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다안 송
6 years ago
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1 Interchapeter B : 핵산생물공학기술 (part A) Recombinant DNA techniques - 전기영동 - 제한효소 - 클로닝 - 대장균을이용한단백질대량생산

2 Agarose mesh DNA 분리기술 : Agarose Gel Electrophoresis ( 수평형 ) _ + DNA is negatively charged from the phosphate backbone DNA : e/m 대략일정 - 분자량작은것이빨리이동 ( 분자체 : sieve) Visualize DNA with ethidium bromide fluoresces orange ONLY when bound to DNA

EtBr stained DNA 한천 : 해초에서얻어지는고분자물질의다당체. 0.6 0.8% 에서는반고체로, 1.0% 이상에서는단단하게존재.

3 EtBr stained DNA 한천 : 해초에서얻어지는고분자물질의다당체 % 에서는반고체로, 1.0% 이상에서는단단하게존재. Agarose : 한천은주로전기적으로중성인 agarose 와이온성인 agaropectin 으로구성되어있다. 이한천중에서 agarose 만추출된것. DNA 전기영동젤의재료.

4 kb

5 kb 2 Eco R1 3 kb 7 kb

6 kb 2 3 Eco R1 3 kb 7 kb PstI 4 kb 6 kb PstI 6 kb 4 kb

1 2 3 4 1 10 kb 2 3 Eco R1 3 kb 7 kb PstI 4 kb

7 kb 2 3 Eco R1 3 kb 7 kb PstI 4 kb 6 kb PstI 6 kb 4 kb 4 Eco R1 PstI 3 kb 1 kb 6 kb

8 DNA electrophoresis: PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis : 수직형 큰 DNA ( 수천 b(bp) 이상 ) : agarose gel 작은 DNA ( 수백이하도가능 ) : PAGE

9 제한효소 (Restriction Enzymes) 1) Phage virus 와 bacteria의상호작용에서발견. 2) Bacteria는 DNA의특정순서 (restriction site) 를절단할수있는 restriction enzyme을생산. 3) 숙주세포 (bacteria) 는자신의 DNA를 methylation 시켜 ( 절단이될수없게하고, 침입한 virus (phage) 의 DNA는절단하여퇴치시킴. (* 바이러스의 DNA는메틸화되어있지않다.) 4) 효소인식자리는일반적으로 palindromic ( 회문 ) 구조이다. 외부물질 (viral DNA) 절단 -> 바이러스퇴치 자기 DNA ( bacteria DNA) 보호

10 박테리오파아지 (virus) 의 E. coli 공략 플라크 (plaque) 형성 : 하얀점박테리아가죽은곳 (virus 에의해 )

11 바이러스운반체에의한인간 DNA 단편의 cloning 인간 DNA 는 Virus DNA 에삽입되어 cloning 된다.

12 Eco RI Restriction Enzyme Single stranded nick First restriction enzyme from Escherichia coli, so Eco R1

13 Single Stranded Nicks in DNA Hydrolysis of this ester bond H 2 O OH O - O P O OH Phosphodiester 결합절단

14 Restriction Enzyme Recognition Sites Restriction sites are general palindromic ( 회문구조 ): Able was I, ere, I saw Elba Bam H1 site: 5 -GGATCC-3 3 -CCTAGG-5

15 Restriction Enzyme Recognition Sites BglII 5 A-G-A-T-C-T T-C-T-A-G-A 5 Sau3A 5 G-A-T-C C-T-A-G 5 BamHI 5 G-G-A-T-C-C C-C-T-A-G-G 5

16 Frequency of cutting of recognition enzymes Sau 3A (GATC) cuts (¼ )(¼ )(¼ )(¼ ) = once every 256 base pairs (assuming G/C = A/T, which is often does not) BamH1 (GGATCC) cuts (¼ )(¼ )(¼ )(¼ )(¼ )(¼ ) = once every ~4Kb HindII (GTPyPuAC) cuts (¼ )(¼ )(½ )(½ )(¼ )(¼ ) = once every ~1Kb

17 Sticky ends ( 접착말단 ) 5 overhang (EcoRI) 5 -GAATTC-3 5 -G-OH PO 4 -AATTC-3 3 -CTTAAG-5 3 -CTTAA-PO 4 + HO-G-5 3 overhang (PstI) 5 -CTGCAG-3 5 -CTGCA-OH PO 4 -G-3 3 -GACGTC-5 3 -G-PO 4 HO-ACGTC-5 + Blunt ends ( 평활말단 : 직선 cut) 5 overhang (SmaI) 5 -CCCGGG-3 5 -CCC-OH PO 4 -GGG-3 3 -GGGCCC-5 3 -GGG-PO 4 + HO-CCC-5

18 EcoRI G A-A-T-T-C C-T-T-A-A G

19 RsaI Rhodopseuomonas sphaeroides G-T A-C C-A T-G

21 Ligation of compatible sticky ends Human DNA cleaved with EcoRI 5 -C-G-G-T-A-C-T-A-G-OH 3 -G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-PO 4 + Corn DNA cleaved with EcoRI PO 4 -A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3 HO-G-T-C-G-A-T-G-C-5 Complementary base pairing 5 -A-C-G-G-T-A-C-T-A-G A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3 3 -T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A G-T-C-G-A-T-G-C-5 + DNA Ligase, + ATP 5 -A-C-G-G-T-A-C-T-A-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3 3 -T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-T-C-G-A-T-G-C-5 recombinant DNA molecule

22 재조합 DNA 와클로닝 (cloning) 클론 (clone) : 생물체, 세포, 바이러스, 또는 DNA 분자에있어서유전적으로동일한집단. 클로닝 (cloning) : 클론을얻는행위 플라스미드 (Plasmid) vectors 세균유전자와는상관없이복제되는원형 DNA. 외부 DNA 전달에사용. high copy ( > 100 per cell); low copy (1-25 per cell). 특징 : - Origin of replication (Ori) - Antibiotic resistance (marker) 항생제저항성 ) - Multiple cloning site (LacZ reporter 포함하기도함 ) LacZ 유전자 : 색깔선택

23 박테리아 Plasmid 박테리아게놈

24 Plasmids lacz gene 이발현하게되면 β-galactosidase 를생산하여 X-gal 이포함된배지에서는 X-gal 을분해하여파란색 colony 를형성. origin of replication (Ori) Amp r LacZ reporter multiple cloning site puc18 (~3 kb) Can insert DNA fragments up to ~ 20kb in plasmids

25 Cloning into a Bacterial Plasmid Vector

26 Plasmid 를사용한 Bacterial Transformation chromosome E. Coli cell Amp (-) Amp r Permeablize membrane with Ca 2+ and heat shock E. Coli cell Amp r + plasmid Select for growth in the presence of ampicillin

27 특정 Plasmid DNA 의 E. coli 에의한증폭

28 특정 Plasmid DNA 형태의정제 환상 DNA 의종류 (plasmid DNA) - 폐환상 DNA (ccdna) : 절단부위가없다. 말단부위가없으므로분자내의변화에의해비틀린구조를갖는다. - 개환상 DNA (ocdna) : 2 본의분자사슬중의어느한쪽에절단부위를갖는다.

특정 Plasmid DNA 형태의정제 CsCl 내에서 EtBr 의존재하에 DNA 를원심분리

말단을갖는 ds DNA 에는 EtBr 이염기쌍의겹쳐있는틈새로들어가기때문.

29 특정 Plasmid DNA 형태의정제 CsCl 내에서 EtBr 의존재하에 DNA 를원심분리 EtBr 의역할 -ds DNA 의염기쌍과염기쌍의틈새에끼어들어가는성질이있다. -ds DNA 에들어가는 EtBr 양은 DNA 의형태에따라다르다. * 폐환상 DNA 는적고개환상과직쇄상 DNA 는많다. 말단을갖는 ds DNA 에는 EtBr 이염기쌍의겹쳐있는틈새로들어가기때문. 분리원리 -EtBr 와결합하면 DNA 밀도는낮아진다. - 플라스미드 DNA 는크기가작고폐환상 ( 그리고일부는개환상 + 직선상 ) 으로되어있어떠있고, 염색체 DNA 는크므로바닥에침전됨 ( 버림 ).

30 Expression of genes in E. coli ATG Needs to be in frame TAA T7 promoter Affinity tag cdna Induce expression with IPTG NH 4 Purify fusion protein via affinity tag Common affinty tags are be 6X-His & GST both protein will bind reversibly with high affinty and specificty to a particular chromatography resin

31 His- & GST- affinity tags

32 인슐린 대장균을이용한단백질대량생산 재조합인슐린의생산 ( A + B chain): 성숙한형태로결합된인슐린을얻는것이목표. A 와 B 사슬을따로만들어합침. - 베타 - 갈락토시다아제 (β-galactosidase) 를암호하는대장균유전자에각자삽입. - 단백질발현. - 정제 + 혼합. 활성인슐린생산

슬라이드 1

슬라이드 1 DNA technology (DNA 조작기술 ) 유전자 cloning Cloning & Plasmid Joshua Ledergerg & Edward Tatum, 1946 두종류의다른유전자를가진대장균사이에유전자의재조합이일어나새로운대장균이만들어지는것을발견했다. 이원리를바탕으로 1970 년대에 DNA 재조합기술이발전하게되었다. 원핵생물에서 DNA 의이동방법 플라스미드를이용한