Chapter 3

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래연 독고
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1 Chapter 8 Viruses in Molecular Biology 1

2 8.1 Introduction to Viruses A virus particle (virion) 은 living cell 내에있지않으면자라지도않고 replicate 를하지도않는다. Virion 의크기는 nm 이며전자현미경상에서관찰이가능하다 ( 옆의그림참조 ) 일부 virus 는단한종의 organism 에만감염이되나어떤것은연관된종에감염이되고다른것은다양한종에감염이된다. nucleic acid component can be DNA or RNA nucleic acid can be single- or double-stranded nucleic acid is surrounded by a protective protein coat, the capsid viral genes code for the capsid and enzymes that are essential for viral reproduction in the host viruses are not living and can only reproduce in a metabolizing cell 2

8.2 Introduction to the Bacteriophages Bacteriophage

3 8.2 Introduction to the Bacteriophages Bacteriophage 는원래박테리아가일으키는병을치료하는목적으로연구됨 1896 년 Ernest Hankin 은콜레라균을죽일수있으며 filter 를통과하는물질을발견 1917 년프랑스의 Felix d Herelle 가이질에서회복한군인들의대변으로부터얻은박테리아가없는여과물에서이질을일으키는균을죽이는물질을발견하고 bacteriophage 라고이름을붙임. Phage 는그리스의 eat 에해당하며 bacterial virus 를말함그러나현재는박테리아의돌연변이성때문에 virus 를이용한 bacteria 의치료는쉽지가않음이장에서배울 phage 는 3 가지의구조적인특징으로나눔 Icosahedral tailess Icosahedral tailed Filamentous 3

4 Life cycles of phages 모든다른 virus 처럼 bacteriophage 도 host cell 내에있지않으면살아있는생명체가아니다. 그러나 phage life cycle 이라는용어는 host cell 과 virus 가접촉하는초기감염시부터 host cell 에서 viral progeny 가방출되어나올때까지사용이된다. 3 가지 life cycle 이존재함. 1. lytic life cycle phage infects bacterium and replicates, cell lyses to release progeny phage 파괴되어방출되는것을 lysis 라고하며이때새롭게합성된 phage suspension 을 Phage lysate 라고하며단지 lytic cycle 만을하는 phage 를 virulent phage 라고한다 2. lysogenic life cycle phage infects bacterium and DNA integrates into the chromosome as prophage prophage can be induced excise and enter lytic life cycle. prophage 를포함하는 bacteria 를 lysogenic cell 이라고하며 lysogenic cycle 를갖는 phage 를 temperate phage 라고한다. 3. chronic infection life cycle phage infects bacterium, is replicated and progeny are released without cell lysis 이러한 phage를 chronic phage라고한다. 4

Temperate phage 나 chronic phage 에서도유사한방법을사용한다.

5 plaque assay Bacteria 는보통약 30 분에한번분열을하나 single virulent phage ( 예 T4) 는같은시간에 100 progeny 를만든다. 이를이용하여 plaque assay 를한다. 즉 bacteria lawn 을만들며 virus 로감염시키면 plaque 가생김. Temperate phage 나 chronic phage 에서도유사한방법을사용한다. Chronic phage 같은경우 cell 이 lysis 가되지는않지만박테리아의성장이느려서 low cell density 의 plaque 를만든다. 특정한 phage 는특정한 bacteria 종만감염이되는데그이유는첫째흡착시키는능력이다 Bacteria cell envelope 이 phage 흡착이일어나는특정 receptor 가있기때문이다. 다른이유는박테리아의전사체계가 phage 유전자를인식하는가의문제이다. 5

6 8.3 Virulent bacteriophages 1. E. coli phage T4 tailed virus, head 는신장된 icosahedron 이며 collar 로둘러싸인 neck 과연결. collar 에는단백질인 whisker 가연결. Neck 는 tail 과연결되며 tail 은 144 개의동일한 polypeptide subunit 로둘러싸여있으며각각에하나의 ATP 분자가결합됨. Phage T4 DNA 는약 169 kb linear duplex genome (55µm, 반면에 head 직경은 µm) 으로매우촘촘히 packing 됨. DNA 는 A, T, G 를갖고있으나 C 는변화된형태가존재 C 가 5-hydroxymethylcytosine (HMC) 로변화되고다시 HMC 의 OH 기에 glucose 가붙은 glucosylation 이일어남. 이현상은 DNA 분자를둘러싸는역할을하여다양한 DNase 로부터보호를해준다. 5-Hydroxymethylcytosine (HMC) Glucosylated HMC 6

1) DNA 가 terminally redundant 함 ; 양쪽끝에서특정서열이반복됨.

2) Phage DNA 의양쪽끝의 repeated area 는 phage particle

7 Properties of Phage T4 DNA T4 phage DNA 는두가지뚜렷한특징이있다. 1) DNA 가 terminally redundant 함 ; 양쪽끝에서특정서열이반복됨. 끝이 exonuclease 에의하여절단되어단일가닥이된후 circular 형태를만듬. 2) Phage DNA 의양쪽끝의 repeated area 는 phage particle 마다다르다. 심지어한 phage particle 에서시작되어하나의 plaque 를이루는집단내에서도차이가존재함. 유전자의순서는동일하나 circularly permuted 함. 즉순열로배치가됨. 일부는 terminal redundancy 와 circular permutation 이동시에일어나나어느경우에는 terminal redundancy 만일어난다. 7

T-even phages inject their DNA into bacterial cells Figure 8.

을둘러싸고있는 sheath 가수축을한다. 이수축에의해 protein needle 이 outer membrane 을뚫는다.

inner membrane의 receptor와연관된 phage protein에의하여 DNA가세포질내로방출된다.

8 T-even phages inject their DNA into bacterial cells Figure 8.8 Phage 의 tail fiber 가 lipopolysaccharide receptor 에결합하면 base plate 에커다란변화가일어나 tail 을둘러싸고있는 sheath 가수축을한다. 이수축에의해 protein needle 이 outer membrane 을뚫는다. Needle 이분리되고 lysozyme 이 cell wall 파괴를촉매한다. inner membrane의 receptor와연관된 phage protein에의하여 DNA가세포질내로방출된다. T4 DNA가이전하는속도는 1초당 3 10kb이다. Phage T4 DNA는약 290개의다른 polypeptide를암호화하고 8개의 trna 분자, 최소한 2개의 RNA 분자를암호화한다. 82개의 metabolic genes에서 22개가필수적으로복제 8 전사 cell lysis에참여한다. 남은 60개는박테리아유전자를 duplicate한다.

9 The T4 phage life cycle Figure 8.9 Infection 되자마자 phage DNA 는박테리아의성장에필요한기능을 turn off 한다. 예를들어처음합성되는 phage RNA 는 host DNA 를파괴하는 DNase 의합성에관여. 감염후 phage DNA 는복제를하나박테리아 DNA 는복제를하지않음 9

10 Aspects of T4 phage replication T4 phage DNA replication 은 5 가지점에서흥미롭다. 1. Source of T4 DNA necleotide and degradation of host DNA host DNA is degraded to provide dntps for phage DNA synthesis degradation is initiated by two viral endonucleases (dena, denb 유전자 ) 이효소들은 cytosine 을포함한 DNA 에작용하여파괴를시키며파괴된것은박테리아효소에의하여 datp, dttp,dgtp, dctp 가된다 2. Synthesis of 5-HMA dcmp is converted to dhdp by two phage encoded enzymes dhdp is converted to dhtp, the immediate precursor of hydroxymethylcytosine (HMC) 3. Prevention of incorporation of cytosine into T4 DNA T4 DNA polymerase 는 dctp 와 dhtp 를구별못하기때문에 dctp 가들어가는것을막아야한다. dctpase 라는 phage 효소가 dcdp 와 dctp 를 dcmp 로전환시킴. 다른효소인 dcmp deaminase 가 dcmp 를 dump 로전환. dump 는 dtmp 의합성에관여하여 phage 에서 dttp 의비를높여줌 4. Glucosylation of T4 DNA phage-encoded enzyme인 α-glycosyl transferase와 β-glucosyl transferase가 uridine diphosphoglucose (UPDG) 에서 glucose를이미 DNA에존재하는 HMC 10 로옮긴다.

완전한 phage particle 을생산하는것은두 part 로나뉜다. 하나는 head, tail 과같은구조의합성이고다른것은 DNA 의 packing 임 T4 의 assembly 는두가지방법으로연구됨. 1) 세포배양한것을다양한 phage 돌연변이로감염시킨후관찰.

11 완전한 phage particle 을생산하는것은두 part 로나뉜다. 하나는 head, tail 과같은구조의합성이고다른것은 DNA 의 packing 임 T4 의 assembly 는두가지방법으로연구됨. 1) 세포배양한것을다양한 phage 돌연변이로감염시킨후관찰. Head 가꼬리없이도합성되고꼬리가 head 없이도합성되어 head 와꼬리의조립은독립적인과정으로밝혀짐 2) In vitro complementation 그림처럼하나는 head 가없고다른하나는꼬리가없는것을만든후서로섞어 in vitro 에서 phage particle 를만든다. 이러한방법을이용하여 tail 이나 head 조립의과정을밝힘 Figure

12 Assembly study 를통하여두종류의 Component 가있는것이밝혀짐. Structural proteins; 구조를이루는단백질 Morphogenetic proteins; 어떤구조단백질은자동적으로 phage 구조를만들지만일부는 morphogenetic protein 에의하여구조가이루어짐 Figure 8.11: Morphogenetic pathway of T4 phage. The numbers designate T4 genes. 12

13 T4 phage DNA packaging DNA 를 phage head 로 packing 하기위해서는 concatemer 가형성되어야함. Concatemer 는 terminally redundant sequence 를통해 headto tail 로연결된것을말함 T4 DNA 가 host cell 로 injection 된후특정부위에서양방향으로복제가된다. 3 -single strand overhang 를갖음 새로복제된 3 -overhang 이다른합성된 DNA duplex 의 homologous 를침범함 DNA replication 이마저일어나 concatemer 을형성함 Terminase 라는 phage protein 이 concatemer 을인식하여자르며 head 내로 negative 로 charge 된 DNA 를집어넣으며에너지가요구됨. 약 10 5 ATP 분자가에너지를공급한다. Headful mechanism; Terminase 는특정서열에서 DNA 를자르는것이아니라 T4 head 내로더이상 DNA 가 packing 이안될때두번째를자른다. 또한 terminal redundancy 가있어각 phage-dna 는다른분절로시작되고 circularly permuted 하다. 마지막과정은 lysis 이며이과정의정확한조절이필요함. Holin 이세포막에구멍을형성하고이를통하여 endolysin 이이동하여 cell wall 을파괴한다. 그후에는삼투압에의해 cell 이파괴됨 13

14 E. coli phage T7 Phage T7 은 icosahedral head 이며짧은 tail 을갖고있다. linear double-stranded DNA 는길이가 bp 이며 terminally redundant 하나 circularly permuted 하지못하다. 또한정상적인 adenine, thymine, guanine, cytosine 을갖고있다. 56 개의 potential gene 을갖고있으며유전자와유전자간에단지몇개의염기만존재하기때문에아주경제적이다. 유전자들이기능에따라서모여있으며시간과기능에따라서순차적으로배열됨 14

T4 DNA 는 host cell 내로빠르게주입되나 T7 DNA 는 3 단계를거쳐서천천히주입된다. First stage; T7 이 bacterial cell wall 에결합한후두개의단백질을방출하여 channel 을만듬. 이를통하여 880bp 가초당 75bp 의속도로이전함.

15 T4 DNA 는 host cell 내로빠르게주입되나 T7 DNA 는 3 단계를거쳐서천천히주입된다. First stage; T7 이 bacterial cell wall 에결합한후두개의단백질을방출하여 channel 을만듬. 이를통하여 880bp 가초당 75bp 의속도로이전함. Second stage; 박테리아의 RNA polymerase 가 7kb 의 T7 DNA 를이동시킴. 초당 40bp. Third stage; T7 RNA polymerase 가나머지 DNA 를초당 bp 의속도로이동시킴 T7의 life cycle은 early와 late의전사단계로나뉜다. Early는 E. coli polymerase를이용하여 Gene 0.3부터 1.3까지전사를하는것이고 late stage는새로합성된 T7 RNA polymerase 15 를이용하는것이다. 전사체 (transcripts) 는 3가지로분류된다.

16 T7 phage transcripts 1) class I transcripts; 감염후 2 분부터시작, 박테리아 RNA polymerase 에의해만들어지며 gene 1.3 에서끝난다. E. coli RNase III 에의하여 5 개의 RNA 분자로됨. 몇개의단백질이만들어짐. contains genes for host RNA polymerase inactivation and synthesis of a new T7-specific RNA polymerase for transcription of class II and III genes 2) class II transcripts; T7RNA polymerase 에의하여합성두번째 E. coli RNA polymerase inhibitor 를합성하여위에서합성된 kinase 와함께숙주효소의작용을완전히막아숙주의 RNA 합성을철저히차단함. - contains genes for DNA replication 3) class III transcripts; T7RNA polymerase 에의하여합성 contains genes for viral structure and assembly original T7 DNA의복제는길고일직선의 concatemer를만들고잘려져서 T7 head내로들어간다. Gene 3.5의단백질은두가지작용을하는데 T7 RNA polymerase의작용을막고또한 endolysin으로작용하여 cell wall을파괴한다. Holin이합성되어세포막에구멍을형성하고이를통하여 endolysin이 cell wall에닿아서 cell lysis를야기시킨다. 16

17 Phage X174 X174 는 DNA 가 circular single-stranded molecule 이며 spike 을갖는직경 32nm 의 icosahedral head 로되어있다 nucleotide 로되었으며 11 개의 polypeptide 를암호화한다. X174 는 overlapping 유전자를갖고있어동일서열이다른해독틀로번역이된다. ( 그림참조 ) 17

18 X174 replication Single strand replication이라서주목을받으며원래갖고있던 strand를 + strand, 상보적인 strand를 strand라고한다. 몇단계를거쳐서일어난다. 1) synthesis of a covalently closed dsdna viral + strand에서 strand가합성되면서 covalently closed double-stranded molecule인 replicative form I (RFI) 이됨. 새로합성된 strand에서 RNA가만들어짐. 2) synthesis of many copies of RFI (-) strand가전사되어 A protein이만들어지고 base에서 single strand break가만들어지고 5 -P terminal에연결됨. Nicked된 molecule을 RFII라하며 E. coli 단백질에의하여 looped rolling-circle replication을하여 + strand가분리된다. 이곳에서새로운 strand가합성되어새로운 RFI이됨. 3) synthesis of (+) strands for encapsidation rolling-circle replication에의하여 displaced된 (+) molecules을 packing함 18

19 X174 assembly Figure 8.18 Phage X174 전사는 가닥이만들어진후부터이루어지며 3군데서동시에일어난다. DNA 분자가적어서 head 단백질이합성되기전에여러번복제가되며 DNA의 packing은 7개의 phage 단백질이필요하다. 이들중 4개가완성된 particle 안에존재한다. 마지막단계인 lysis에는 phage gene E에의하여암호화되는 E protein (91 residue) 이필요하나 E protein이 cell wall을직접파괴하는것이아니라 bacterial enzyme을변화 19 시켜서완전한 cell wall의생성을막아파괴시킨다.

20 RNA phages R17, MS2, Qβ 등이 single stranded RNA phage 임. 꼬리없는 icosahedron 이며 3,600 4,300 nucleotide 의 single stranded linear RNA 를갖으며많은수소결합을갖음 (MS2) A = maturation protein L = lysin C = coat protein P = RNA-dependent RNA polymerase MS2 는위의그림처럼 4 개의유전자를갖고있으며 180 개의동일한 coat protein subunit 과하나의 A protein copy 를갖고있다. Phage RNA 는 replication template 와 mrna 의두가지역할을한다. 전형적인 burst size 가 5,000-10,000 이며하나에서수백개의 DNA phage 보다훨씬많다. Lysin 이세포벽을파괴하며박테리아의 lysis 는 분이걸려천천히일어난다. 20

21 Life cycle of an RNA phage 1) adsorption to the cell; RNA phage 는 F + 와 Hfr cell 에존재하는 pili 에결합하여이를따라서 adsorb 가됨. 이때 A protein 이 pillus 에의결합과 RNA 의이동을돕는다. 2) translation of the phage RNA Phage RNA 가들어가자마자 ribosome 이결합하여 C gene 이해독됨. A 와 P 유전자의 ribosome binding site 는 stem-loop 의구조때문에막혀있다가 C 단백질이 P 의결합부위를열어주어해독이된다. 3) replication of the phage RNA RNA-dependent RNA polymerase 는 P gene product 와 three host proteins 으로됨 (tetramer) 4) synthesis of A protein A protein 의 ribosome 결합부위는항상닫혀있다그러나 가닥에서 + 가닥이만들어지는짧은시간에열려서이때 A protein 이소량합성된다. 각각의 virus particle 은하나의 A 단백질을갖고있으며후에 RNA 분자에결합하여감염시숙주세포내로이동하게함 5) particle assembly; coat protein 이자발적으로새로운 + 가닥주위로모여 icosahedral 을만듬 6) cell lysis; 약 phage particle 이만들어진후가능함어떤 phage 는 cell wall 을부수는 lysin 을합성하기도하고어떤것은 cell wall 의합성을막기도한다. 21

22 8.4 Temperate Phage Temperate phage 의대표적인것으로 phage λ 가있으며 lytic 혹은 lysogenic cycle 을갖음 Phage λ 는 icosahedral head 이고길고수축되지않는유연성있는 tail 이있다. DNA 는 head 안에있으며 48,502 의 linear duplex 이며 12 개의 nucleotide 가각각의 5 끝에 overhang 되어있다. 예측되는 63 개의유전자중 45 개의단백질이밝혀짐. 또한유전자들은기능에따라서모여있음. Tail 끝에있는 tip 구조는박테리아의 cell envelope 의바깥쪽에있는 LamB 를인식하여결합한다 Figure

The cos elements of l DNA allow circularization Figure 8.25 λ DNA는숙주내로들어가자마자원형구조를만든다. 5 -overhang 구조를 cohesive ends (cos elements) 라고하며이들이상보적으로결합을한다. 초기에는두개의 single-strand break이있으나 ligase에의하여메워진다.

23 The cos elements of l DNA allow circularization Figure 8.25 λ DNA는숙주내로들어가자마자원형구조를만든다. 5 -overhang 구조를 cohesive ends (cos elements) 라고하며이들이상보적으로결합을한다. 초기에는두개의 single-strand break이있으나 ligase에의하여메워진다. Closed covalent circle DNA는 lytic혹은 lysogenic cycle을할수있다. Lytic cycle은 DNA replication으로시작되며약 150개의 λ particle을만든다. Lysogenic cycle은 λ DNA가박테리아염색체의특정부위로들어가면서시작한다. 23 어느 cycle을택하느냐하는것은전사조절에관한문제이며 14장에서배운다.

24 Life cycle of the λ phage The lytic cycle; λ 유전자의 28 개는 lytic reproduction 에필수적이며이들의대부분은구조단백질이나 phage 를조립하는데필요한단백질들이다. λ DNA 복제에는 θ replication 과 rolling circle replication 이있으며 θ replication 은일반적인복제를말하며단지전사와 rolling circle replication 을위하여 DNA 분자를증가시키는역할을한다. Lytic cycle 이계속되면 θ replication 에서 rolling circle Replication 으로전환되어 head 내로 DNA 로넣기위하여필요한 long concatemer 를만든다. 이들은 cos site 에서잘라져서 5 overhang 가만들어져야하며특정 terminase 에의하여수행된다. The lysogenic cycle; λ DNA 가숙주염색체의특정부위에삽입이되어 prophage 가된다. λ attachment site (att) 라는 gal 과 bio 유전자의중간으로들어가며매우안정적으로존재한다. 그러나 DNA 를변화시키는 X-ray, UV, 화학물질에의하여영향을받으면 lytic cycle 이시작된다. 숙주 DNA 내로 λ DNA 가 integration 되고 excision 되는기작은 12 장에서배움 Figure

25 l phage is a versatile cloning vector λphage 는 cloning vector 로이용할수있게끔변화되었다. Phage 에원래존재하는제한효소부위를없애고 genome 의중앙에해당하는 J 와 N 유전자사이를없애고 unique 한제한효소부위를삽입하여만듬 λdna 를제한효소로잘라 left 와 right arm 을분리함 kbp 에해당하는외부 DNA 를 ligase 를이용하여두 arm 사이에연결한다. Ligase 는또한양쪽 arm 의 cos site 를연결하여긴 concatamer 를만듬 다음으로 packing extract 를가하여 virion particle 을만든후 E. coli 에감염시켜서 recombinant DNA 를갖고있는많은수많은 virion 을만든다. Nonessential gene region can be replaced by kb of foreign DNA. 25

The lytic cycle; DNA 합성이 θ replication 에서 rolling circle replication 으로전환되며감염후 45 분이면 DNA concatemer 와속이빈 head 와 tail 이많이있어 packing 이시작 P1 terminase 는 pac sequence 라는곳을잘라서이곳부터한방향으로 packing

26 Phage P1 Contractile sheath 로둘러싸인 tail tube 로이루어진 tail 과한쪽은 icosahedral head 와연결되고다른끝은 6 개의꼬인 tail fiber 가있는 base plate 임. 93,601 bp 인 linear duplex DNA 이며 kbp 의 terminal redundancy 와 circularly permutation 이존재. P1 은몇종류의 gram-negative bacteria 에감염이되며 envelope 의외부에존재하는 lipopolysaccharide 를통하여감염이됨. The lytic cycle; DNA 합성이 θ replication 에서 rolling circle replication 으로전환되며감염후 45 분이면 DNA concatemer 와속이빈 head 와 tail 이많이있어 packing 이시작 P1 terminase 는 pac sequence 라는곳을잘라서이곳부터한방향으로 packing 이이루어진다. The lysogenic cycle; circular P1 DNA 가되어 plasmid 같이행동하여한세포당 1 2 copy 를갖음. 박테리아가분열시한번분열하여낭세포는하나의 P1 DNA 분자를갖는다. Generalized transduction; phage 가한박테리아에서다른박테리아로 random 하게 DNA fragment 를옮기는현상을말함박테리아유전자를옮기는 particle 을 generalized transducing Particle 라고한다. 26

8.5 Chronic Phages Chronic phage 에는 M13, fd, f1 등이있으며 filamentous phage 이고약 6,400 nucleotide 의 Single stranded closed covalent circular DNA. DNA 는 930nm fibrous particle 이며숙주를죽이거나 lysis 하지않는다.

27 8.5 Chronic Phages Chronic phage 에는 M13, fd, f1 등이있으며 filamentous phage 이고약 6,400 nucleotide 의 Single stranded closed covalent circular DNA. DNA 는 930nm fibrous particle 이며숙주를죽이거나 lysis 하지않는다. 이들은 male-specific phage 임 Model of M13 bacteriophage. 11 개의유전자가 I XI 로표기되면단백질도 pi pxi 으로표시이들의역할은그림 8.31 에서설명함. pii 와 piv 중간에 intergenic 지역 (IR) 이있으며 phage replication 에필수적임. pii 가이중가닥 DNA (replicating form) 의 IR 부위에결합하여 +strand 에 nick 을만들어 rolling circle replication 을하게함. ( X174 의 replication 과동일 ) piii 와 pviii 사이에도 IR 이존재 piii 가 F pillus 에결합하면 piii 에형태변화가일어나숙주의 TolA 단백질과결합하여 phage DNA 의 + 가닥이 cell 내로들어감. Figure

28 Filamentous phage particles are assembled in the inner membrane Figure 8.32 Phage particles are extruded from buds on the cell surface. This process can continue indefinitely and does not damage the cell. 충분한 pv 가형성되면새로합성된 + 가닥에결합하여 + 가닥이더이상 DNA 합성의주형으로작용하지못하게한다. 그러므로많은양의 + 가닥 pv complex 가 cell 내에존재하게됨. 주 coat protein 인 pviii 이다량합성되어 Inner cell membrane 에 imbedded 된다. Single-stranded viral DNA 가 pore complex 를통하여나오면 pv 가떨어져나오고 coat protein 인 pviii 이감싼다. 즉 phage particle 은 inner membrane 에서조립되며숙주의파괴없이진행된다. M13 vector; gene II 와 IV 사이의 IR 지역에제한효소부위를만들어외부 DNA 를삽입. 이중가닥의 M13 vector 를이용하지만다량의단일가닥을얻을수있어 sequencing 에사용 Phagemid; 박테리아내에서는이중가닥으로복제가되지만다량의단일가닥 recombinant 를얻을수있는 vector 를의미 Phage display; 외부 DNA와 coat protein gene 28 과 fusion을하여발현후클론된 peptide를조사함

8.6 Animal Viruses 과학자들은 eukaryotic virus 를연구함으로써진핵세포의분자적인생명현상을이해하려하였으며또이를통하여 virus 가야기시키는병을극복하려고노력하였다. 본장에서는 3 가지 virus 에대하여배울예정이다 (polyomavirus, adenovirus, retrovirus) 1.

29 8.6 Animal Viruses 과학자들은 eukaryotic virus 를연구함으로써진핵세포의분자적인생명현상을이해하려하였으며또이를통하여 virus 가야기시키는병을극복하려고노력하였다. 본장에서는 3 가지 virus 에대하여배울예정이다 (polyomavirus, adenovirus, retrovirus) 1. Polyomavirus 이그룹에속하는첫번째는 polyomavirus 임. 자연상태에서 tumor 를형성함두번째는 SV40 (simian virus 40) 이며 1960 년 monkey 의 kidney cell 에서발견함 polyomavirus 는약 5.2 kbp 의 circular double stranded DNA 분자이며직경이약 60nm 인 icosahedral 내에존재함 ( 그림 8.33). Capsid 는 3 개의단백질로되었으며 VP1 이 capsid protein 의 80%, VP2, VP3 가나머지 20% 를차지한다. SV40 genome 은 regulatory region, early region, late region 으로나뉜다. Regulatory region 은약 400bp 이고 origin of replication 과다른지역을조절하는신호가존재. Early 와 late 지역은서로다른가닥이반대방향으로전사된다. Early 지역은 large T antigen (DNA 복제의시작에필요 ), small t antigen, 17kT protein 을암호화하며 late 지역은 VP1, Vp2, Vp3 의 coat protein 을암호화한다. Figure

Replication cycle of the polyomavirus 1 virion 이 cell surface 에 adsorb 2 endocytosis 에의하여들어옴 3 핵내로이동하나아직기작은모름 45 coat 가벗겨지고 early region 이전사됨 6 early protein (T antigen) 해독 7 T antigen 에의해 DNA 가복제 8

30 Replication cycle of the polyomavirus 1 virion 이 cell surface 에 adsorb 2 endocytosis 에의하여들어옴 3 핵내로이동하나아직기작은모름 45 coat 가벗겨지고 early region 이전사됨 6 early protein (T antigen) 해독 7 T antigen 에의해 DNA 가복제 8 late region mrna 가전사됨 9 capsid protein 이해독됨 10 핵에서 progeny virion 이조립됨 11 cytoplamic vesicles 로이동 12 vesicle 이 cell membrane 과 fusion 13 virion 이방출됨 Figure 8.35 드문경우지만 virion DNA 가숙주의염색체내에무작위적으로들어가암을일으키기도하지만아직기작은모른다 30

2. Adenoviruses 1953 년사람의 adenoid( 인두 ) 에서분리함. 어린이에게호흡기나장에병을일으키며모든사람에게결막염을야기.

이있다. 최소한 12 개의다른단백질을암호화. Early gene (E) 은양쪽가닥에흩어져있고 late gene (L) 은단일 DNA 가닥에서전사됨. E1A 가처음만들어지며이는다른 viral gene 의전사에필요.

각각의 penton 에는 viral polypeptide III 의 5copy 가존재하며외부로돌출된 fiber 에연결나머지 240 capsomer 는 6 면을갖고있어 hexon 이라고한다.

31 2. Adenoviruses 1953 년사람의 adenoid( 인두 ) 에서분리함. 어린이에게호흡기나장에병을일으키며모든사람에게결막염을야기. 설취류 ( 쥐, 토끼 ) 나새등다양한사육동물에서발견됨 35-45kbp 의 linear, blunt-ended, double-stranded DNA 로양말단에 inverted 103 bp repetition 이있다. 최소한 12 개의다른단백질을암호화. Early gene (E) 은양쪽가닥에흩어져있고 late gene (L) 은단일 DNA 가닥에서전사됨. E1A 가처음만들어지며이는다른 viral gene 의전사에필요. Capsomer 라고불리는 252 개의 section 으로된 icosahedral capsid 내에 DNA 가존재. 이들중 12 개는정점에존재하며 5 면으로되어있어 penton 이라고함. 각각의 penton 에는 viral polypeptide III 의 5copy 가존재하며외부로돌출된 fiber 에연결나머지 240 capsomer 는 6 면을갖고있어 hexon 이라고한다. 각각의 hexon 은 3copy 의 polypeptide II 가있으며 cement 단백질이이들을안정화시킨다. Capsid 내부에는 3 개의 argine-rich protein 인 V, VII, μ (mu) 가존재. VII 는히스톤과같은역할을하며 V 는 nucleoprotein complex 가 capsid 내에존재하게한다. 31

The adenovirus replication cycle Penton 에부착된 fiber 가 cell surface 의 receptor 와접촉함. 이로인하여 penton 이이차 receptor 와접촉하여 receptormediated endocytosis 에의하여 host 내로들어온다. Virion particle 이분해되고 DNA 가핵내로들어간다.

32 The adenovirus replication cycle Penton 에부착된 fiber 가 cell surface 의 receptor 와접촉함. 이로인하여 penton 이이차 receptor 와접촉하여 receptormediated endocytosis 에의하여 host 내로들어온다. Virion particle 이분해되고 DNA 가핵내로들어간다. 처음에는 host cell 의전사기작에의하여전사되어 E1A 단백질이만들어진다. E1A 는다른 virus DNA 의전사가이루어지도록한다. Figure 8.38 초기에만들어진 DNA polymerase 와 Single-stranded DNA binding protein 이숙주의효소와같이 DNA 복제를한다. Late gene 이전사되어 viral coat protein 이만들어져서새로운 particle 을만든다. 감염후기에숙주의단백질합성을막아서결국 cell lysis 를일으키며 progeny virion particle 이방출된다. Adenovirus 는 mrna 의합성을위한 model system 으로중요할뿐아니라외부 DNA 를 host cell 내로넣은 vector 로도중요함. 그림 8.36 의상자안의유전자가제거되어야함 32

3. Retroviruses 가장연구가많이된 virus. Human immunodeficiency virus (HIV) 도이들중하나이며 Acquired immune deficiency syndrome (AIDs) 를야기시킴 RNA 에서 DNA 로 reverse transcriptase 를이용하여 reverse transcription 을한다.

33 3. Retroviruses 가장연구가많이된 virus. Human immunodeficiency virus (HIV) 도이들중하나이며 Acquired immune deficiency syndrome (AIDs) 를야기시킴 RNA 에서 DNA 로 reverse transcriptase 를이용하여 reverse transcription 을한다. 유전적으로변화시켜서동물세포내로외부 DNA 를집어넣는 vector 로도쓰인다. 두개의동일한 mrna (+strand) 를갖는데이들은서열이동일하며 7,000 10,000kb. mrna 는 DNA 를만드는주형으로쓰이며 3 개의 protein coding region (gag, pol, env) 이있다. gag 는 polyprotein 단백질을암호화하며궁극적으로 3 개의단백질로잘라진다. 1 matrix protein; virus 를둘러싸는 membrane 게강하게연결됨 2 capsid protein; 내부구조인 core shell 을만듬 3 nucleoprotein; RNA 결합단백질 gag 에서 protease 를암호화하며 viral reproduction 에필수적으로 polyprotein 을절단. pol 은 reverse transcriptase 와 integrase env 는 transmembrane protein, integral membrane protein, surface glycoprotein 을암호화. Retroviral RNA 는 5 modified G (5 cap) 이있고 3 poly (A) tail 이존재함 33

Retrovirus life cycle Retrovirus 는 cell surface 의특정 receptor 에결합을하고 virion membrane 과 cell membrane 이 fusion 을하여 cytoplasm 으로들어간다. HIV 는사람의 T helper cell 표면의 CD4 receptor 에결합한다.

34 Retrovirus life cycle Retrovirus 는 cell surface 의특정 receptor 에결합을하고 virion membrane 과 cell membrane 이 fusion 을하여 cytoplasm 으로들어간다. HIV 는사람의 T helper cell 표면의 CD4 receptor 에결합한다. Reverse transcriptase 를이용하여 RNA 에서상보적인 DNA 를합성한다. RNA DNA hybrid 에서 RNaseH 가 viral RNA 를파괴한다. Reverse transcriptase 가다시 DNA 에서 DNA 를합성하여이중가닥 DNA 를만든다. 이중가닥 DNA 가핵내로이동하여 integrase 에의하여숙주의염색체내로들어가서 provirus 가됨. Provirus 는 host 염색체의일부분으로존재함 Late stage 에서는 host 의효소를이용하여 viral DNA 를전사하여 viral RNA 를만듬. 여기에서 viral protein 이합성되어 progeny viral particle 을만든다. Assembly 가세포막에서일어나며 budding 에의해서성숙한 virion 이방출된다 34

Chapter 26

Chapter 26 11 주 RNA 합성 11.1 DNA-dependent synthesis of RNA: Bacteria에서의 transcription l RNA polymerase (5 subunits로구성 : 2α, β, β, σ) l 효소에의한 RNA 합성의특징 - Complementary sequence to template DNA - RNA chain의합성방향 : 5