생체계측

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주실 태
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1 Chapter 6 차세대단백질해석툴의개발 요코야마켄지 ( 산업기술종합연구소 bionics 연구센터부센터장 ) Honggu Chun, Ph.D.

2 Introduction 단백질해석의어려운점 DNA, RNA 는 PCR 법등증폭이가능하나단백질은불가 Translation 후에 post processing, modification 등이일어나기때문에 DNA 나 mrna 조사만으로는모든정보를알수없음 단백질해석의중요도 단백질의인산화, 당전이등은질환과연결되므로, 이러한해석은중요함

3 Introduction 단백질해석의방법 - 이차원전기영동법 등전점전기영동 (IEF, isoelectric focusing) 에의해단백질의전하 ( 등전점 ) 을기초로한만큼분리를실시 도데실황산나트륨 (sodium dodecyl sulfate, SDS)- 폴리아크릴아마이드겔전기영동 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 에의해, 단백질의분자량을기초로한만큼분리를실시 난점 단백질시료가 IEF 겔에침투할때까지의시간, 단백질을염색하는시간, 과잉인색소를제거하는시간을합하면, 1~2일이필요 IEF 후의겔을 SDS-PAGE 겔의시작지점까지이동시키는것이필요하다는점등자동화가어려움

4 Introduction - 목표 IEF 와 SDS-PAGE 를 on-chip 화한이차원전기영동시스템의개발 IEF와 SDS-PAGE는일체화하고있지않지만, 반송시스템을이용하는것으로이차원전기영동을전자동화한시스템의개발 유전자발현에있어서의전사조절인자를하이 throughput 해석하기위한칩의개발 DNA에결합하는전사조절단백질의분석은, 세포내특정관심대상그룹, 시그널전달을해석하는데있어서지극히중요 전사조절단백질이결합하는 DNA 배열의분류, 기존전사조절인자의정량을행하기위한마이크로어레이의개발을실시

5 Introduction 기존의 DNA 결합단백질의해석 - gel shift assay 법 단백질이 DNA 에결합하면그전기영동속도가저하되는원리에근거 검출감도가낮아, 하이 throughput 분석이곤란해, 전체적인전사조절단백질의해석어려움 DNA 결합단백질의해석의최근방법 probe DNA 를기판상에고정화해, 전사조절단백질결합후, 그에대한항체를작용시켜검출하는 kit 나 chip 다종의전사조절단백질을검출하기위해서는, 그종류의수만큼항체가필요 제안된 DNA 결합단백질의해석방법 exonuclease, DNA polymerase 등흔히있던 DNA 수식효소와그기질을이용하는것만으로가능 하이 throughput 에해석하기에적당

6 잠깐! 단백질분석방법 Electrophoresis radioactive isotope method NMR Mass spectroscopy separating ions by their mass-to-charge (m/z) ratios detection of compounds by separating ions by their unique mass It s important to keep protein samples fresh and to load them immediately

7 2. on-chip 이차원전기영동시스템 IEF 와 SDS-PAGE 를일체화한이차원전기영동칩을제작 ( 폴리메틸메타아크릴레이트 ) 두께 3mm, 폭 70mm, 깊이 70mm

8 2. on-chip 이차원전기영동시스템 통상의 IEF + SDS-PAGE 시스템과의비교 통상의 IEF 단백질시료용액을 IEF 겔에첨가후, 겔이팽윤후, 단백질이겔내에침투할때까지 8 시간정도걸림 IEF 자체도 3 시간정도걸림 제작된칩 침투 팽윤시간 15 분, IEF 시간 10 분으로도충분히 focusing 된 IEF 의결과를얻을수있음 원인 : IEF 겔의폭을 1mm 이하로하는것으로, 겔의팽윤, 단백질의침투가빨라진것

9 2. on-chip 이차원전기영동시스템 통상의 IEF 와 SDS-PAGE 시스템과의비교 통상의이차원전기영동에서는 IEF 종료후, IEF 겔을이차원겔의옆에이동시키는조작이들어가지만, 본칩으로는일체화하고있기때문에그필요가없음 IEF와SDS-PAGE의겔사이연결 전기적연결 junction gel로서아가로스로틈을채워, 전기영동시키는것으로, 이차원목의 SDS-PAGE 겔에단백질시료를이동시킴 SDS-PAGE 종료후에칩내단백질의염색은곤란하므로, IEF 종료후에완충액의교환을실시하는것과동시에, 단백질의수식을실시 염색은, N-하이드록시스크신이미드에스텔형 Cy5를이용해단백질의아미노기에수식

2. on-chip 이차원전기영동시스템 결과 초기에는선명한 SDS-PAGE 의결과는얻을수없었음 문제점은, IEF 와 SDS-PAGE 의사이에, 염색을실시하고있어과잉의 Cy5 가남아버리기때문에, 단백질의 spot 이보기나쁜이차원전기영동화상이되어버린것 ( 그림 2a) 과잉인 Cy5 가레저버에비집고들어가, 전기영동해오지않게, IEF

10 2. on-chip 이차원전기영동시스템 결과 초기에는선명한 SDS-PAGE 의결과는얻을수없었음 문제점은, IEF 와 SDS-PAGE 의사이에, 염색을실시하고있어과잉의 Cy5 가남아버리기때문에, 단백질의 spot 이보기나쁜이차원전기영동화상이되어버린것 ( 그림 2a) 과잉인 Cy5 가레저버에비집고들어가, 전기영동해오지않게, IEF 겔을아가로스로둘러쌈 SDS 농도를올려정전류법으로변경, 검출계로서이용하고있는여기광원, CCD 카메라배치의개량등을실시한결과, background 형광이억제당한외형깨끗한이차원전기영동화상을얻음 ( 그림 2b) 통상의 SDS-PAGE 에서는약 40 분, 단백질의염색, 탈색에는 8 시간정도걸리지만, 본칩으로는, 염색 5 분, SDS-PAGE 20 분에종료

11 2. on-chip 이차원전기영동시스템 결과 통상의이차원전기영동에서는전공정에 10 시간이상걸려, 또한겔을이동시키는것이필요해, 아직자동화되어있지않음 본칩으로는, 일차원목 IEF를위해서단백질시료를주입하고나서, 이차원 SDS-PAGE의이차원형광화상을얻을수있을때까지, 50분이되어, 개시당초목표인 1시간이내를달성 그러나, 일차원목과이차원목의전기영동사이에실시하는아가로스의주입등, 제품화하기위해서는어려운문제점이있음 따라서, IEF, SDS-PAGE 비일체형의전자동이차원전기영동시스템개발

12 3. 전자동이차원전기영동시스템 on-chip 이차원전기영동시스템개발? 일차원목과이차원목의연결, 단백질의염색등, on-chip형에서는해결하기어려운점이있음 IEF, 염색, SDS-PAGE를무리하게일체화하지않고, 반송시스템을이용하는것으로, 전자동으로이차원전기영동을실시할수있는시스템을개발 ( 전체시간 1시간이하 )

13 4. 전사조절단백질해석칩 DNA 수식효소인 exonuclease III (Exo III), Taq DNA polymerase (Taq) 에의한효소반응을이용한, 신속하고간편한신규전사조절단백질검출계 (Exo-Taq 반응 ) 의개발

14 4. 전사조절단백질해석칩 과정 ( 그림 4) probe DNA- 단백질복합체의형성 ExoIII 에의한 probe DNA 의소화 Taq 에의한 probe DNA 에의형광표지한 2'-deoxyuridine-5'- triphosphate (dutp) 의읽어들이기

15 4. 전사조절단백질해석칩 장점 단백질시료의표지의필요가없음 검출대상단백질에대한항체도필요로하지않음 따라서, 다양한 DNA 결합단백질의검출에이용할수있음 효소반응을이용하기때문에비특이적흡착에의한 background 의증가가없음 Exo III, Taq 에의한효소반응은모두고속으로있기때문에 ( 소화 10 base / sec, 신장 60 base/sec), 단시간에서의검출이가능함 기판상에서반응을실시하는것으로마이크로어레이에의한전사조절단백질의하이 throughput 해석에의응용도가능

16 4. 전사조절단백질해석칩 Exo-Taq 반응에의한용액중에서의 DNA 결합전사조절단백질의검출예 - Lambda 살균바이러스의전사인자 Cro 줄기부분에 Cro의결합사이트를가지는줄기루프구조의 probe DNA (Probe 1) 를 Cro와결합반응을실시 3' 5' exonuclease 활성을가지는 Exo III로 probe DNA를소화 Taq에의한 probe DNA의신장을기질에형광표지 dutp (Alexafluor488-5-dUTP) 를다른3 종류의nucleotide와함께이용 Cro가결합하고있는경우에서는 probe DNA의소화가결합사이트부근에서정지해, 남은 3' 옆의 DNA 쇠사슬이 primer로서작용하기때문에, probe DNA에형광표지 dutp가받아들여짐 단백질이결합하고있지않는경우에서는 probe DNA의 3' 옆은소화되어버리기때문에신장반응은일어나지않음

17 4. 전사조절단백질해석칩 결과 Cro의결합부위를가지는 Probe 1으로 Cro를반응시켰을경우, 특이적인밴드가확인 ( 그림 5, Lane 1,2) Probe 1만으로 Exo III, Taq에의한반응을실시했을경우 ( 그림 5, Lane 3) 나 Cro의결합부위를가지지않는컨트롤의 probe DNA (Probe 1C) 와 Cro를반응시켰을경우 ( 그림 5, Lane 4) 에서는특이적인밴드는확인되지않았다 시간 : 소화 3분, 신장 3분에검출가능하고, 전사조절단백질의신속해석에의응용이가능

18 4. 전사조절단백질해석칩 기판상에서의 Exo-Taq 반응에의한전사조절단백질검출 기판상에 probe DNA 를고정화해, 시료단백질을결합시킨후, 표면상에서 Exo-Taq 반응을실시하는것으로 DNA 결합단백질의검출을시도 줄기루프구조의 probe DNA 의 5' 말단을아미노화해 N- 하이드록시스크신이미드에스텔화한폴리아크릴아미드피복한유리기판에공유결합에의해고정화 기판상에고정화한 probe 와 Cro 의결합반응을실시한후, Exo III 에의한소화, Taq 에의한신장반응 ( 기질에형광수식 dutp 를사용 ) 을각각시행 기판을가열한 0.1 % SDS 용액으로세정한후, 형광이미지스캐너로, 해석을실시했는데, Cro 결합부위를가지는 probe 로 Cro 농도에의존한형광시그널이관측됨 컨트롤의 probe 에서는특이적인형광시그널은볼수없었음 기판상에있어도 Exo-Taq 반응에의한 DNA 결합단백질의검출이가능해있는것이확인됨

19 4. 전사조절단백질해석칩 기판상에서의 Exo-Taq 반응에의한전사조절단백질검출 컨트롤의 probe 에대한 background 의원인이 ExoIII 에의한 probe 의소화시에 3' 옆의수염기가미소화인채남는것으로추측하여, probe 의배열을개선하고 probe 의고정화위치에대해서도검토를실시 그결과, background 의저하에의한검출감도의개선됨 Exo-Taq 반응에서는, probe DNA 에형광수식 dutp 는공유결합으로받아들여지기때문에, 반응후의기판의세정은엄격한조건으로가도결과의시그널에영향을주지않음 Exo III, Taq 에의한반응은단시간인것으로부터, 검출은 7 분 ( 소화 : 1 분, 신장 : 5 분, 세정 : 1 분 ) 에가능 신속하고간편하게 DNA 결합단백질의 high throughput 해석이가능 세포에발현하고있는전사조절단백질의망라적해석외, 단백질결합부위의 screening, DNA 결합저해제또는촉진제의스크리닝등에의응용이기대됨

20 5. 전망 단백질시스템칩및그시스템은, 지금까지매우일부의 technician 밖에가능하지않았던이차원전기영동을, 누구나가간편하고신속히실시하는것을가능하게하는획기적인툴임 장치, 소모품을포함한전이차원전기영동관련품의세계의시장규모는, 313,000,000$ (2003년) 이지만기당쇄수식이나인산화등, 단백질의번역후수식을아울러해석할수있는칩이개발되면, 한층더시장규모는커질것임

Microsoft PowerPoint - Chapter 3-2

Microsoft PowerPoint - Chapter 3-2 Chapter 3 단백질의탐구및단백체학 (3) 겔거르기 (Gel filtration) chromatography: 크기에의한분리 - Resin: 다공성구슬 = Sephadex, Sepharose, Biogel = Bead size: 100 mm - 원리 : 분배 (partition) chromatograph = 분배 : 용질이이동상 (mobile phase)