Slide 1

Size: px

Start display at page:

Download "Slide 1"

재진 경
6 years ago
Views:

1 2013 년대리점집체교육 Exiqon 2013 년 2 월 21 일 ( 목 ) 1

2 Agenda 1. mirna 란무엇인가? 2. LNA 기술의장점 3. Exiqon 제품 RNA 샘플추출 cdna 합성 qpcr Array Northern blot/in situ Hybridization Inhibitor 4. 주문방법 2

3 이것만은꼭기억해주세요! 1. mirna 가무엇이고어디에쓰이는지안다 2. LNA 기술이무엇인지안다 3. Exiqon 제품장점및 qpcr 제품의장점이무엇이고경쟁사와비교해서무엇이좋은지꼭알고간다 3

4 RNA 의다양한세계 Transcriptome mrna Messenger RNA. Encodes protein ncrna Non-coding RNA rrna Ribosomal RNA. trna Transfer RNA. Regulatory RNAs Includes small and large regulatory RNAs Other Including large and small RNA s with various functions sirna Small interfering RNA. Active molecules in RNA interference mirna microrna. Involved in gene regulation

5 생체내에존재하는 mirna 1. mirnas 는 19~22nt 의 RNA이다. 2. mirna genes 또는 mrna 의 intron 으로부터 precursor molecules (primirna) 로변형 3. pre-mirna 는 Dicer에의해 mature mirna로변형된후mirna-induced silencing complexes (miriscs) 로결합 4. miriscs는 mrna 에결합하여단백질로 translation저해 mrna자체를불안정화시킨다. February 21, 2013 Filipowicz et al. Nature Genetics

6 mirna 는무엇인가? microrna 에대한 6 가지진실 nucleotide 의짧은 non-coding RNA 2. 전사후 mrna 의조절 개의 human micrornas* 4. 모든인간 gene 중에서최소 1-3 개조절 5. 계통발생학적으로보존이잘되어있다 6. microrna 에의해변경된발현프로필이다양한질병과연결 *Sanger mirbase release 19.0, August MicroRNA 는매우흥미진진한새로운차원의유전자조절방법 mirnas 가관여된질병 : Cancer - brain, breast, colon, leukaemia, liver, lung, thyroid, pancreas, prostate Diabetes Vascular disease Heart disease, heart failure, arrhythmias, coronary artery disease Atherosclerosis, postangioplasty restenosis, transplantation arteriopathy, and stroke Cardiomyocyte hypertrophy Autoimmune disease Psoriasis Rheumatoid arthritis Systemic Lupus Erythematosus Neurological disease Alzheimer s, Parkinson s, MS Inflammatory disease Chronic pancreatitis, Crohn s disease Respiratory disease Asthma, COPD Viral infection - Host/virus interaction 6

LNA TM 기술이란? Locked Nucleic Acid(LNA) 란 DNA/RNA 구조내의 2 탄소원자위의산소원자와 4 탄소원자를고정시킨 ( 노란색 ) RNA analogs로 LNA를포함한 oligonucleotide 는 DNA나 RNA에높은결합력과특이성을나타낸다.

7 LNA TM 기술이란? Locked Nucleic Acid(LNA) 란 DNA/RNA 구조내의 2 탄소원자위의산소원자와 4 탄소원자를고정시킨 ( 노란색 ) RNA analogs로 LNA를포함한 oligonucleotide 는 DNA나 RNA에높은결합력과특이성을나타낸다. 이러한 LNA 기술을적용할경우균일한 Tm값을가진 probe 나 primer를제작할수있다. LNA K. Bondensgaard et al., Chem. Eur. J. 2000, 6, 2687 M. Petersen et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124,

8 LNA 기술의장점 8

9 Exiqon 제품군 9

panel(168 종류의 mirna primer set) 로 mirna( 을 ) 를검출. Exiqon 사의 Biofluid kit 으로추출했을경우에가장많은 mirna 가검출되었다.

10 mirna 분석을위한 RNA 추출용 kit mircury RNA Isolation Kit microrna를포함한고순도의 RNA를간편하게추출 mircury 풀라인이용을위한 RNA 추출에최적 Spin column type의 RNA 추출 kit 혈청, 혈장샘플용의추출 kit 출시 경쟁사 RNA 추출킷을이용동일한혈장으로부터 RNA 추출, mircury LNA Universal RTmicroRNA PCR System 의 Serum/Plasma panel(168 종류의 mirna primer set) 로 mirna( 을 ) 를검출. Exiqon 사의 Biofluid kit 으로추출했을경우에가장많은 mirna 가검출되었다. Call rate(%) : 검출할수있었던 mirna 의비율 mircury RNA Isolation Kit-Tissue 를사용해 total RNA 를추출했다. 섬유질이많고근조직등일반적으로추출이어렵다고여겨지는샘플로부터도고순도의 total RNA 추출이가능하다 10

11 mirna 분석을위한 RNA 추출용제품군 The mircury RNA Isolation Kit Cell & Plant The mircury RNA Isolation Kit Tissue The mircury RNA Isolation Kit Biofluids Biofluids: 혈청, 혈장, 소변, 체액등 11

mircury LNA Univesal RT mirna PCR system Univesal cdna synthesis kit Customer and pre-designed microrna and reference gene primer sets Pre-defined

12 mircury LNA Univesal RT mirna PCR system Univesal cdna synthesis kit Customer and pre-designed microrna and reference gene primer sets Pre-defined mirnome PCR panel Human, Mouse & Rat Pre-defined Focus PCR panels Pick-&-Mix, custom PCR panels (Ready-to-Use) SYBR Green master mix 2,5 or 25ml 12

13 qpcr 을이용한 mirna 분석 A polya tail 을생성 PolyT primer 를이용하여 cdna 합성 LNA forward, reverse primer 를이용하여 qpcr 반응 13

14 Exiqon 의 ready to-use PCR panel Customer and pre-designed microrna and reference gene primer sets Individual PCR array Pre-defined mirnome PCR panel Human, Mouse & Rat Pick-&-Mix, custom PCR panels (Ready-to-Use) Pre-defined Focus PCR panels mirna 전체에대해 plate 를통해대용량으로한번에반응 14

15 Exiqon 의 ready to-use PCR panel Panel 종류 mirnome panels Focus panel 장점 mirbase 에등록된 Human, Rat, Mouse 에대한 mirna 를원하는샘플에서스크리닝할수있다. 특정샘플을타겟으로선택 (Serum/plasma, cancer, stem cell 등 ) 하여 mirbse 에등록된 mirna 를스크리닝할수있다. Pick-&-Mix 유저가원하는샘플과 mirna 를스크리닝할수있다. 15

16 16 경쟁사비교

17 ABI(Life Technologies) TaqMan system Stem-loop, microrna specific RT primer 이용 cdna 합성 장점 : Precursor miran 합성저해 Single nucleotide mismatche 구별 가수분해 probe 를이용 Real time PCR 단점 : 각각 microrna 그리고각각 sample 마다 RT 반응필요 ( 많은 sample 양필요난해한 setting) DNA 가포함된 primer 사용으로 sensitivity 가제한적 Taqman probe, RT primer, PCR primer 가겹쳐질가능성이높음 non-specific 증폭을확인하기어려움 (no melt curves) 17

18 실험과정비교 Samples 수 : 6 Assays 수 : 8 RNA samples cdna synthesis PCR amplification 146 Pipetting steps 269 Not including multipipette 여러분이라면어떤제품을선택할까요? 18

19 1 달후다시실험을시작해야한다면 RNA samples cdna synthesis PCR amplification 19

20 Exiqon 의장점 (ABI 대비 ) 적은 pipetting error를줄일수있다 합성한 cdna 재사용 편리 적은 tube 비용절감 간편한 setup 20

21 TLDA microrna Arrays + qpcr 장점 : 사용이용이한 TLDA(TaqMan Low Density Arrays)card (pipetting error 를줄일수있다 ) 기기사용의인지도 단점 : 대규모 RT 를채택하면서성능적인면과타협 mirna 실험에부족한최적화 매우긴 protocol 거의 8 시간 (pre-amp 포함 ) 까다로운 setting 장비의호환성이낮음 21

22 Exiqon vs TLDA 특징 Exiqon ABI Pre-amplification 필요없음필요함 RT-reaction Universal RT, 모든 mirs uniform 합성대규모 RT 재현성떨어짐 소요시간 universal RT 까지포함약 3 시간 8 시간 Primer design LNA primer, target specific Taqman probe, RT primer, PCR primer가겹쳐질가능성이높음 Sensitivity 98% (1000 copies 기준 ) 60% (1000 copies 기준 ) 22

23 Qiagen 장점 : RT 반응이한번에끝남 Melt curve 분석가능 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT PolyA tailing and poly dt-tag RT DNA forward primer and universal reverseprimer, detection by SYBR Green 단점 : DNA primer Universal reverse primer 낮은 sensitivity 많은 AT rich 서열검출하기어렵다 중간이나 5 끝의 mismatch 를식별하기어렵다 많은 panel 제품이있지만실험적인증명이부족 NEW! 샘플의양이적을경우 pre-amplification 필요 23

24 Sigma: MystiCq 장점 : RT 반응이한번에끝남 Melt curve 분석가능 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT PolyA tailing and poly dt-tag RT DNA forward primer and universal reverseprimer, detection by SYBR Green 단점 : 새로운 platform DNA primer Universal reverse primer 매우낮은 sensitivity mirnome profiling 을위해 1µ g 샘플양필요 많은 AT rich 서열검출하기어렵다 중간이나 5 끝의 mismatch 를식별하기어렵다 24

25 Exiqon 제품군 25

26 mirna array 실험흐름도 Reference Sample Mix Extract total RNA Label with Hy3 and/or Hy5 Hybridize Analyze 26

27 Expression analysis(micro Array) Hi-Power Labeling Kit mircury LNA microrna Array 검증완료된 LNA-enhanced probe를사용 높은재현성과넓은측정레인지 1 염기의 miss match도식별가능 1color, 2color 방법모두선택가능 mirbase v.19 Human, Mouse, Rat의 3100 capture probe cover 27

28 경쟁사비교 Coverage* Sensitivity Reliability Flexibility Easy Price Exiqon Affymetrix Agilent Miltenyi OneArray 28

29 Exiqon 제품군 29

Localization(Northern blot/in situ hybridization) mircury LNA microrna Detection Probes Northern blot 및 in situ hybridization의 microrna 검출 LNA probe 고감도 : 저발현의

모든 probe의 Tm값이 70 ~ 85 의범위가되도록설계되어있어특이성및감도가높습니다. 각 probe 를이용해 zebra fish 의 microrna 의검출. LNA probe 에의해 microrna 의발현을고감도에검출되었다.

30 Localization(Northern blot/in situ hybridization) mircury LNA microrna Detection Probes Northern blot 및 in situ hybridization의 microrna 검출 LNA probe 고감도 : 저발현의 microrna를검출가능 mircury LNA microrna Detection Probe는척추동물, 무척추동물, 식물의 1~2 염기의 mismatch를식별가능 mirbase에등록되어있는모든 microrna에대해 design 되어있는 LNA 기존모든 microrna에대응 probe입니다. 모든 probe의 Tm값이 70 ~ 85 의범위가되도록설계되어있어특이성및감도가높습니다. 각 probe 를이용해 zebra fish 의 microrna 의검출. LNA probe 에의해 microrna 의발현을고감도에검출되었다. (mir-122a 폐, mir-206 골격근, mir-124a 중추신경계에서특이적으로발현되고있다 ) 100% 매치, 2 염기 mismatch, 1 염기 mismatch 의 mircurylna microrna Detection Probes 를사용하고, probe 의특이성을검증. A. thaliana 의꽃 (1) 및잎 (2) 유래의 total RNA 를이용해 mir-171 을검출. 30

31 Localization(in situ hybridization) mircury LNA microrna ISH Optimization Kit(FFPE) Double DIG* 표지 LNA microrna Detection Probe로고감도, 고특이성 High throughput에서각각 microrna 해석도가능 하루만에완료할수있는신속 간편프로토콜 slide glass 위에서 FFPE 조직절편의 microrna를검출하기위한 kit!! Kit 구성 : Unique microrna LNA probe (double DIG*-labeled, kit specific) Scrambled LNA probe (double DIG*-labeled, negative control) U6 LNA probe (5 DIG*-labeled, positive control) Hybridization buffer (2x, formamide-free) Proteinase K 31

32 mircury LNA microrna ISH Optimization Kit(FFPE) 종류 32

33 MicroRNA detection 제품군 mircury LNA microrna Detection probes Control probes mircury LNA microrna ISH Optimization kits ISH Buffer set Custom probes 33

34 Exiqon 제품군 34

Functional analysis(microrna inhibitor) mircury LNA microrna Inhibitors mirbase에등록된 microrna와 Exiqon의독자적인신규microRNA인 mirplus에대해 design 완료된 inhibitor.

35 Functional analysis(microrna inhibitor) mircury LNA microrna Inhibitors mirbase에등록된 microrna와 Exiqon의독자적인신규microRNA인 mirplus에대해 design 완료된 inhibitor. AT rich microrna에대해서도높은효과발휘 뛰어난특이성과안정성으로장기간 anti sense 활성이지속 수식선택에의해 transfection 효율의조정이가능 microrna inhibitor란? * 생체내에서생성되는 microrna의 antisence로 microrna의활동을저해한다. mircury LNA microrna Inhibitors 장점 AT rich microrna에대해서도높은효과발휘 목적 microrna에대해높은 specificity 와 sensitivity Tm 값의균일화가능 ( 특정부위, 또는 microrna family별 inhibitor 가능 ) 35

36 microrna Oligo & Probe 주문방법 접속 36

37 microrna Oligo & Probe 주문방법 유저가원하는 primer, probe 직접디자인 기존에디자인되어있는 probe, primer 검색 37

38 필수공지사항!!! Customer order, pre designed primer, probe 디자인및주문에관한공지사항 납기 : 4~6주 주문서접수필수!( 주문등록하면취소불가 ) 주문서고객정보영문작성 End user 정보입력 제품주문정보확인필수 요일상관없이주문등록가능 38

SMARTer Sequencing Kits for Next Generation Sequencing

SMARTer Sequencing Kits for Next Generation Sequencing Simple, Fast, Powerful SMARTer Solution for NGS 다카라코리아바이오메디칼 1 페이지 표지분석 NGS Library 제작시의어려움을, SMARTer 기술로극복! FFPE Sample 과같은 Low input, degraded RNA 로부터 Sequencing 을가능하게! Single Cell sample 로부터 Library