Chapter 3

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성선 초
6 years ago
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1 Chapter 6 Chromosome Structure 1

2 6.1 Bacterial chromatin E. coli DNA is circular, with a length of ~1500 mm the cell has a diameter of ~0.5 mm and a length of 1 mm the DNA must be compacted ~1000-fold to fit inside the cell! Specific 한단백질이박테리아 DNA 와결합하여 Nucleoid 라고하는 highly condensed nucleoprotein complex 를만듬 2

3 Figure 6.2 E. Coli의 chromatin의전자현미경사진. 박중앙지역에서고정되어서뻗어나온 multiple 텔ㅇ loop가관찰됨. 어떤것은 supercolied loop이고어떤것은 nick에의하여 Relaxed loop를형성 Figure 6.3 3

4 SMC protein mukb mutants produce cells without a nucleoid at high frequency mukb mutants cannot grow at temperatures above 30ºC mukb mutants have expanded and disordered nucleoids the mukb gene encodes a 170 kda protein that belongs to the SMC (structural maintenance of chromosmes) family SMC protein 의구조 5 개의 domain 으로되었으며 N-terminal domain 이 ATP 와결합하고 ATP 를 Hydrolize 를하기위해서 C-terminal domain 과 interaction 을해야한다 SMC 단백질은 DNA 를 4 배 compact 시키며더 compact 하기위해서는 H-NS(histone-like nucleoid structuring) HU (heat unstable) Fis 등이필요함그러나이들은거의연구되지않음 4

5 6.2 Mitosis and Meiosis Higher animal cell 이분열할때핵내의 chromatin 은광학현미경상에서관찰이가능한농축된모양을갖게되며이를 chromosome 라고한다. 이들의수는 cell 의종류에따라다름 Germ cells have a characteristic number of chromosomes called the haploid number (1n) Somatic cells have two homologs of each chromosome and are diploid (2n) 세포분열에따라서염색체의수가변함 Mitosis maintains the number of chromosomes during cell division daughter cells are 2n Meiosis reduces the number of chromosomes in half during sexual reproduction daughter cells are 1n zygote formation reestablishes the diploid number 5

heterochromatin is more condensed and is not actively transcribed. Phototake, Inc.

6 Cell cycle Figure 6.5 Figure 6.6 Euchromatin is less condensed and is actively transcribed during interphase; heterochromatin is more condensed and is not actively transcribed. Phototake, Inc./Alamy Images 진핵세포는 life cycle의 90% 를 interphase기에보내며이때 DNA, RNA, 단배질등을합성한다특히 DNA 합성은 S기에일어나며 S, G 2, M기는기간이비교적상대적으로일정하나 G 1 기 ( 단백질, 지질, 탄수화물등을합성 ) 는길이가다양하다 6

Mitosis has four stages Prophase chromosomes condense the nucleolus disappears the nuclear membrane disassembles mitotic spindle begins to form Metaphase spindle fibers attach to each chromosome

7 Mitosis has four stages Prophase chromosomes condense the nucleolus disappears the nuclear membrane disassembles mitotic spindle begins to form Metaphase spindle fibers attach to each chromosome chromosomes align at the equatorial plane of the cell Anaphase centromere divides to produce two identical sister chromatids sister chromatids move toward opposite poles of the cell Figure 6.7 Telophase the spindle disappears nuclear envelopes form around the two sets of chromosomes 7

8 Meiosis 두번의분열을하고염색체수가반감이된다 8

9 Thin or fine thread Chromatin 이두꺼워지고둥글어져 chromomere 가되며염색체의길이를따라불규칙하게보인다 Paired thread 상동염색체가 pair 를이루어 synapsis 구조를만듬. 완전히짝을이룬염색체를 bivalent ( 두개의상동염색체로구성 ) 혹은 tetrads (4 개의 chromatid 로구성 ) 라고함 Thick thread Synapsis 가완전히이루어진후에염색체의농축이계속된다. Crossing over 라는염색체교환이일어난다 9

10 Double thread Tetrad 가완전히보이고상동염색체가분리되기시작. 상동염색체가완전히분리되지않고 chiasmata ( 단수 ; chiasma) 로연결됨. Moving apart 염색체가최고로농축된상태이며상동염색체가분리되는상태 10

11 11

12 Fig. 4.13c 12

13 13

14 meiotic division Prophase I homologous chromosomes pair and can undergo crossing over, leading to genetic recombination Metaphase I each chromosome moves to the metaphase plate Anaphase I homologous chromosomes are pulled apart and begin to move to opposite pole Telophase I spindle disassembles and two new spindles form Prophase II chromosomes at the two poles from the first meiotic division move to the midpoints of the two newly formed spindles Metaphase II chromosomes align on the metaphase plate Anaphase II centromeres split and the chromosomes move to opposite poles Telophase II chromosomes condense and nuclear envelopes form and four haploid nuclei are produced 14

15 6.3 Karyotype Figure 6.10a 정상적인남성의 karyotype iemsa dye 를이용하여 band 를관찰하나 band 하나가실제적으로는백만염기쌍과수백개의유전자를포함한다. ) 각각의염색체를큰것부터 1 번으로번호를준다. ) Short arm 을 p 라하고 long arm 을 q 라한다 ) Centromere 로부터바깥쪽으로 band 와지역에대하여번호를줌 ) 염색체번호, arm, 지역번호, band 번호는순서대로준다 염색체에는 autosome 과 sex chromosome 가있다 Figure

사람의 Karyotype 은우선사람의세포 (blood 혹은 Bone marrow) 를 mitogen 으로처리하여세포분열을야기시킨후 colchicine 을처리하여분열이중기에멈추게한후관찰한다. Down syndrome; 가장흔한 aneuploidy 로 21 번염색체가 3 개존재함. 이는감수분열 1 기에염색체가제대로 segregation 되지않기때문임.

16 사람의 Karyotype 은우선사람의세포 (blood 혹은 Bone marrow) 를 mitogen 으로처리하여세포분열을야기시킨후 colchicine 을처리하여분열이중기에멈추게한후관찰한다. Down syndrome; 가장흔한 aneuploidy 로 21 번염색체가 3 개존재함. 이는감수분열 1 기에염색체가제대로 segregation 되지않기때문임. 다운증후군은 800 명의신생아당한명으로태어나며 Mental retardation, epilepsy, heart defect 등이나타나고 35 세이전에대부분 alzheimer 증상을보임약 5% 에서 21 번염색체가 chromosomal Rearrangement 로인하여다른염색체에첨가된경우가있으나아직병의기작은모른다 Figure 6.12: The Philadelphia chromosome. Translocation 이라는기작에의하여병이야기된경우의예. 9 번염색에의일부와 22 번염색체의일부가교체되어비정상적인 bcr-abl 유전자가만들어짐그결과 chronic myelogenous leukemia 가생김 16

FISH = fluorescent in situ hybridization Classical

17 FISH = fluorescent in situ hybridization Classical technique 으로는 translocation, deletion Insertion 등을관찰하기에는민감도가떨어져새로운방법을사용하게됨. FISH; fluorescence dye 가붙은 DNA probe 를이용특정 DNA sequence 에결합하게한다. Aneuploidy, Chromosomal aberration, translocation 등을쉽게관찰 Figure 6.13 Spectral karyotyping 염색체마다다른형광염색이결합하게하여관찰함 17

18 6.4 Nucleosome Human cell 에서 2mm 의 DNA 가 5um 의핵내에들어가기위해서는 10,000 에서 20,000 배의농축이있어야한다. 초기단계로 DNA 와 histone 이결합하여 7 배의농축이생긴다 Histone 에는 H1, H2A, H2B, H3, H4 등이있으며 positively charge 된 lysine 과 argine 이많이존재하여 negatively charged 된 DNA 와결합을쉽게한다. H1 을제외하고는나머지 Histone 은다른생명체와도아주유사하다. 그예로소의 H4 는 pea 의 H4 와단지두개의아미노산만차이가난다. 즉 histone 의구조가수십억년간변하지않음을증명함 18

전자현미경을이용하여 beads on a string 의구조를관찰할수있다.

19 Nucleosome 의구조 Figure 6.15 Figure 6.16 Nucleosome; 8 개의 histone 분자로된단백질을 DNA 가싸고있는 nucleoprotein complex 를 nucleosome 이라고함. 전자현미경을이용하여 beads on a string 의구조를관찰할수있다. Micrococal nuclease 로간단히처리하면 nucleosome 을연결하고있는 linker DNA 를제거할수있으며중간과정으로는 bp 의 DNA 를분리할수있으나이는 linker DNA 의길이에따라다양하고최종적으로는 146bp 의 DNA 가싸고있는 octameric protein complex 가분리된다. Protein complex 에는 H2A, H2B, H3, H4 가각각두 copy 씩존재한다. 19

아직명확한역할은모르나 chromatin 의 Higher-order folding 에관여한다고간주됨그림은 H1 의두가지역할을나타냄

20 H1 histone 은 micrococal nuclease 로간단히처리하면 nucleosome 에존재하나오래처리하면 core particle 에존재하지않는다. 아직명확한역할은모르나 chromatin 의 Higher-order folding 에관여한다고간주됨그림은 H1 의두가지역할을나타냄 Figure 6.17 Nucleosome core particle 의 X-ray crystallography H3 는 blue,h4 는 yellow, H2A 는 red, H2B 는 green 으로표시됨 Figure

21 DNA 복제시 nucleosome 의 assembly DNA 의복제시 nucleosome 의 assembly 와 Disassembly 는필수적인사항이며 DNA 복제시모든 nucleosome 이풀어지고복제후에는이전에존재하거나새로합성된 histone 에의하여 nucleosome 이형성됨. 이과정에는몇가지의 chaperon 이필요함 Chromatin assembly factor (CAF-1); histone H3-H4 tetramer 를새로복제된 daughter DNA Duplex 에결합하게함 Nucleosome assembly protein (NAP-1); 완전한 Nucleosome 을합성하게끔 H2A-H2B dimer 를 H3-H4 tetramer 에결합하게함. Figure 6.19 CAF-1와 NAP-1가 nucleosome형성에관여하나간격이불규칙하다. ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor (ACF) 와 chromatin accessibility complex (CHRAC) 가 nucleosome의간격을일정하게 21 유지시켜줌

6.5 High levels of eukaryotic chromatin organization The 30-nm

Zigzag model; fiber 의반대쪽에있는연속적인 nucleosome 사이를직선으로연결하여 Zigzag 모양

22 6.5 High levels of eukaryotic chromatin organization The 30-nm chromatin fiber. Nucleosome 에의하여 7 배농축이되고 supercoiling 에의하여 6 배더농축이되어 30nm 직경의 fiber 가된다. 그결과 40 배의농축이됨. 30nm fiber 구조에는두가지 model 이있다. Zigzag model; fiber 의반대쪽에있는연속적인 nucleosome 사이를직선으로연결하여 Zigzag 모양 Solenoid model; nucleosome chain 이한 turn 당 6 개의 nucleosome 이존재하는 helical 구조를형성함 Figure 6.21a: Zigzag Model Figure 6.21b: Solenoid Model 22

Scaffold structure model Figure 6.23 앞에서배운 40 배의응축이외에중기의염색체같은경우는약 500 배의응축이더필요함전자현미경사진처럼 histone 이제거된염색체는 Scaffold protein 에 DNA loop 가연결된형태를보임.

23 Scaffold structure model Figure 6.23 앞에서배운 40 배의응축이외에중기의염색체같은경우는약 500 배의응축이더필요함전자현미경사진처럼 histone 이제거된염색체는 Scaffold protein 에 DNA loop 가연결된형태를보임. Scaffold attachment regions (SARs) 라고하는 A-T rich DNA 서열이 scaffold protein 과관계를맺어 30nm fiber 가 loop 를형성하며이곳에약 100kb 의 DNA 존재 Scaffold는 non-histone protein인 topoisomerase II와 SMC (structural maintenance of Chromosomes) protein 으로됨. SMC protein은여러개가모여서분자량이큰상태로존재하며condensin 이라고한다. Condensin은 5개의 subunit 으로되고침강계수가 2313S.

24 (30nm) 24

Stretching a chromosome Chromosome 의 elasticity 를측정하여염색체의구조를조사함. Suction 을이용하여염색체를 pipette 내로흡입시킨후한쪽 pipette 은고정시키고다른한쪽 pipette 은이동시키면서그안에서염색체의변하는모습을관찰함. 위의과정을실험하면서각각다른효소로처리하여염색체의모습을관찰.

25 Stretching a chromosome Chromosome 의 elasticity 를측정하여염색체의구조를조사함. Suction 을이용하여염색체를 pipette 내로흡입시킨후한쪽 pipette 은고정시키고다른한쪽 pipette 은이동시키면서그안에서염색체의변하는모습을관찰함. 위의과정을실험하면서각각다른효소로처리하여염색체의모습을관찰. 효소로처리하지않은염색체는약한힘 (stretching) 이가해졌을때충분히늘어나나약한 micrococcal nuclease 와 protease 로처리하면가늘어진후에절단이된다. RNase 로처리하면차이가없다. 결론 ; scffold 는 protein-protein interaction 과 protein-dna 의 interaction 으로구성됨 25

DNA 로구성되어있으나사람에서는 hierarchic organization ( 단계적구성 ) 을이룬다.

26 Centromere Figure 6.25 Figure 6.26 Centromere 는 microtubule 이부착하는부위로 yeast 에서는약 125bp 의특정 DNA 로구성되어있으나사람에서는 hierarchic organization ( 단계적구성 ) 을이룬다. 약간의차이가있는 171bp 의서열이반복되고이들이모여크기가 kb 에이르는 α satellite DNA array 를이룬다. ( 그림 6.25 참조 ) 26

27 Figure 6.27 Centromere 는 DNA 와 histone 과다른단백질들이결합된특수화된 chromatin 의형태를갖고있다. Nonhistone protein 에는 constitutive protein 과 passenger protein 으로구성됨 Constitutive protein; cell cycle 전기간에걸쳐서 centromere 에결합됨. 예로 CENP-A protein 이있으며이는 histone H3 와유사하고다른 histone 와결합하여새로운형태의 nucleosome 을만든다. Passsenger protein; 세포주기의특정주기에만 centromere 와연관을맺음 다른 constitutive protein 과 passenger protein 은 assemble 되어서 microtubule 이결합하는 kinetochore 지역을만든다. 효모에서는 kinetochore 에단하나의 microtubule 이연결되어있으나사람에서는여러개의 microtubule 이연결됨 Kinetochore 에는 nucleosome 을포함하는 CENP-A 와연관을맺는 inner kinetochore 지역과 spindle fiber 를형성하는 microtubule 이붙는 outer kinetochore 가있다. 27

Telomeres Figure 6.28 Figure 6.29 Tetrahymena 에서염색체의끝부분이 short simple sequence 인 TTGGGG 로된것이밝혀짐. 대부분의진핵세포에서 5-8 sequence 로된 simple array repeat 로됨.

28 Telomeres Figure 6.28 Figure 6.29 Tetrahymena 에서염색체의끝부분이 short simple sequence 인 TTGGGG 로된것이밝혀짐. 대부분의진핵세포에서 5-8 sequence 로된 simple array repeat 로됨. 사람과척추동물에서보듯이 TTAGGG 서열로 G 의양이많고효모에서는수백 bps, 사람과척추동물에서는수천 bps 로됨. 그림처럼 G-rich strand 는상보가닥의 5 end 의 C-rich 지역을지나 Overhang 됨. Overhang 지역은단순진핵세포에서는 2-3 의반복이나사람에서는약 30 개가반복이된다. 전자현미경연구를통하여 G-rich overhang strand 가 t-loop (telemore loop) 와 D-loop (displacement loop) 를만든다는것이밝혀짐 특정단백질이 telomere 의구조를유지하는데필요함 28

TRF1, TRF2 모두 telomere 부위로다른단백질을모으는역할을한다.

29 Figure 6.30a, b Mammalian telomere 를보호하기위하여두개의단백질인 TRF1 과 TRF2 (TTAGGG repeat binding factors 1, 2) 이존재하며이들은 telomere 지역의이중가닥지역에결합한다. 이두 factor 의구조는비슷하나 TRF1 은 telomere 길이의 negative regulator 로작용하여 TRF1 이많이생산되면오히려길이가짧아진다. TRF2 는 t-loop 형성에관여하며염색체끝을싸서보호를한다. TRF1, TRF2 모두 telomere 부위로다른단백질을모으는역할을한다. 다른단백질인 POT1 (protection of telomere) 은 D-loop 의단일가닥에결합함 진핵세포의복제기간에 telomere 부분을잃어버리고이를 replace 하기위해서는 telomerase라는특정효소가필요하다 (9장에서배움 ) 일반적인 somatic cell에서 DNA는 replace되지않아서세포의분열이한정적이고 aging과관련이있다고간주됨. 반면에 germ cell에서는 telomerase가있어무한정분열을한다. 대부분의암세포도 telomerase를갖고있어암의연구에중요한 target 29 임

OB&LM Joint Conference Prenatal Molecular Diagnosis

OB&LM Joint Conference Prenatal Molecular Diagnosis 제3 장 유전검사 - 세포유전검사 및 결과의 해석 31 익혀야할내용 세포유전학의 개요를 이해한다. 세포분열 단계를 이해한다. 인간의 염색체에 대해 이해한다. 염색체검사의 적응증을 이해한다. 통상적인 염색체검사의 기법 및 molecular cytogenetics 기법에 대해서 이해한다. 흔히 접하게 되는 염색체질환들을 열거할 수 있다. 32 III-1. 개요