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상범 내
5 years ago
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1 DNA, RNA-P nntp + XTP XTP-(NMP)n + nppi Mg 2+

2 E. Coli RNA polymerase (prokaryotic) Holoenzyme = 2α + β + β + σ (Sigma factor or subunit) Core enzyem = 2a + b + b RNA polymerization Step 1. Binding of RNA pol to a template at a specific site 2. Initiation 3. Chain elongation 4. Chain termination and release σ(sigma factor or subunit) : 특정한 DNA 서열 (Promoter, RNA 전사가시작되도록신호 ) 을인식하는역할수행 전사가시작되어 10 개정도의 nucleotide 가결합하고나면느슨하게결합되어있던 σ 단위체는 RNA 떨어져나와재사용됨

3 Binding of RNA pol to a template at a specific site

RNA polymerase 폐쇄형프로모터복합체 개방형프로모터복합체 RNA polymerase의구성

subunit가제거되면기본적인 RNA 전사활성을가지나전사활성의특이성을지니지않는다 σ

최초에결합할때는낮은친화성을가지고결합함 결합부위는프로모터일수도있고프로모터부분이아닐수도있음,

가닥과낮은친화력으로결합하고있는상태 : 폐쇄형프로모터복합체 (closed promoter

4 RNA polymerase 폐쇄형프로모터복합체 개방형프로모터복합체 RNA polymerase의구성 5개의 subunit로구성 (α 2 ββ'σ) Core enzyme( 핵심복합단백질 ) : σ subunit가제거된상태를말한다. 완전한 enzyme을 holoenzyme( 완전효소 ) 이라고함 holoenzyme에서 σ subunit가제거되면기본적인 RNA 전사활성을가지나전사활성의특이성을지니지않는다 σ subunit가제거에의해프로모터부위에결합하지못하는것을의미함 RNA 중합효소는 DNA 최초에결합할때는낮은친화성을가지고결합함 결합부위는프로모터일수도있고프로모터부분이아닐수도있음, 프로모터부위가아닌경우에는프로모터부위가인지될때까지 DNA 가닥을따라이동한다 완전효소가 DNA 가닥과낮은친화력으로결합하고있는상태 : 폐쇄형프로모터복합체 (closed promoter complex) : DNA가닫힌형태의이중나선구조형성 RNA polymerase 가 DNA 가닥을일부풀어높은친화력으로결합하게됨 : ( 이중나선이풀린상태 ; 개방형프로모터복합체 (open promoter compex)

5 Initiation mrna ( 전령 RNA) 어떠한특정단백질이요구될때염색체에있는 DNA 분자의특정부위에해당하는염기서열이다른형태인 RNA(mRNA) 로복사된다 (DNA에서일부분이며 (DNA보다 RNA가더짧다 ; DNA 두가닥이지만 mrna는한가닥이다 ; 전사되는양이많으면단백질양도많다 ) 1. 개시 (linitiation) : RNA 중합효소 (RNA polymerase) 가유전자의상단부 (upstream) 에존재하는 promoter ( 프로모터 ) 부위를인지하여결합한다 RNA polymerase은 RNA 합성개시점에서부터앞 (upstream, 5'-말단쪽 ) 으로약 45염기쌍, 뒤 (downstream, 3'-말단쪽 ) 로 10염기쌍에이르는부위에서 DNA와결합 < 전사개시점염기를 1로하고 5'-말단쪽은 "-", 3'-말단쪽은 "+" 로표시함 > DNA 중합효소는교정능력이있으나 RNA 중합효소는교정능력을가지고있지않다 ( 영구적인저장형태아님, 복제만큼정확할필요없음 ) Promoter : 어떠한유전자를발현시유전자발현에필요한 factor( 요소 ) 들을모으는기능수행, 다양한 elements를가지고있음 ( 유전자발현과동일한 strand에위치한다 = cis acting elements) 맨처음사용되는 ribonucleic acid tri-phosphate는퓨린뉴클레오타이드이다

6 Initiation

7 Intiation Promoter structure 중합효소는주형가닥을따라서 3 5 으로이동 중합효소가결합하는부위는전사출발점 (trscription start site) 보다상류부위 (stream) 에있음 이러한 upstream 쪽에 polymerase가부착되는부위를 promoter라고하며 3부분으로구성 Promoter 지역의염기서열에는특이적으로공통되는염기를가지고있음 공통염기서열 (consensus sequence) TATA box, CAAT box : TATA-box 전사초기에 RNA polymerase가정확한위치를잡도록한다. 전사개시점으로부터 10염기쌍앞에위치 (-10), CAAT-box 전사촉진

8 E. coli Promoter structure

9 E.Coli promoters

10 Transcriptoon - Elongation 2. 신장 (elongation) : RNA 중합효소는주형가닥을중심으로 3 5 방향으로신장하고 RNA 사슬에리보뉴클레오타이드순차적으로결합 RNA 중합효소가 DNA 주형을따라이동하면서용해된 ( 두가닥이풀린 ) DNA 염기를하나 씩노출시켜 DNA 의주형에맞게 RNA 를합성 전사기구 (RNA polymerase 포함 ) 가지나가면다시 DNA 는이중가닥을형성 RNA polymerase 의 σ subunit 가먼저 promoter 영역부근에있는공통배열을인식하면 RNA polymerase core enzyme 은전사개시점에결합. 또 σ subunit 는 DNA 의이중나선구조를부분 적으로풀어서주형으로작용할수있게한다. RNA polymerase 는평균 1 초에약 40 개의 ribonucleotide 단위를부가하는속도로 RNA 사슬 을신장시킨다. 3. 종결 (termination) : 유전자말단에존재하는 terminator 는전사종결의신호 RNA 중합효소와연계하여 DNA 주형과형성된 mrna 의결합을느슨하게함 Stream : 항상전사의방향은왼쪽에서오른쪽으로표기, 한쪽말단에서다른쪽말단으로흐름 Upstream : 전사개시부분과가까운부분, 유전자의왼쪽끝에가까운부분 대부분의 promoter 는유전자는 upstream 에존재, 유전자는 promoter 의 down stream 에존재

11 폐쇄형복합체형성 사슬개시가일어나려면개방형복합체를형성하여야함 ( 전사시작부위 -10근방에서 DNA 가닥분리 β, σ 소단위체부분 가닥이분리된다음 transcription bubble dl 전사될 DNA 염기서열을따라 + stream 쪽으로이동 RNA 중합효소는삽입된 ribonucleotide 사이에 phophodiester bond를형성 10개의 nucleotide가결합하면 σ-subunit 해리 재활용

12 Terminator ( 종결자 ) Rho-dependent termination (ρ factor) Rho-independent termination (auxiliary termination factor) Inverted repetitions Stem-and-loop structure

13 Terminator Rho independent <auxillary termination factor> RNA 가전사되는실제유전자의 downstream에있는특수한염기서열이 RNA 전사에종결에관여두가지메커니즘 1. 내인성종결 (intrinsic termination) : 종결부위 (temination site) 라고불리는특수한염기서열에의해조절 2개의역반복서열 몇개의다른염기에의해서로떨어져있는상태를형성 서로상보적이서고리형성 hair pin structure 유라실염기쌍의존재에의해 RNA가전사기구에서해리되어나옴

14 Terminator Rho dependent < ρ factor> 2. Rho protein에의한종결 : ρ단백질은 RNA와결합하여 RNA 중합효소를쫓아감 hair pin 구조를가지는 RNA 전사하면 RNA 중합효소는멈춤 ρ단백질이종결부위에도착하면전사기구가해리되는것을촉진 (ATP 필요 )

15 Prokaryotic 전사조절 - 대체 σ 인자 바이러스와박테리아는 RNA 중합효소를다른유전자로가도록인도할여러다른 σ subunit체를만들어가지고있는유전자를조절 처음숙주의 σ subunit 을이용하고숙주의 RNA 중합효소를이 용하여전사하여 gp28 이라는유전자를만듬 gp28 ( 바이러스나박테리아기원의 σ 단백질이므로바이러스와박테리아의유전자가더많이전사되도록한다 (σ subunit은재사용된다 / 숙주의 σ subunit과경쟁적으로작용하여전사기구를완전히변경시킴 ) Gp28 은 gp33, gp34 등의유전자발현을촉진하고이것으로생 긴단백질과다시협력하여후기단백질생산에관여함

(enhancer) 로서전사인자로서 (transcription factor, 단백질 ) 가부착되는 DNA의상의염기서열임 DNA

16 Prokaryotic 전사조절 - 전사증진인자 E coli 세포에서어떤특정유전자내에광역프로모터지역의상류부위에특정염기서열존재 Fis site : Fis라는단백질이결합, -60에서 -150까지, : RNA polymerase 가부착되는부분이아님으로 promoter는아니다 : 전사증진인자 (enhancer) 로서전사인자로서 (transcription factor, 단백질 ) 가부착되는 DNA의상의염기서열임 DNA 염기서열상에서전사인자가부착되어전사가촉진되면 그 DNA 영역을전사증진인자 DNA 염기서열상에서전사인자가부착되어전사가감소하면 그 DNA 영역을전사억제인자 (silencer) 라고부름

17 원핵세포의유전자활동조절 전사조절 : 단하나의조절부위의조절하에함께밀집되어있는유전자집단이며, 전사는 operator라는조절부위분절에억제자가결합되는지의여부에의해조절. 전사조절일반적형태 Negative control : repressor protein에의해 off 되지않으면발현. Positive control : activator protein 존재하여야만발현.

Operon 어떤특정대사경로의효소를암호화하고있는유전자들이단체로조절되어짐 경로의단백질을암호화하고있는유전자들이서로가까이함께존재하면서공통프로모터의조절을받음 polycistronic regulation 이러한유전자집단을 operon 이라고함 Operon : 작동유전자 조절유전자및구조유전자등에의하여통일적으로조절되어있는서로이웃한유전자군

18 Operon 어떤특정대사경로의효소를암호화하고있는유전자들이단체로조절되어짐 경로의단백질을암호화하고있는유전자들이서로가까이함께존재하면서공통프로모터의조절을받음 polycistronic regulation 이러한유전자집단을 operon 이라고함 Operon : 작동유전자 조절유전자및구조유전자등에의하여통일적으로조절되어있는서로이웃한유전자군 이러한유전자는항상전사되는것이아니라유도인자라고하는물질이있으면단백질합성이유발 유도 유도성단백질의예 E coli 의효소인 β- galactosidase β-galactosidase: lactose를구성하는단당류의갈락토우스와글루코오스사이의 glucosidic bond를가수분해함 E coli 의경우 lactose 만을탄소원으로생존가능 β-galactosidase 가필요 Lactose가있을때만 β-galactosidase 가발현 Lactose의대사물질인 allolactose가유도인자 / β-galactosidase가유도성효소임

19 Lac Operon tch?v=obwtxdi1zvk β-galactosidase의효소활성을갖게하는구조유전자는 lacz에의해암호화되어있고 lacy는 lactose 가세포안으로들어가게해주는 lactose 투과효소 (lactose permease) 를암호화하고있으며 laca는아세틸전이효소 (transacetylase) 로서 lactose 투 과와함께들어올수있는항생제에대한불활성담당 lacz, lacy, laca 는모두는 lac I라고하는조절유전자의조절을받음 Lac I의발현은억제인자 (repressor) 단백질을생산하여조절 음성적조절 (negative regulation)

20 Lac operon : On-Off system Lac 오페론에존재하는암호화부위는단하나의폴리시스트론 (polycistron) mrna 전사되며, 이 mrna 는젖당을대사하는세효소로번역 젖당분해과정시작 외부로부터젖당이계속공급되지않는다면세포내의모든젖당이분해되고, 젖당의농도가낮아짐에따라억제물질이다시 operator에결합 전사중지 전사가중지되더라도일정시간만들어진 mrna에의해단백질의농도는일정하게유지됨 Lac 오페론은젖당은있지만포도당이없을때에한해서유도

21 Inducer of lac operon 1) Lactose 2) IPTG Isopropyl-β-Dthio-galactoside (IPTG) lane 4-5, cells grown for 4 h at 37 after induction with IPTG (pmg130 and pet-3d/rg-rs); pet- 3d/RG-RS3 Induced by IPTG (43 kda) Purification :anion exchange chromatography DEAE-Toyopearl, Bio-Gel hydroxyapatite resin

22 Lac operon 은젓당 (lactose) 은있고포도당이없을때만유도 Glucose 와 lactose 가동시에존재하면 (lac operon 의발현에의해대사물질이분해 Lactose galactose+glucose) lac operon 은작동하지않음 (glucose 에의해 lac 단백질합성이억제됨 분해대사물억제 ) Positive regulation( 양성적조절 ) : 다른종류의단백질과 DNA의상호작용에의해조절 Lac promoter 자체는 RNA 중합효소에약하게결합되기때문에억제물질 (repressor protein+lactose) 이작동유전자부위에결합하지않는다하더라도즉시전사가일어나지못함 대사물활성자단백질 (catabolite activator protein, CAP ) 필요 CAP은 RNA 중합효소가 promoter에효율적으로결합할수있도록도와주는부속단백질, 포도당이없을때에만 promoter 부위에결합 세포내포도당의농도가떨어지면 ATP 대사유도체인환상 AMP(cyclicAMP;cAMP분자증가 camp가 CAP에결합해야만 CAP가 lac promoter에결합하여전사를촉진 유전자발현

Chapter 26

Chapter 26 11 주 RNA 합성 11.1 DNA-dependent synthesis of RNA: Bacteria에서의 transcription l RNA polymerase (5 subunits로구성 : 2α, β, β, σ) l 효소에의한 RNA 합성의특징 - Complementary sequence to template DNA - RNA chain의합성방향 : 5