에검체와동량의 N-acetyl-L-cysteine (NALC)-2% NaOH 용액을넣고 15분간실온에방치후멸균증류수로 50 ml까지채워냉장원심분리기에서 3,000 g 에서 15분간원침하였다. 상청액을제거하고남은침전물로염색과배양을실시하였다. 3. 항산균염색및결과판독전처리가끝난검체를유리슬라이드에도말한후형광염색법으로항산균염색을실시하였다. 형광염색결과 CDC의기준에의한 ± 이상의슬라이드는 Ziehl-Neelsen 염색법으로확인하여 CDC 판정법에따라보고하였다. 4. 마이코박테리아배양전처리된검체를고체배지 (3% Ogawa; Shinyang Chemical Co., Seoul, Korea) 에접종하여 37 o C에서배양하였고, 1주에한번씩 8주동안균집락을관찰하였다. 또한동시에 Middlebrook 7H9 broth base 가포함되어있는 BacT/ALERT MP 액체배지 (biomeŕieux, Durham, NC, USA) 에접종하여 BacT/ALERT 3D liquid culture system 에배양하였다. BacT/ALERT 3D liquid culture system은매 10분마다마이코박테리아가성장하면생성되는 CO 2 를 ph 변화로감지하여정해진알고리즘에따라지속적으로마이코박테리아성장유무를자동으로검색한다. 장비에서양성신호가발생되면배양병을꺼내어배양액을원심분리하여침사를얻어항산균염색을실시하고균동정을실시하였다. BacT/ALERT MP 액체배지에서양성신호가발생되었지만, 이후배양액항산균염색이나균종동정에서음성결과가나온경우는위양성으로판단하였다. 5. 마이코박테리아의균종동정배양양성인 BacT/ALERT MP 액체배지병에서배양액을취해 100 o C 끓는물에 20분간담가놓은후원심분리하여추출된 DNA로직접 Myco-ID (M&D, Seoul, Korea) 를이용하여 PCR-RFLP 방법으로마이코박테리아의균종수준까지동정하였다. Myco-ID 는 rpob 유전자의다형성을이용한것으로, rpob 유전자의일정부위를다량증폭한후제한효소처리를하여절편의크기에따라키트에포함된 마이코박테리아및노카디아동정알고리즘 표를기준으로균을동정한다. 6. 통계처리두배양방법간의비교는 SPSS 프로그램 (Window version 11.5) 을이용하여, 검출률의차이는 McNemar s test 검정을하였고, 검출시간의차이는 Wilcoxon signed rank test 검정을시행하였다. 통계적유의수준은 P값 0.05 이하로하였다. Table 1. Isolations of mycobacteria from 3,037 specimens Method Egg-based solid media Result BacT/ALERT liquid media MTB NTM Total , , ,519 P-value <0.001 <0.001 Abbreviations: MTB, M. tuberculosis; NTM, nontuberculosis mycobacteria.

3 Hae-Sun Chung, et al. : Evaluation of Liquid Culture System and RCR-RFLP for Testing Mycobacteria 검출률비교 (Table 1) Table 2. Time (days) to detect mycobacteria Method BacT/ALERT liquid media Egg-based solid media P-value MTB <0.001 NTM <0.001 Total <0.001 Abbreviations: See Table 1. 결 총 3,037개의검체중 518검체 (17.1%) 에서항산균이배양되었다. 이중 MTB는 215건 (7.1%), NTM은 303건 (9.9%) 이었다. BacT/ALERT MP 액체배지에서는 492건 (16.2%; 195 MTB, 297 NTM) 이검출되었고, 고체배지에서는 416건 (13.7%; 187 MTB, 229 NTM) 이검출되었다. BacT/ALERT MP 액체배지와고체배지의검출률차이가 MTB에서는유의하지않았으나 (P=0.312), 마이코박테리아전체와 NTM에서는유의한차이가있었다 (P<0.001). BacT/ALERT MP 액체배지에서만검출된경우는 102건 (3.4%; 28 MTB, 74 NTM) 이었고, 고체배지에서만검출된경우는 26건 (0.9%; 20 MTB, 6 NTM) 이었다. BacT/ALERT MP 액체배지에서위양성인경우는총 3,037 개의검체중에 66건 (2.2%) 이었으며, 고체배지가오염된경우는 62건 (2.0%) 이었다. 2. 검출시간비교 (Table 2) 마이코박테리아를검출하는데소요된평균시간은 BacT/ ALERT MP 액체배지에서는 18.1일, 고체배지에서는 29.3일로유의한차이가있었다 (P<0.001). 이러한검출시간의차이 Table 3. Isolation frequency of mycobacteria from bronchial specimen 과 No. of isolates (%) M. tuberculosis 171 (39.1) M. avium 115 (26.3) M. abscessus 83 (19.0) M. intracellulare 55 (12.6) M. fortuitum 2 (0.5) M. kansasii 2 (0.5) M. szulgai 2 (0.5) M. chelonae 1 (0.2) M. gordonae 6 (1.4) Total 437 는 MTB, NTM 모두에서유의하게나타났다. BacT/ALERT MP 액체배지에접종후양성배양병에서직접 PCR-RFLP를이용하여균을동정하기까지소요된총평균시간은 21.8일이었다. 3. 마이코박테리아균종동정결과 (Table 3) BacT/ALERT MP 액체배지양성중총 468개의배양병에서추출한 DNA로직접 PCR-RFLP를시행하여총 437건의마이코박테리아를동정하였다. 22건 (5.0%) 은증폭산물을얻는데실패하였으며, 9건 (2.1%) 은동정알고리즘에의해동정이되지않았다. 동정된마이코박테리아중 MTB가가장흔했고 (39.1%), 그다음으로 M. avium (26.3%), M. abscessus (19.0%), M. intracellulare (12.6%) 순으로흔하게동정되었다. 다른균종은 1% 미만으로동정되었다. 전체동정된마이코박테리아중 NTM의비율은 60.9% 였다. 2가지이상의마이코박테리아가배양된경우는 1건이었다. 고찰본연구결과, BacT/ALERT MP 액체배지에서는양성검체의 95.0% 가검출되었고, 고체배지에서는양성검체의 84.6% 만검출되어, BacT/ALERT MP 액체배지의마이코박테리아검출률이고체배지보다우수하였다. 그차이는 MTB (90.1 vs. 87.0%) 에서는유의하지않았으나 (P=0.312), 마이코박테리아전체 (95.0 vs. 84.6%) 와 NTM (98.0 vs. 75.6%) 에서는유의하게 BacT/ALERT MP 액체배지가고체배지보다검출률이높았다 (P <0.001). Gil-Setas 등의연구 [11] 에서는 MB/BacT 배지 (Organon Teknika, Turnhout, Belgium) 에서는 90.1%, Lowenstein-Jensen (L-J) 배지 (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) 에서는 77.5% 가검출되었다고하였고, Mirovic 과 Lepsanovic[12] 은 MB/BacT 배지 (Organon Teknika, Durham, NC, USA) 에서는 93.2%, L-J 배지에서는 67.3% 로보고한바있다. 또한, Ogawa 배지와액체배지를비교한 Abe 등의연구 [13] 에서 3% Ogawa 배지에서의검출률은 75.6% 로액체배지배양장비인 BACTEC 에서의 93.0% 보다유의하게낮았다. 이상의연구들에서액체배지가계란기초의고체배지인 L-J 배지와 Ogawa 배지보다우수한검출률을보이는것을확인할수있고, 그외에도여러논문들에서일관되게액체배지가고체배지에비해서마이코박테리아의검출에유리하다고보고되고있다 [14-17]. 하지만액체배지와고체배지를병용시검출률이높아진다는점이보고된바있으며 [11,14,17,18], 본연구에서도고체배지에서만검출된경우가총양성검체중 5.0%, 특히 MTB 양성검체중 9.3% 있어, 고체배지배양도배양의민감도를높이기위해필요할것으로판단된다. 이는 CDC, CLSI, CAP 등에서권고하는바와도일치한다 [1,7-9].

4 40 Korean J Clin Microbiol 2009;12(1):37-42 BacT/ALERT MP 액체배지에서의위양성은다른세균의성장등으로인한 ph의변화에의한것으로, 본연구에서는 2.2% 의위양성률을보였다. 위양성인경우, 마이코박테리아에대한검사이외의세균에대한검사를시행하지않아, 위양성중오염에의한것을정확히구분할수는없었지만, 상당부분이오염에의한위양성일것으로생각된다. 기존의액체배지에대한연구에서오염률이 1.6 9% 로다양하게보고되고있는데, 일반적으로고체배지보다높은것으로알려져있다 [11-16]. 한편, 일부연구에서오염률과구별하여위양성률을 % 로보고하였다 [11,14,16]. 본연구에서오염률을포함한전체위양성률은기존에알려진것보다낮은수준이며, 고체배지의오염률과크게차이가없는것으로나타났다. 마이코박테리아가검출된시간에있어서 BacT/ALERT MP 액체배지가고체배지보다유의하게빨라 (18.1 vs. 29.3일 ) 결과보고를 10일이상단축할수있었다. 이차이는 MTB (24.6 vs. 30.8일 ) 와 NTM (12.8 vs. 28.0일 ) 모두에서유의하였으며 (P<0.001), 특히 NTM에서매우단축되었다. BacT/ALERT 3D system의경우기기에의한양성신호검출의예민도가높고, 매 10분마다지속적으로균의성장을감시및보고하는방법으로운용되기때문에 1주일에한번빈도로균집락유무를육안으로확인하는고체배지에비해균의성장을검출하는데소요되는시간이단축될수있었다. 기존의액체배지와고체배지비교연구들에서도액체배지사용시검출시간이단축됨이보고되었다 [11-16]. 하지만본연구에서균을동정하기까지소요된총평균시간은 21.8일로, CDC에서권고하는동정소요기간인 14일에는미치지못하였다. 이는대상검체가기관지검체중기관지세척액과기관지폐포세척액이어서균이희석되었을가능성에의한것일수있다. 또한낮은오염률이검출시간의연장과관계가있다는보고가있어 [16], 본연구의결과를뒷받침한다. 마이코박테리아균종동정결과 MTB가단일균종으로는가장흔하게분리되었으며 (39.1%), 그외흔하게분리된 NTM은 M. avium (26.3%), M. abscessus (19.0%), M. intracellulare (12.6%) 이었다. NTM의균종비율은지역적인차이가있는것으로알려져있으며 [19], 본연구에서발견된흔한 NTM 균종은다른국내연구와비슷한결과였다 [19-24]. 한편, 전체 NTM 의비율은 60.9% 로다소높은비율이었는데, 그요인으로대상검체가기관지경을시행하여채취한기관지검체라는점, 본원에내원한 NTM 폐질환환자의비율이타병의원에비해높다는점등을생각해볼수있다. 본연구결과에서확인하였듯이, 액체배지가검출률이높고검출시간이빠르다는장점이있으나, 반면몇가지단점도지적되고있다. 그중액체배지에서양성시, 육안으로균종이구별되는고체배지에서와는달리, MTB와 NTM의감별이안된다는점이있다. 하지만이러한단점은본연구에서시행한 PCR-RFLP나다른 MTB를검출할수있는분자유전학적방법을동원하면극복할수있을것이다. 또액체배지사용의중요한단점이비용측면에서불리하다는점이며, 이점때문에국내에서의액체배지사용이제한되어있는실정이다. 국내에서는마이코박테리아의액체배지배양에대한연구로는 BACTEC MGIT 960 system에대한평가가주로이루어져있고 [25-28], BacT/ALERT MP 액체배지에대한평가는부족한실정이다 [29]. 한편, 마이코박테리아균동정을위한 PCR-RFLP 방법에대한연구는보고된바있으나 [30], 양성액체배지를검체로한연구도부족하다. 따라서, 본연구가국내에서 BacT/ALERT 3D liquid culture system과 PCR-RFLP의병용에대해평가한첫번째연구이며, 유용한정보를제공할것으로생각된다. 그러나이연구에서는몇가지제한점이있었는데, 그중임상적의의에대한고려가배제된점을들수있다. 특히, NTM 의경우 NTM 폐질환의유무는임상양상, 영상소견등다양한임상소견을바탕으로판단되며, 검사실에서의 NTM의동정이중요한의미를가지지만, 절대적인지표는아니다 [31]. 따라서, 앞으로분리된 NTM의임상적의의에대한연구가이루어져야할것이다. 또한, 본연구에서시행한방법을실제검사실에모두적용할수있을지에대해서인력이나재정적인문제에대한고려가필요할것이다. 결론적으로, 마이코박테리아배양시 BacT/ALERT 3D system 액체배지를사용함으로써검출률을높일수있었으나, 검출률을최대화하기위해서는고체배지와의병용이권고된다. 또한, 액체배지배양과 PCR-RFLP의병용은검출률을높일뿐아니라, 마이코박테리아검출시간과균종동정까지의시간을단축할수있어, 폐결핵및 NTM 폐질환환자의조기진단및치료에많은도움이될것으로생각한다. 참고문헌 1. Shinnick TM, Iademarco MF, Ridderhof JC. National plan for reliable tuberculosis laboratory services using a systems approach. Recommendations from CDC and the Association of Public Health Laboratories Task Force on Tuberculosis Laboratory Services. MMWR Recomm Rep 2005;54: Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott BA, Catanzaro A, Daley C, Gordin F, et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med 2007;175: Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing. WHO report Geneva, World Health Organization, (WHO/HTM/ TB/ ). 4. Hwang EJ. Evaluation of a tuberculosis control program at community health centers. J Korean Acad Public Health Nurs 2007;21: Della-Latta P. Mycobacteriology and Antimycobacterial Susceptibility Testing. In: Isengerg HD, ed. Clinical Microbiology Proce-

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6 42 Korean J Clin Microbiol 2009;12(1):37-42 = 국문초록 = 기관지검체에서의마이코박테리아검출및동정을위한 BacT/ALERT 3D System 과 PCR-RFLP 병용 성균관대학교의과대학삼성서울병원진단검사의학과정혜선, 기창석, 이장호, 이남용 배경 : 본연구에서는기관지검체에서액체배지배양자동화장비 BacT/ALERT 3D liquid culture system (biomeŕieux, USA) 과중합효소연쇄반응-제한절편길이다형성 (PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 을이용하여마이코박테리아의검출및동정을시행하고, 기존의고체배지배양과비교하였다. 방법 : 2006년 4월부터 2007년 9월까지, 총 3,037건의기관지검체 ( 기관지세척액 2,309예, 기관지폐포세척액 728예 ) 를대상으로, BacT/ALERT MP 액체배지 (biomeŕieux, USA) 와고체배지 (3% Ogawa; Shinyang, Korea) 에동시에접종하여, 두방법간의검출률과검출시간의차이를비교하였다. BacT/ALERT MP 액체배지에서양성이면, Myco-ID (M&D Inc., Korea) 를이용하여 PCR-RFLP 방법으로균종을동정하였다. 결과 : 총 3,037개의검체중 518검체 (17.1%) 에서항산균이배양되었으며, Mycobacterium tuberculosis (MTB) 215건, nontuberculous mycobacteria (NTM) 303건이었다. 액체배지에서는 492건 (16.2%; 195 MTB, 297 NTM), 고체배지에서는 416건 (13.7%; 187 MTB, 229 NTM) 이검출되었다 (P<0.001). 액체배지에서만검출된경우는 102건 (28 MTB, 74 NTM) 이었고, 고체배지에서만검출된경우는 26건 (20 MTB, 6 NTM) 이었다. 마이코박테리아를검출하는데소요된평균시간은액체배지가고체배지보다빨랐다 (18.1 vs 29.3일 ; P<0.001). 액체배지에접종후균을동정하기까지소요된총평균시간은 21.8일이었다. 양성액체배지로직접 PCR-RFLP를시행한결과, MTB (39.1%), M. avium (26.3%), M. abscessus (19.0%), M. intracellulare (12.6%) 등이동정되었다. 결론 : 액체배지배양과 PCR-RFLP의병용은검출률을높이고검출시간을단축시킬수있었으며, 검출률을최대화하기위해고체배지와의병용이권고된다. [ 대한임상미생물학회지 2009;12:37-42] 교신저자 : 이남용, , 서울시강남구일원동 50 번지삼성서울병원진단검사의학과 Tel: , Fax: micro.lee@samsung.com

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untitled DOI: 10.4046/trd.2010.69.4.250 ISSN: 1738-3536(Print)/2005-6184(Online) Tuberc Respir Dis 2010;69:250-255 CopyrightC2010. The Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Diseases. All rights reserved.