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영주 오
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1 제 32 장 결핵 결핵 (tuberculosis) 이란어원은이병의해부병리적소견 ( 결절 tubercle 형성 ) 에기인하는것으로, 1839년 Johann Lukas Schoenlein이공식적으로이명칭의사용을제안하였다고한다. 결핵만큼수많은인명손실과이환의고통을준감염성질환은없다. 현재전세계인구의약 1/3이결핵에감염되어있고연간 2백만에가까운사람이결핵으로사망하며연간약 8백 80만명의신환자가발생하는데, 이중 3백 90만명은전염성이매우높은도말양성환자라고하였다 (WHO, 2004) [5]. 결핵사망자의 98%, 신환자의 95% 가개발도상국에서발생하며결핵사망자의 75% 가 15~54세이다 [6]. 우리나라도 1965년부터실시된전국결핵실태조사자료로부터추정해보면 20세이상인구의 50% 이상이결핵에감염되어있고 2004년현재 X선상활동성인결핵환자가약 18만명, 균양성인환자가약 8만명인것으로추정되며, 2003년한해동안결핵정보감시체계를통해신고된결핵신환자만도 3만6천여명이었으며같은해에결핵으로사망한사람이무려 3,352명 (7.0명/10만) 에달할정도이다 [1]. 따라서우리나라는아직도결핵이심각한상황이므로, 이질병의퇴치를위한관리방안과투자에각별한관심을가져야한다. 제 32 장결핵 419

2 병원체 결핵의원인이되는병원체는 Mycobacterium tuberculosis complex이다. 이중 M. tuberculosis가결핵의주된원인균이다. 결핵의원인균분리는 1882년 Robert Koch 에의해이루어졌으며, 처음에는이균을 Koch s tubercle bacillus 라하였는데, 1896년 Lehmann 과 Neumann 에의해 Mycobacterium tuberculosis로명명되었다. 이균종은인형 (human type) 과우형 (bovine type) 으로구분되어, 각기 Mycobacterium tuberculosis var. hominis, Mycobacterium tuberculosis var. bovis로사용되다가, 1970년에와서야 Mycobacterium tuberculosis 와 Mycobacterium bovis로균종명칭이완전히분리되었다. 비슷한시기에 M. tuberculosis와 M. bovis의중간쯤되는특성을지닌균이적도아프리카지역에서분리되었는데, 이균을 M. africanum이라명명하였다. 한편들쥐로부터분리된바있던 tubercle bacillus를서형결핵균이라명명하였다. 이들 4개균종들은한균종의변종으로간주되며, 따라서 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti를한데묶어 M. tuberculosis complex라고한다. M. bovis는소뿐아니라, 사람을포함한영장류, 개, 고양이돼지, 맹금류등에서도결핵을일으킨다. 1950년대초부터우유를살균해서먹는것이일반화되면서사람에서의발병은드물고실제로사람간전염은잘알려져있지않다. 근래에는 M. bovis를다시 M. bovis subsp. bovis와염소에서분리된바있는 M. bovis subsp. caprae로나누고있다. M. microti는사람에서의발병은현재까지 9건정도가보고되어있다 [2]. 쥐에서는전신결핵을일으키며, guinea pig이나토끼등에서는국소화된병변을형성하기도한다. M. tuberculosis도원래 Koch가분리한바있는고전형 (classical type) 과인도형혹은아시아형 (South Indian or Asian type) 으로도구분한다. M. africanum도변종 (AfricanⅠ 또는 AfricanⅡ, African subtypeⅡ는다시 UgandaⅠ 과 UgandaⅡ 로나뉘기도함.) 이보고되고있다 [4]. 대부분의경우, 결핵의주된원인균은 M. tuberculosis이며, 우리나라에서는 M. tuberculosis complex에속한균종중 M. tuberculosis 이외의균종에의한사람의결핵발병보고예는아직없다. 균종들은숙주편향성, 표현형, 병원성등에서다소차이가있긴하지만임상적으로유사한유의성을지니며, 미생물학적으로도 nucleotide의 99.9% 가유사하고 16S rrna 염기서열도동일하므로, 이들 4개균종을한데묶어한개의집단 (M. tuberculosis complex) 내에포함시키고있다. 우리나라에서는임상에서분리되는 M. tuberculosis 420 감염병실험실진단제 1 부세균질환

3 complex에소속된균종은일상검사결과를낼때는모두 M. tuberculosis로만보고하고있다. 세계보건기구 (WHO) 에서도배양검사에서 M. tuberculosis complex 양성인환자를확진된결핵환자라고정의한다. 다만결핵균배양검사가일상적으로이루어질수없는나라에서는 2회도말검사에서항산균 (AFB) 양성이면확진된결핵환자로간주할수있게하였다. 현재결핵예방목적으로널리접종되고있는백신은발병력을잃은우형결핵균의변이균주인 B.C.G (M. bovis BCG) 이다. 1. 결핵균의세균학적특성 1) 형태학적특성 0.2~0.3 2~5 μm정도크기의막대균이다. 병변조직내에있는균은대개직간균이지만간혹구상또는사상인균도있으며비운동성, 비아포형성균이다. 내성또는외성포자도생성하지않는다. 그람양성균이지만, 통상 aniline 염료에의한염색은어렵다. 강한항산성 (acidfastness) 및항알콜성 (alcoholfastness) 을나타내며 fuchsin 이나 auramin 등의 arylmethane 염료로염색된다. 인공배지상에서자란결핵균집락을현미경으로관찰하면, 분열증식한균들이서로엉켜붙은균덩어리를형성하여 (cord formation) 마치뱀이나새끼줄처럼보이는데, 이것을균색 (serpentine cord) 이라한다. 고체배지상균집락은대체로담황색의거칠고조잡한표면을가지며, 계면활성제가포함되지않은액체배지에서는표면에균이엉켜서자란다 (pellicle 형성 ). 2) 생물화학적특성편성호기성균으로최적조건하에서의세대시간은 14~15시간으로발육이매우느리다. 최적발육온도는 37, 최적 ph는 6.4~7.0이며, 발육에는 140 mm HgPO 2 가최적이고, 초기발육시 5~10% CO 2 를포함시발육이촉진된다. 내독소또는외독소를생성하지않는다. 결핵균의염색성은매우특이하다. 약 20 μm두께의세포벽에는 60% 이상의지방을함유하는소수성이라염료가잘침투하지않아석탄산과같은매염제를염색액에첨가해주어야비로소염료가지방에용해되어균세포내로확산되어들어갈수있다. 일단균세포내로침투한염료는 acidalcohol과같은강한탈색제로처리해도탈색되지않고남게된다. 이와같은독특한염색성을항산성염색성이라하고항산성염색방법으로관찰되는균을항산 ( 성 ) 균 (AFB=acidfast bacillus) 이라한다. 항산성 제 32 장결핵 421

4 염색성을띄는항산균에는많은균종이있는데, 사람에게병을일으키는대표적인균이결핵균과나균이다. 비결핵항산균, Rhodococcus, Nocardia, Legionella micdadei, Cryptosporidium, Isopora, Cyclospora 등의 cyst, Microsporidium 의아포도다양한형태의항산성을나타낸다. 항산균의염색성은 mycolic acid와같은독특한지방산이주축이되는지방화합물이세포벽에많이함유하고있기때문에나타나는성상이며, 그러한염색성을이용하여객담을비롯한각종병리검체내에들어있는결핵균을선택적으로염색하여찾을수있게된다. 지방함량이높은세포벽으로인해나타나는균의또다른특성은물리화학적으로매우유독한환경에서오랫동안생존해있을수있다는점이다. 예를들면건조한객담내의균은빛이있는상온에서는몇주정도만생존할수있지만, 빛이없는찬곳에서는 1년이상생존이가능하다. 그러나열과빛에는약하다. 또, 결핵균은각종소독제에대해서도다른균들에비해저항력이강할뿐아니라, 강한산이나알칼리로처리해도오랫동안생존해있을수있다. 대부분의 mycobacteria가 catalase 활성을나타내지만생성량에차이가있고, 결핵균의 catalase는가열 (68 ) 에의해파괴된다. 결핵균과는달리신속발육균은 arylsulfatase 에강한활성을나타낸다. 결핵균은 niacin 양성반응을나타내고 (95%), nitrate를환원시키며 (97%), 대체로 tween 가수분해 (hydrolysis) 능력이있다 (68%). 염색체의 GC 함량은 66% 로높으며, 전유전체의염기서열이밝혀져있는데 (1998년) 크기는약 4.4Mb이다. 결핵균이생성하는지질 (lipid) 은매우다양하고복잡하며지방대사에관여하고있는효소만도 E. coli는 50여종에불과함에비해결핵균에서는 250여종이상이밝혀져있다. 세포벽내의 mycolic acids, lipoarabinomannan (LAM), acetylated trehaloses, mycosides, 인지질 (phospholipids) 등은균의면역학적, 병리학적, 생리학적특성발현과도매우유관한것으로알려져있다. M. tuberculosis H37Rv ( 표준인형결핵균 ) 를대상으로조사된바로는삽입서열 (IS=insertion sequences) 이유전체중약 70kb를차지하며, 10여종이상의삽입인자가알려져있는데, 그중 IS6110 등은결핵균주간의구분에널리활용되고있다. 3) 면역학적특성결핵균은호기성통성세포내기생균으로객담비말핵등을통하여호흡세기관지나폐포에도달하여폐포대식구 (mononuclear phagocytes) 에탐식되면결핵균체표분자와 Fc receptor (FcR), complement receptor (CR), macrophage mannose receptor (MMR), surfactant protein receptor, CD14과같은다양한숙주 receptor들과의결합 422 감염병실험실진단제 1 부세균질환

5 을초래한다. 이러한상호작용에는 Tolllike receptor (TLR)2와 TLR4 및균체의 lipoarabinomannan 등이관여하고있다. Mycobacteria가대식세포로진입시, 어떤 receptor를선택하느냐는것은면역반응에도영향을주는것으로보고되고있다. 결핵균의대식세포로의진입은결핵균이숙주세포내에서일종의세포내거점을마련하는방법으로결핵균이성공적으로증식속도와대사활동을줄이고숙주방어기전과의직접적인대항을피하는휴면상태로전환된다. 초감염부위에휴면상태의균을함유한채, 인체면역기전의작용을피해아무런임상증상을나타내지않고있는상태를잠복기결핵이라고한다. 고령, 영양결핍, steroid 투여나 HIV 감염등에서처럼면역반응과이들균간의균형을깨는상황이발생하면, 잠복기상태의결핵균은재활성화되어임상적으로발현된다. 결핵균에는다양한항원성분들 (cytoplasmicsoluble antigens 와 cellwall lipid bound insoluble antigens) 이알려져있는데, 결핵균의배양여액이나균체로부터얻은항원 ( 예 :tuberculin) 은지연성과민반응을나타내며, 속내균간에서도항원에따른교차반응의범위가넓다. 결핵균주간의혈청학적구분은자가응집반응으로인해불가능하다. 2. 분류 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis complex) 은 Mycobactericeae과의유일한속이다. Mycobacterium 속에는결핵균과나균 (M. leprae) 외에도약 100개에이르는균종이있는데, 결핵균과나균외의균종들은통칭비결핵항산균또는비결핵마이코박테리아 (NTM, Nontuberculous mycobacteria) 또는결핵균외마이코박테리아 (MOTT, Mycobacteria other than M. tuberculosis) 등으로불리고있다. NTM은대부분병원성이없거나또는기회감염균이라고알려져있지만, 결핵이감소하면서이들균종이원인이되어발병하는환자수는증가하는경향이며, 우리나라에서는 M. intracellulare, M abscessus, M. fortuitum complex, M avium, M. kansassi 등균종에의한발병이보고되고있다. 임상증상 결핵은전신감염증으로주된감염부위에따라임상증상및징후는매우다양하게나타난다. HIV 감염의유행이있기전까지는대체로 85% 의결핵이폐결핵이었고나머 제 32 장결핵 423

6 지는폐외결핵또는폐및폐외결핵이병발한환자였다. 우리나라는신고된환자를기준시 88% 가폐결핵이다. 일반적공통증상으로는발열이가장많고그외전신피로감, 식은땀, 체중감소등이따른다. 폐결핵에서는기침이주증상이고진행되면가래와혈담및흉통등이나타나기도하고심한경우호흡곤란도보인다. 폐결핵에만특이한이학적국소소견은없다. 거의모든폐결핵에서는흉부 X선사진으로이상음영을볼수있게된다. 흉막, 임파선, 복부, 요도, 피부, 관절, 골의결핵과결핵성뇌막염등에서는일반적인공통증상외에침범장기에다른증상을나타낸다. 예를들어결핵성뇌막염일경우는두통, 오심, 구토, 의식혼미등이따를수있고, 결핵성늑막염에서는흉통과호흡곤란등이있게된다. 역학 결핵의주감염원은도말양성인폐결핵환자이다. 이들의기침이나재채기등을통해결핵균이들어있는비말핵이배출되고, 대체로 5 μm이하의비말핵이호흡기도로들어가서 1~3마리의결핵균만이라도호흡세기관지나폐포에도달하면감염을일으킬수있다고본다. 면역기능이저하된사람은더쉽게감염되며, 감염후의발병도더용이하다. 전염성환자라도적절한화학치료를받으면단시간내에전염성이소실된다. 감염으로부터발병과진행은네단계로나누어설명되고있다. 제 1기 (phaseⅠ, transmission) 는결핵균을함유한비말핵이호흡세기관지나폐포에도달, 초기의숙주방어능력을극복하여폐포대식구 (macrophage) 에서증식하게되는감염기이고, 제 2기는조기증식과확산 (phaseⅡ, early proliferation and spread) 이이루어지는시기이며, 제 3기는숙주면역반응이발전되는시기 (phaseⅢ, evolution of host immune response) 로세포면역의형성과과민반응을나타내게되며, T세포에의해활성화된대식세포가육아종을형성, 결핵균의증식과전파를억제하며초감염결핵은치유된다. 감염된사람중의 10% 가활동성결핵으로진전하며, 이들의절반은 2년내에발병한다. 폐의병변이재활성화하고병변이액화를거쳐공동을형성하게되며, 이때결핵균은기하학적으로증식하여새로운전염성환자를만들어내게된다. 이러한액화및증식촉진이일어나는시기를제 4기 (phaseⅣ, liquefaction and accelerated bacillary proliferation) 라한다. 결핵의감염은결핵균에노출되는정도, 빈도, 또는기간에크게영향을받으며, 개체의연령, 면역및영양상태, 병존질병 (intercurrent disease), 균의 424 감염병실험실진단제 1 부세균질환

7 독력, 숙주의유전적요소등에도관련성이있다. 결핵의감염을알아내는데는 tuberculin 반응검사가있으며, 결핵균의전파는결핵감염위험률이라는지표로나타낸다. 균양성폐결핵환자의자연경과를보면, 대체로균양성환자의 1/2은 5년내에사망하고, 20% 정도는만성배균상태로, 30% 정도는자연적균음전을이루는것으로보고되어있다. 화학요법이전시대의자료에의하면신고된환자중약 1/2이사망하였다. 예방및관리 1. 예방 결핵예방은감염예방과발병예방으로나눌수있다. 그러나감염예방이란실제로어렵고, 특히우리나라처럼결핵이만연하고있는지역에서는결핵에감염되더라도발병하지않도록하는것이일반적예방조치라고할수있다. 일반적으로발병위험이높은대상자에대한예방화학치료와결핵균에감염되기전에실시하는예방접종방법이있다. 전염성결핵환자에게노출되었다해도그중 35~65% 만감염되며, 감염자중에서도약 10% 만일생에걸쳐서발병하므로, 감염개체모두가예방치료대상이될수는없고, 고위험군만대상이될것이다. HIV 감염자, 규폐증, 엑스선상섬유화된결핵반흔이있는사람, 체중이정상보다 5% 이상미달인사람, 그리고당뇨병, 만성신부전증, 위절제술, 장기이식을받은사람, 두경부의악성질환이있는사람등은비교위험도가높다. 또한영유아의발병률이높으며, 20세전후의젊은연령층에서도발병률이높다. 세계보건기구 (WHO) 가정한예방치료대상자는어머니가폐결핵을앓고있는신생아, 균양성폐결핵환자와접촉한가족내 5세이하어린이, HIV 감염자등이다. 치료방법은 INH를 5~10 mg /Kg의용량으로 6개월간투여하며, INH 내성에대한의심이생길때는 RMP과 PZA를 2개월투여할수있다. 현재는 BCG와같이약독화된균을사용하고있는데, 최대의예방효과를얻어내려면유효한백신을정확한접종기법에따라정확한양을접종하여야한다. 백신의유효성은균주, 역가 ( 생균수비율 ) 및보존상태등에의해결정된다. 결핵균이나비결핵마이코박테리아에노출되기전에접종하면높은예방효과가기대되며, 특히증상이심한속립성결핵이나결핵성뇌막염은 52~90% 가 BCG 접종으로예방되는것으로확신하고있다. BCG에의한일반적결핵발병예방효과는매우다양한데, 우리나라에서 제 32 장결핵 425

8 는약 74% 인것으로관찰되었다. BCG 접종은 1회로충분하며, 추가접종으로성인결핵발생을예방하기는어렵다. 2. 관리 결핵은확실한진단수단과치료방법, 그리고예방방법이잘확립되어있으며이방법들모두가비용효과가매우높은것으로판명되어있어, 결핵관리에대한계획과집행을제대로만해나간다면, 매우성공적인결과를얻을수가있다. 결핵의예방, 환자의발견, 그리고발견된환자의치료를통한건강인으로서의사회복귀를목적으로국가가수행하고있는결핵관리사업에대해, 세계보건기구는다음과같은네가지관리원칙을제시하고있다. 첫째, 지역적으로편중되지말고전국적으로실시되어야하며, 둘째, 감염된집단에서새로운환자가계속발생하는것이므로결핵이근절될때까지지속적으로관리를실시하여야하며, 셋째, 국민이결핵사업을믿고적극적으로참여할수있도록국민의요구에부응하여야하며, 넷째, 지역사회의보건조직에통합, 다른보건사업과균형있게추진해야한다는것이다. 실험실진단 1. 검체의종류 결핵균검사에이용되는 85% 의검체는호흡기로부터얻는객담이다. 그외기관지폐포세정 (bronchoalveolar lavage), 기관지세척액, 위세정액, 혈액, 요, 분변, 체액, 조직 ( 임프절, 피부, 기타생검조직 ), 농양내용물등이있다. 2. 검체의채취방법및보관 검체의채취때는, 운송중에뚜껑이열리지않도록고안된무균처리되어있는용기를사용하여야하며, 검체및환자를구분할수있도록적절하게표시하여야한다. 채취된검체는검사전까지냉장보관하도록한다. 426 감염병실험실진단제 1 부세균질환

9 1) 객담객담은폐결핵환자로부터얻을수있는가장중요한검체로가능한항결핵제를복용하기전에채취하며, 아침에기상하여공복상태에서채취하는재가채담이가장바람직하다. 첫객담은반드시즉석에서채취한다. 한환자로부터채취할검체권고횟수는 3회이며, 최소 2회는채취하여야한다. 육안으로점액농양인객담을채취하도록한다. 2) 체액 ( 척수액, 흉막액, 심랑액, 관절액, 혈액, 골수등 ) 멸균된용기에무균적으로채취하여야한다. 혈액은약 5 ml, 뇌척수액은 2 ml이상을취한다. 응고성체액은멸균 potassium oxalate (10% neutral oxalate 0.01~0.02 ml / 체액ml ), 또는 heparin (0.2 mg / ml ) 을가한다. 가능한빨리검사실로보낸다. 3) 무균적으로채취된조직등조직은약 1 g을채취하여멸균용기에넣는다. 고정액이나보존액은첨가하지않는다. 수송중건조될염려가있을때는멸균생리식염수를넣도록하며, 운송용포장용기에는 dry ice를채우거나 4~15 의온도를유지하여신속히검사실로보낸다. 4) 기타이미오염되어있거나오염이우려되는검체요는가장흔한폐외검체의하나이다. 오염을최소화하기위해, 요채취전외부생식기를깨끗이씻고채취된검체는즉시검사하지못할경우에는바로냉장보관해야한다. 3회에걸쳐, 이른아침배뇨시의중간뇨를최소 40 ml은받도록한다. 분변은최소 1g 이상이어야한다. 3. 검사방법 결핵균검출을위한방법에는, 기본적으로도말검사와배양검사가있다. 결핵균의핵산을증폭시켜검출하는 PCR법도필요시부가할수있는방법이다. 균의발육시에생성되는대사산물측정을통해, 균의존재나약제내성여부를확인하는검사법도개발되어있다. 결핵균의특이항체를증명하여결핵을진단하려는혈청학적방법은매우제한된용도외에는아직추천되지않고있다. 그외 mycobacteria 균종의동정검사와항결핵제감수성검사등에도전통적방법과함께다양한분자생물학적기법들이개발 제 32 장결핵 427

10 되어활용되고있다. 또, RFLP (restriction fragment length polymorphism) 에의한결핵균주간구분을위한 DNA fingerprinting 등도그유용성이높다. 여기서는 WHO 및국제항결핵및흉부질환연맹 (IUATLD) 등에서제시한방법을기준으로기술한다. 1) 도말검사가장기초적이며전염성환자를찾아내는데매우중요한검사이다. Slide에검체를도말하여 carbolfuchsin 또는형광염료로염색후, 검경한다. 결과는 AFB (acidfast bacillus) 양성또는음성으로보고한다. 환경에부생하는결핵균외다른 mycobacteria 나 Nocardia 균종, Bacillus subtilis의아포등도항산성염색상을나타낼수있기때문에도말검사양성 (AFB 양성 ) 이라도반드시결핵균의검출을의미하는것은아님에유의한다. 1 도말방법객담일경우점액농양부위등을미생물검사용백금이로따서새슬라이드중앙에약 cm크기로고르게도말한다. 한슬라이드에 2개이상검체를도말해서는안된다. 늑막액이나뇌척수액등은원심분리후의침사를도말에사용하나검사중도말면이잘떨어져나가므로조심해야한다. 요나위세척액등은결핵균외의항산성균이검출되기쉬우므로도말검사의신빙성이없다. 도말된검체는 15분이상자연건조시킨다음, 도말면을윗쪽으로하여화염위로 4초간 5회통과시키거나, 또는슬라이드건조기를사용, 65~75 에서약 2시간이상작용시켜고정한다. 2 항산성염색 (acidfast staining) Auramine 등을이용하는형광염료 (fluorochrome) 염색도가능하나, 가장보편적으로사용되는것이 ZiehlNeelsen 염색법이다. 염색방법은 slide 상의도말면에염색액을충분히붓고수증기가올라올때까지가온하여수증기가올라오는상태에서 3~5분간염색한다. 이후흐르는물로염색액을완전히씻어낸뒤, 탈색액을가하여 3분간탈색한다. 같은방법으로다시씻어낸뒤, 약 60초간대비염색을한다. 완전히씻어내고도말면을자연건조시킨후에검경한다. 검경판독방법은반드시체계적이고표준화된방법으로읽어야한다. 음성은유침렌즈 100 배율하에서최소 100시야는검경된후보고되어야한다. IUATLD 기준에의한검경결과의기록은 No. AFB/100 시야 : 0/negative ( 또는 ), 1~9 AFB/100 시야 : 실수기록 (actual AFB counts), 10~99 AFB/100 시야 :1( 또는 ), 1~10 AFB/ 시야 (50시야이상에서 ):2( 또는 ), 428 감염병실험실진단제 1 부세균질환

11 >10 AFB/ 시야 (20 시야이상에서 ):3( 또는 ) 과같이한다. 2) 배양검사소수배균자를찾아내거나, 항산성염색결과가의심스러울때, 균동정검사나약제감수성검사등을위해균분리가필요할때에배양검사를실시한다. 결핵균의분리는계란을기초로한배지 (eggbased media) 또는한천을가한배지 (agarbased media) 등이주로이용된다. LowensteinJensen 배지나 Ogawa 배지는계란을이용해고체화시킨대표적인배지이고, Middlebrook 7H10 또는 7H11 등은한천이첨가된배지이다. 액체배지로는 Middlebrook 7H9 또는 Dubos broth, Sauton 배지등이흔히쓰인다. 균발육중의대사산물을측정하여발육여부를확인하는 BACTEC 또는 MGIT (The mycobacteria Growth Indicator Tube) 등방법들도상품화되어있다. 균을분리배양시에는검체의오염여부가검체처리과정을결정짓는다. 객담처럼오염된검체에서결핵균을분리하고자할때는 2~4% NaOH 등으로미리검체를처리하여잡균에의한오염을방지한다. 접종시검체당최소 2개의배지는사용하여야하고, M. bovis를분리배양하려면 pyruvate를첨가한배지를추가로사용하여야한다. 계란첨가고체배지를이용할경우접종후보통 8주까지배양결과를관찰하는데, 배양 4주전후해서성숙된균집락형성이관찰되기시작한다. 집균하여검사하고자할때는, 8~ 10 에서최소 3,000 g로 15분간원심분리해서얻은침사를이용한다. 결핵균배양검사는반드시적절한장비 (BSC, Biological safety cabinet, Class Ⅰ 또는 Ⅱ) 를갖춘검사실에서실시되어야한다. Sodium hydroxide (Modified Petroff) 법은 sodium hydroxide pellets (analytical grade) 4g을증류수 100 ml에넣고용해시킨다음, 121 에서 15분간고압멸균하면수주간사용할수있다. NaOH 처리는강력한오염원제거법이지만, 동시에검체내결핵균도약 60% 까지죽일수있다. 방법은단단한나사마개를가진용기에검체 ( 객담 ) 와동량의 4% NaOH 용액을넣고잘흔들어섞은다음 ( 또는 vortex mixer로수초간진탕 ) 15분정도실온에서전처리한다. 전처리된검체약 0.1 ml량을 2% Ogawa (Modified Ogawa) 또는 3% Ogawa 배지에직접접종하여 37 에서배양한다. LowensteinJensen배지등중성배지에접종하려면, 전처리된객담에멸균증류수또는멸균생리식염수등을섞어서 3,000 g에서 15분간의원심분리하여, NaOH 성분을씻어낸침사를배지에접종할수도있다 ( 집균법 ). 기타배양방법으로는검체내의결핵균에대한전처리에따른독작용을약화시키기 제 32 장결핵 429

12 위한방법으로, NaOH법대신흔히 NALCNaOH (NacetylLcysteinesodium hydroxide) 법이이용된다. NALC는점액용해작용이있으므로 NaOH 농도를낮출수있게한다. 또 alkali로는제거되지않는 Pseudomonas 균종등으로오염된검체는 oxalic acid 처리가도움이되며, 요등은 sulphuric acid 처리가유리하다. 액상인검체는원심분리후의침사를검사에이용하는것이보편적이며, 뇌척수액처럼원심분리후에도침사가잘관찰되지않을때에는 20% 멸균 sulphosalycylic acid를떨구어주면혼탁양이관찰되는데, 이를원심분리하면침사를얻을수도있다. 배양검사결과의보고방법고체배지에서분리배양된 mycobacteria의보고시에는반드시결핵균 (M. tuberculosis complex) 인지 NTM인지를구분하여정성적 ( 양성인지음성인지 ) 이며정량적 ( 발육균수의표시 ) 으로표시되어야한다. WHO/IUATLD 에서제시된보고기준을따르면다음과같다 ( 표 1). 3) 균동정검사결핵균의분리배양검사를수행하고있는검사실은 mycobacteria에대한동정검사를할수있어야한다. 특히다른 mycobacteria로부터결핵균만은반드시감별해낼수있어야한다. 결핵균은균의발육온도, 발육속도, 균집락형태나현미경소견등과아울러전통적으로균동정에이용하고있는 niacin생성, TCH (thiophene2 carboxylic acid hydrazide) 함유배지상발육, catalase 68 내열성시험, PNB배지 (paranitro benzoic acid) 발육여부등몇가지생화학적시험을부가하면비교적다른 mycobacteria로부터용이하고정확하게감별, 동정해낼수가있다. 결핵균이외의 mycobacteria 균종중에서도임상적으로유의한균종들이많이있기때문에, 경우에따라서는이들에대해서도정확한동정이요구되고있다. 우리나라사람들의검체로부터는특히 M. intracellulare 등이많이분리되고있다. 분자생물학적방법등을이용해 NTM을신속하고정확하게동정해낼수있는방법도개발되어있으며 [3], 현재활용이가능하다. 430 감염병실험실진단제 1 부세균질환

13 표 1. 배양검사결과의 WHO/IUATLD 기준 판독 No growth 1~19 colonies 20~100 colonies 100~200 colonies 200~500 colonies (almost confluent growth) >500 colonies (confluent growth) Contaminated 보고 Negative ( 음성 ) Positive ( 양성, 균집락수 ) Positive (1) Positive (2) Positive (3) Positive (4) Contaminated ( 오염 ) 표 2. Mycobacteria 균종에따른생화학적특성 M. tuberculosis M. africanum M. bovis M. microti MOTT Niacin Nitratase 68 catalase Pyrazinamidase PNB TCH * / ** ⅴ / # * Classical, **Asian, # differences owing to species, v=variable 1 일반적특성결핵균외의 mycobacteria 균종들중에는고체배지에서도접종 7일이내에성숙된균집락을형성하는균종 ( 신속발육균군 Rapid grower) 이있고, 집락의형태가매끈하고부드럽거나색상이노란색또는오렌지색을띄기도하며 ( 암증색균군, Scotochromogen), 빛에노출될때만그런색상을내는균종이있는가하면 ( 광증색균군, Photochromogen), 발육온도범위도 17~52 로다양하므로, 결핵균과여러면에서대비가된다. 이런특성들을잘이용하면결핵균의구분이더욱용이해진다. 2 Niacin (nicotinic acid) 시험 Niacin은모든 mycobacteria의대사과정중산화환원반응에중요역할을하며모든 mycobacteria가 niacin을생성하지만, 대사경로상차이로결핵균이가장많은 niacin을축적하게되므로이를결핵균동정검사에활용하고있다. M. tuberculosis 제 32 장결핵 431

14 외에는거의모든 mycobacteria가음성반응을나타낸다. 검사는양성대조용으로는 M. tuberculosis H37Rv가자란배지를, 음성대조용으로는균이접종되지않은배지, 그리고 M. intracellulare처럼 niacin 음성반응을보이는균종을시험균과동시에사용한다. 많은균이양호하게자라고있는배지표면에 1 ml의멸균증류수를붓는다. 배지전면에물이덮힐수있도록수평위치로약 30분간둔다음, 5분간직립시켜수분이바닥에내려오게하고, 0.5 ml을뽑아깨끗한나사마개시험관에옮긴다. 여기에 0.5 ml의 4% aniline 용액과 0.5 ml의 10% cyanogen bromide 용액을가하고, 시험관의마개를닫은다음색상변화를관찰한다. 5분내에노란색상이두시약사이에고리모양으로 ( 흔들지않았을때 ) 나타나면양성반응이다. 검사가끝난시험관내시액에는 2~3 ml의 4% NaOH을넣어버리도록한다. 3 Heat labile catalase 시험 (68, ph 7) Mycobacteria는몇가지종류의 catalase를가지고있는데, 열에대한안정성이다양하다. 결핵균은 68 로 20분간가열하면 catalase를상실하게되지만, 대부분결핵균외 mycobacteria는유지된다. 시험시음성대조균으로는 M. tuberculosis나 M. gastri 양성대조균으로는 M. gordonae나 M. terrae를시험균과함께사용하도록한다. 검사는멸균 pipette을이용, 무균적으로 0.5 ml의 0.067M phosphate buffer (ph 7.0) 을 mm나사마개시험관에넣은다음, 멸균백금이로시험균을수회가득따서완충액에풀어넣는다. 균이들어있는시험관을 68 수조에넣고, 20분간작용시키고실온에서식힌후바로만든 Tweenperoxide 혼합액 0.5 ml을가한뒤거품형성을관찰한다. 거품이생기면양성이다. Tween 80도거품을만들수있기때문에반응중인시험관을흔들면안된다. 음성일경우, 20분정도더관찰후버린다. 4 Nitrate 환원시험결핵균은 nitrate 환원력이가장강력한 mycobacteria 균종중의하나이다. 계대배양된지 4주된배양균을시험에사용하며, 신속발육균종일경우는계대배양후 2주된균을검사에이용한다. 시험용시약은제조후냉암소에보관한다. 색상이변하거나침전물이생긴것은버리고새로만든다. 검사는양성대조균으로 M. tuberculosis, 음성대조로는 M. bovis (BCG) 또는 M. intracellulare 균과균이함유되지않은시약을시험균과동시에사용한다. 0.2 ml의멸균증류수를 mm나사마개시험관에넣고, 계란고체배지에서 4주배양된균을 spade 가득따서증류수에잘섞어넣는다. 여기에 NaNO 3 기질 2.0 ml를 432 감염병실험실진단제 1 부세균질환

15 가하고, 손으로잘흔든다음, 직립상태로 37 항온조에서 2시간동안반응시킨후시험관에 (Nitrate reduction test 시액 #1) 을 1방울, ( 시액 #2) 와 ( 시액 #3) 을차례대로각기 2방울씩을떨어뜨려서즉시색상변화를관찰한다. pink 색상이나타나면양성, 색상변화가없을때는 zinc 분말을소량가하여보는데, 이때 pink 색상이나타나면진짜음성이고, 반응이없으면실제로는양성으로간주되므로재검을요한다. 5 Thiophen2Carboxylic Acid Hydrazide (TCH) 감수성이검사는 M. tuberculosis를 M. bovis로부터구분하는검사로, M. bovis, M. africanum, M. microti 는 TCH 15 μg / ml함유배지에서감수성이나결핵균을포함한대부분다른 mycobacteria는잘자란다. BCG 탁도정도로조정된균액을 10 3 과 10 5 배희석하여 TCH 함유및비함유대조배지에접종하고배양한다음, 대조배지균수의 1% 이상이 TCH함유배지에서자라면내성인것으로간주한다. 6 pnitrobenzoic acid (PNB) 배지상균발육 PNB 500μg / ml함유배지에서는 M. tuberculosis complex와 M. xenopi, M. haemophilum 등은감수성이지만다른 mycobacteria 균종들은모두내성을나타내므로, M. tuberculosis와 MOTT를구분하는데유용한검사이다. 7 Pyrazinamidase 시험 Pyrazinamide (PZA) 를 pyrazoinic acid와 ammonia로분해하는효소로서, M. tuberculosis complex 중 M. tuberculosis만양성이며, 그외대부분 mycobacteria 는양성이지만, M. ulcerans, M. gastri, M. kansasii, M. asiaticum 등은음성이다. 4) 약제감수성검사항결핵약제에대한감수성검사는특히재치료대상환자이거나다제내성균에의한발병이의심되는환자의처방선정을위해서이용된다. 일과성내성등을잘못해석하여치료중처방변경이발생하지않도록감수성검사의뢰는신중해야한다. 방법으로는내성비율법 (proportion method), 절대농도법 (absolute concentration method), 내성비례법 (resistant ratio method) 등이있고이중내성비율법이나절대농도법이주로이용되고있다. 내성비율법은내성균분포비율을추정할수있는장점이있고, 절대농도법에서는접종균액의적정조정이매우중요하다. 또객담등검체를배양과동시에감수성검사를실시하는직접법도있는데, 검체내함유된생균수가적정수이상이되어 제 32 장결핵 433

16 야지만이용가능하다. 절대농도법을사용시는최종접종된균수가약 2천개범위가되도록해야하며이때판정기준농도에서 20개이상의균이자랄경우에내성으로간주한다. 내성비율법에서는최소 2개이상희석배율이다른균액을접종하며, 대조배지에서자란균으로부터약제함유배지에자란균수 ( 내성인균수 ) 의비율을추정하여내성여부를결정한다. 이경우만일내성균의분포 1% 이상을내성으로판정하겠다면, 희석된균액으로접종된약제비함유대조배지상에발육된균집락수가 100개정도일때가판정여건으로보아서는가장이상적이나이는아마도불가능하다. 그러므로균액의많이희석된균액에서자란대조배지상균수로부터희석배율이낮은균액이접종된대조배지에자란균수를희석배율로부터추정하게되며, 이를분모로하여약제함유배지상균수의비율 (%) 을계산한다. 예를들어희석액내의균함량이 10 1 mg / ml인시험용균액을멸균증류수등으로 100배 ( 저희석배율 ) 와 10,000배 ( 고희석배율 ) 로희석하어접종했을때, 최종접종균액농도는 10 3 mg / ml과 10 5 mg / ml이되며, 고희석배율로접종된대조배지에서 20개균집락이관찰되었다면, 저희석배율로접종된대조배지상의균수는아마도 2,000개 (20 100배 ) 범위일것으로추정할수있다. 이저배율의시험균액이접종된약제함유배지에서자란균수가 20개라면, 내성균수는 1% (20/2, ) 라는추정이가능하다. 현재결핵연구원에서사용하고있는 Lowenstein Jensen 배지를이용한항결핵약제의감수성검사용판정기준농도는표 3과같다. 단, PZA에서는응고전배지의 ph를 4.85 범위로조정해야하며, 균동정검사에서사용하는 pyrazinamidase 시험으로감수성검사를대체할수도있다. 표 3. 약제감수성검사시의정량적인균발육의기록과보고 판독 Less than 50 colonies 50~100 colonies 100~200 colonies 200~500 colonies (almost confluent) 500 or more colonies (confluent) Contaminated 보고 Actual count Contaminated 항결핵약제감수성검사시사용되는판정기준농도는 Isoniazid (INH) 0.2 μg / ml, Rifampicin (RMP) 40.0 μg / ml, Ethambutol 2.0 μg / ml, Streptomycin 4.0 μg / ml, 434 감염병실험실진단제 1 부세균질환

17 Ethionamide 40.0 μg / ml, Kanamycin 40.0 μg / ml, Capreomycin 40.0 μg / ml, DCycloserine 30.0 μg / ml, paminosalicylic acid 1.0 μg / ml, Ofloxacin 2.0 μg / ml, Pyrazinamide μg / ml이다. 초치료약제이외의항결핵제나 NTM 균종등에대해서는세계적으로보편성있는판정기준농도등을포함하는표준화된감수성검사방법이아직설정되어있지않고검토단계에있다. 전세계에서선정된소위국제적항결핵약제표준검사소 (Supranational Reference Laboratories, SRL) 들간에실시된수년동안의정도관리결과를비교해보더라도, 초치료제중에서도 INH와 RMP의감수성검사는일반적으로검사실간일치율과정확성이매우높은편이나, ethambutol이나 streptomycin은그렇지못하다. 세계여러국가의중앙검사실단위의검사실도검사결과의정확도가 70% 이하일때가적지않다. 따라서결핵균에대한약제감수성검사는내 외부정도관리가정기적으로잘수행되고, 능력이공인된검사실단위에서만실시하여야한다. 현재결핵연구원미생물부는세계보건기구및국제항결핵및폐질환연맹 (IUATLD) 에서지정한국제적표준검사소이며전세계여러나라에서수행되는항결핵약제의감수성검사에대한자문과요원훈련및정도관리업무를수행하고있다. 주로발육중에있는균의대사산물의측정에의한, 반자동또는자동화된장비를이용하는개량된방법들도많이있으나, 검사가능한약제들이대개몇개의초치료제에국한되어있고, 최근개발된상품화된방법중에는이전에나온방법보다정확도가떨어지면서도값은더비싼경우가있어선택에유의하여야한다. 근래들어약제별내성과관련이있는특이유전자의돌연변이로부터약제의내성여부를확인하는방법이많이개발되어있다. INH에대해서는 katg, inha, oxyrahpc 등유전자부위, RMP 에서는 rpob, fluoroquinolone계에서는 gyra, PZA는 pnca 등부위가내성과관련이있다. 지역에따라내성결핵균주별유전자변화의부위별분포차가인정되고있는데, 우리나라에서는 katg 유전자부위를표적으로하면 INH 내성균의약 70% 는검출가능한것으로, katg와 inha 유전자를동시에이용하면 INH 내성균의 80% 이상을검출해낼수있는것으로보고되고있다. 일반적으로 RMP 내성균에서는약 95% 이상이 rpob와유관된것으로, ofloxacin 등은 gyra와약 90%, PZA는 pnca와약 70% 이상관련된것으로보고되고있다. 유전자부위를표적으로한분자생물학적검사방법중 RMP이정확도가가장높은것으로보고되고있고상품화되어있다. INH와 RMP 내성을동시에확인할수있는방법이결핵연구원에서도개발되어있다. 제 32 장결핵 435

18 약제감수성결과의보고방법상품화된반자동또는자동화된검사에서는각기제시된결과판독과보고방법을따른다. 고체배지에서수행되는감수성검사에서는반드시대조배지 ( 약제비함유배지 ) 와약제함유배지에서의균발육을정량적으로기재한뒤, 정성적결과 ( 감수성인지내성인지 ) 를표시함이일반적이다. 내성비율법으로검사한경우는약제별내성률을기재하여야하나번잡스럽고실제임상에서활용도가떨어져대개정성적보고로제한된다. 일반적으로약제감수성검사시의정량적인균발육의기록과그보고방법은배양검사결과보고시와거의같다 ( 표 3). 오염으로검사결과를낼수없지만재검사로결과를얻을가능성이있을때는 오염으로재검사중 이라거나, 재검사로결과를얻을수없을경우에는검체를다시의뢰해줄것을통보하여야한다. 참고문헌 1) 통계청 : 사망원인통계연보, ) Kaufmann SHE and Hahn H:Mycobacteria and TB. Karger AG, Basel, ) Lee HY, Bang HY, Bai GH, Cho SN:Novel polymorphic region of the rpob gene containing Mycobacterium speciesspecific sequences and its use in identification of mycobacteria. J Clin Microbiol 2003, 41(5): ) Sola C, Rastogi N, Gutierrez MC, Brosch R, and Parsons L:Is Mycobacterium africanum subtype Ⅱ(UgandaⅠ and UgandaⅡ) a genetically welldefined subspecies of Mycobacterium tuberculosis complex? J Clin Microbiol 2003, 41(3): ) WHO:WHO Report 2004/Global Tuberculosis Control/Surveillance, Planning, Financing, WHO/CDC/TB/ , WHO, Geneva, ) William NR and Stuart MG:Tuberculosis, 2nd ed. Lippincott Williams & Wilkins, 감염병실험실진단제 1 부세균질환

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<B0E6C8F1B4EBB3BBB0FAC0D3BBF3B0ADC1C E687770> 개원의와함께하는임상강좌 2011 결핵이야기 : NTM 을중심으로 경희대학교의과대학호흡기내과학교실 박명재 1 막 : 결핵의역학 OECD 가입국의결핵발생률추계 (2006 년, 29 개국 ) 국가 결핵발생률 (/10 5 ) 도말양성결핵발생률 (/10 5 ) 국가 결핵발생률 (/10 5 ) 도말양성결핵발생률 (/10 5 ) 한국 88 40 이탈리아 7 3 일본 22