Life Science & Biotechnology 22 특집1 DNA chip 1

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영주 국
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1 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 1 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 기술 Takashi Okado DNA Function Analysis Center Takara Shuzo Co., Ltd 효율로역전사반응시에형광물질이 cdna에시각적으로다양하게표현할수있다. 또한 Cy parameter를이용해서보정 (normali 1. 서론 Competitive hybridization의 최근 게놈프로젝트로대표되는유전자염기합되어야서열한다. 현재 DNA chip 해석을위 해석의급속한증가로생체내많은유전자의되는역형광기질은 Cy3 와 Cy5 가결합한 d 할을 효율적으로해석하기위한새로운실험기법로, 거의같은효율로 cdna에표식된다. 이 이 필요하게되었다. DNA chip은 slide 물질은여기파장과 glass상형광파장이다르므로각각의 에 수백 ~ 수천개의 DNA 유전자를정렬 고정화한형광강도를측정할수있다. 형광강도를측정하기 것으로, 해석하고자하는세포에서추출한 RNA 위해서 scanner라는 DNA chip 해석 로 조제한형광표식 cdna를 hybridization 하다. Scanner 하여로 DNA chip 상의각 각 유전자의발현변화를측정하는방법이다. 에한 hybridization한형광 cdna의 번의 실험으로매우많은유전자의발현정보를하며, 각 spot의 Cy3 와 Cy5 형광강 얻을 수있으며, 게놈해석에서얻은유전자 hybridization 구조한시료에서유래한 mr 정보를바탕으로체계적인발현해석을위한강력 한 screening tool로이용되고있다 Competitive. DNA chip hybridization 을 이용한실험은기본적으로기존의 양은절대량이아니라, 시료 A와 B의상대적인 hybridization 방법이지만, DNA 이다가 ( 그림고정되어 2). 있 DNA chip 해석장치로 C 는 기판이 membrane이아닌 glasscy5 이고, 의 spot 형광강도를영화상데이터로얻은다음 역이 지극히한정되어있어 (22 mm 50 DNA mm 이chip 해석 software를이용하여 내 ) 새로운기술과기기에대한필요성이대두되다. 해석 software로각유전자의발현비 었다. 양 ) 를 scatter plot, 원그래프형태, 2. DNA chip 해석의원리 와 Cy5 signal 강도의수치도여러가 DNA chip 위에고정된 DNA( 한가닥수 DNA) 있다. 와상세한해데이터해석을위하여 sign 석하고자하는 mrna를역전사반응하여조제한치데이터에서 Excel 등의표계산 soft cdna를 hybridization하여 mrna 용할의수양을있다. 측정 하는 것이 DNA chip 실험으로효소반응이나실 험 조작자체는기존에개발된방법과동일하다. 그러나 hybridization시기존에사용되는조작과 비교할때, 지극히미량 (10~100 μl ) 의반응용액 으로 실험하며, DNA chip 위에고정된 DNA는미 (1 / 2) 오후 4:04:33

2 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 1 량 ( 수십 pl) 이므로, DNA양의분포변화가커서이를보정하기위한데이터처리가필요하다. 그림 1은 DNA chip을이용한실험모식도이다. 일반적으로 DNA chip으로실험하는경우, 실험간데이터를비교하기위하여 control이되는 RNA 시료와조사하고자하는 RNA 시료 2종류를각각형광물질로역전사반응하여표식한다. Control 은야생주, 정상세포, 어떤약물도처리하지않은세포유래의 RNA, 여러조직에서의 RNA 혼합물등이사용된다. 이혼합물을 DNA chip 상에서 competitive hybridization하여시료간 mrna 발현양의차이즉, 각유전자발현양의차이를기본데이터로한다. 전화면 찾아보기 ( 목차 ) 그림 1 DNA chip 의 Hybridizat (2 / 2) 오후 4:04:33

3 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 2 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 기술 Takashi Okado DNA Function Analysis Center Takara Shuzo Co., Ltd 그림 2 DNA chip 데이터해석 (1 / 3) 오후 4:05:00

4 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 2 5 Denhardt's soluti Cy3 와 Cy5 의 signal 강도는 3는가지 hybridization 방법으용액이들어갈공간 로 normalization한다. 세포사이에이용하면발현양의용액을변화균일하게 DNA chip 위에 가 작다고 생각되고, 기존의 Northern 할 Blot 수있어등좋은유 hybridization 영상 전자 발현 해석시 control로이용되는다. housekeeping gene( 예를들면 actin, G6PD) 를 이용하는 방법, DNA chip 상의전체 실험순서 유전자 signal 강도평균을두시료사이에서합치는방법 (global normalization) 과 1)DNA 미리 chip chip 제작의시 DNA 전 spot 면을위로혀다른생물종에서유래한 DNA를 spot 형샤알레에하고, 넣어테이프로고정한다 ( 그림그유전자유래의 RNA를시료 RNA를조제하기 4). 전또는후에첨가하여함께형광표식하고그 2)TaKaRa Spaced Cover Glas DNA의 signal을기준으로시료의 signal 강도를아래로하여 DNA가 array된부분위에수정하는방법이있다. 어떤방법을이용하더라도다. normalization한데이터를바탕으로발현양의변 화를 검토하는 것이며, 그방법은실험목적에 3) 형광표식따 cdna probe를조제한다 (Cy 라 적당한 방법을선택하면된다. DNA chip 표식산물해석, Cy5 표식산물을혼합하여 으로 아주 많은유전자에대한발현정보을얻을 competitor를넣어, 적당량의 hyb 수 있지만, 이데이터를올바르게처리하여유익용액에용해시킨다 ). 한 정보로 변환할필요가있다. 실험목표를명확 Hybridization solution: 하게 설정하여 데이터를해석해야만오류의가능 6 SSC 성을 줄일 수 있다. 0.2% SDS 3. DNA chip의 hybridization 실험 1 mg/ml denatured sa DNA DNA chip을이용한실험중형광표식 cdna ( 미리 0.22 μm 필터로여과한다 ) probe를 제작하는과정은일반적인생화학 4) 실험형광표식 cdna probe를 95 에서 2 에서 하는 효소반응이다. Takara를비롯한열하여몇몇변성한다. 회사에서 probe 제작용 kit가시판되고 5) 있으며실온에서, 냉각후, 15,000 rpm, 2 kit를사용할경우편리하고실패할가능성이 10 적분간원심분리한다 ( 냉각하면 SDS가침전다. 특히형광표식에이용되는 mrna( 또는되므로주의하며, 침전된경우 water b total RNA) 는 labeling 효율, DNA 잠시둔다 chip ). 의 hybridization 데이터에큰영향을미치므로, 고순 6) 원심분리후, 상청을분리하여 TaKaRa 도로조제해야한다. 또한표식반응이끝난후, 미 Spaced Cover Glass와 DNA 표식 Cy3, Cy5 를제거하면백그라운드가낮 pipet으로넣는다. 은해석결과를얻을수있다. 또 DNA가 spot된 면을 만지지 않도록주의해야하며, 먼지가 7) 붙어있 DNA chip을고정한사각샤알레를밀봉 을 경우 압축가스등으로제거한다. 후밀폐용기내 ( 물로적신 킴스타올을밑에 DNA chip의 hybridization 조작은깔아기존의용기내습도를유지 ) 에둔다. 밀폐용기 membrane 조작과는상이한점이많다. 본는고에시판하는 DNA chip용 hybridi 서는 간단하게 재현성을높일수있는조작법에 chamber 대를이용한다. 해서술하고자한다. 아래에사용하는 TaKaRa 8) 밀폐용기를 65 항온수조에서 12~16시 Spaced Cover Glass( 그림 3) 는보온한다 cover ( 차광한다 glass ). 의모서리부분에약 20 μm두께의 spacer가있고, DNA chip과의사이 (2 / 3) 오후 4:05:00

5 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 2 전화면 찾아보기 ( 목차 ) 9)2 SSC/0.2% SDS 용액이있는트를 55 로, 2 SSC/0.2% SDS 는용기 1세트를 65 로 prewarm한다 (3 / 3) 오후 4:05:00

6 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 3 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 기술 Takashi Okado DNA Function Analysis Center Takara Shuzo Co., Ltd 그림 3 TaKaRa Spaced Cover Glass (1 / 3) 오후 4:05:12

Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 3 4. 결론 최근 DNA chip을이용한연구가점점증가있으며, 그해석기술이나유용성을널리인정받기시작하였다. DNA chip 제작에는 PCR DNA 단편을증폭하고 arrayer로 spot 등복잡한작업이요구되지만, 이미여러회사에서다양한 DNA chip이상업적으로판매되고다.

7 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 3 4. 결론 최근 DNA chip을이용한연구가점점증가있으며, 그해석기술이나유용성을널리인정받기시작하였다. DNA chip 제작에는 PCR DNA 단편을증폭하고 arrayer로 spot 등복잡한작업이요구되지만, 이미여러회사에서다양한 DNA chip이상업적으로판매되고다. 그러나 DNA chip의 hybridiza 존과다른부분이있어구체적인이미지화상을을수없는연구자도있을것이다. 본고에서는사각형샤알레에 DNA Probe 용액을 Cover 반화된 DNA chip 해석기술에대하여소개하 chip을넣고테이프로 Glass와 DNA chip DNA 사 chip은대량 screening too 고정 TaKaRa 이에넣는다. 도를향상시키면이용범위는지금보다훨씬넓어 Spaced Cover Glass 질것이다. 이를위해서는 S/N비를높이는를덮는다. scanning 장치, DNA chip 기판, 은 polymerase와조합하여차이가없는그림 4 Hybridization 조작의개발및조합방법의개발, 나아가각유전정량성을가질수있는 DNA chip의자체 10)2 SSC/0.2% SDS용액에 DNA 필요하다 chip. 또한을넣DNA chip 상에 spot하고 DNA가 spot된부분이손상되지의않도록선택주기술도발전하고있어, DNA chip 의하면서 cover glass를제거한다이용하여. 특정질병의발현유전자 profil 11)DNA chip을 55, 2 SSC/0.2% 작성하여진단에 SDS 응용하고용액있으므로향후 DNA 에서 5분간교반하면서 washing한다 chip. 의응용이기대된다. 12)55, 2 SSC/0.2% SDS 용액에서 5분간교반하면서 washing한다. 13)65, 2 SSC/0.2% SDS에서 5분간 washing한다. 14) 실온, 0.05 SSC 용액에서헹군다. 15)1,000 rpm, 약 2분간저속원심분리하거나압축 N2가스 (air duster) 로수분을완전히제거하고 DNA chip을건조시킨다 ( 수분이남은상태에서건조시키면, scanner로해석할때그흔적이얼룩이나 background로남게된다. DNA chip 해석장치 (Affymetrix 428 Array Scanner, TaKaRa Code GM210 등 ) 를이용해서각 spot의형광 signal을측정한후, 얻어진화상데이터를 microarray 해석 software(imagene, TaKaRa Code BD001 등 ) 를이용해서각 spot의형광 signal을정량한다. 전화면 찾아보기 ( 목차 ) (2 / 3) 오후 4:05:12

8 Life Science & Biotechnology 22 특집 1 DNA chip 3 (3 / 3) 오후 4:05:12

cdna의신장반응이저해된다. 이와같이 AMV 유래 RTase 와 MoMLV 유래 RTase 는모두일장일단을가지나필자는 MoMLV 유래 RTase 를선호한다. 또두효소는최적 ph, 최적염농도등에서도차이가있으므로주의해야한다. 최근 Myers 등은 RTase 활성과 PCR

cdna의신장반응이저해된다. 이와같이 AMV 유래 RTase 와 MoMLV 유래 RTase 는모두일장일단을가지나필자는 MoMLV 유래 RTase 를선호한다. 또두효소는최적 ph, 최적염농도등에서도차이가있으므로주의해야한다. 최근 Myers 등은 RTase 활성과 PCR RT-PCR 법 II. 역전사효소반응 ( 주 ) 다인바이오연구소 현재분자생물학분야에서 RNA 수준의 gene expression ( 유전자발현 ) 과 cdna (complementary DNA) cloning에널리이용되고있는 RT-PCR (Reverse transcription ploymerase chain reaction) 은생명정보가 DNA에서 RNA로전달된다는분자생물학분야의