Chapter 11

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자옥 홍
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1 Chapter 16 RNA polymerase II: regulation 1

2 16.1 Regulatory promoter and enhancer 박테리아 gene regulation 을볼때진핵세포의 regulatory element 는 transcription initiation site 의바로윗부분에위치할것으로간주됨. 이를조사하기위하여해당부위의일부 DNA 를제거하면필수부위가제거되어문제가생기기도하지만 flanking DNA 서열의간격을변화시켜문제가생기기도한다. 이들중어느것이문제인가를알기어렵다. Linker-scanning mutagenesis; 위의문제를해결하기위하여관심있는지역의짧은 DNA 분절을동일한크기의 random sequence 를갖는 DNA linker 로교체한후조사함. SV 40 thymidine gene 의 regulatory element 를조사하기위하여전사개시부위의 upstream 지역을 linker DNA ( 노란색 ) 로대치함. 대치후 Xeponous oocyte 내로 injection 한후 thymidine gene 이 mrna 를만드는가를조사함. Figure

2 Regulatory promoter; TATA box; core promoter의일부 CCAAT box와 GC box; 개시부위로부터 50-200bp

3 Thymidine kinase promoter elements identified by linker scanning SV 40 thymidine gene 의조절부위를조사 linker DNA 로교체한후푸른색은 mrna 의발현에차이가없는것이고붉은색은 mrna 의발현이줄어든것을표시함. Figure 16.2 Regulatory promoter; TATA box; core promoter의일부 CCAAT box와 GC box; 개시부위로부터 bp upstream에위치하며 regulatory promoter 혹은 proximal promoter라고한다. 그러나 CCAAT box는일부유전자에서는존재하지않으며일부유전자에서는존재하는위치가다양하다. 3

4 Enhancers SV 40 의전사연구로부터 TATA box 를포함하는 core promoter 부위와 6 개의 GC box 를포함하는 regulatory promoter 부위를발견함. 또한 regulatory promoter 바로위에두개의동일한 72bp 지역을발견. 하나를제거하면초기전사의소량의감소가있으나두개모두제거되면 100 배가감소된다. 이부위를 enhancer 라고하며두가지특징을지님. 1) enhancer 는몇천 bp upstream 이나 down stream 에위치하여있더라도올바른전사개시위치에서전사가일어나게한다. 2) enhancer 는어느방향으로위치하던전사를촉진시킨다. 근래에많은종류의다른 enhancer 가발견되었고크기는 50bp 에서 1.5 kbp 이며 regulatory promoter 처럼 module cluster 를갖고있다. 실제로 CCAAT 나 GC box 를갖고있는것도있다. 세포는 enhancer 나 regulatory protein 내의 module 에결합하는 transcription activator protein 이있으며결합에의하여전사가극대화된다. repressor protein 에대한 regulatory site 가존재하나우리는 activation 을주로배운다 UAS (upstream activating sequence): 효모에서발견되는단일 regulatory region이며전사개시부위로부터수백 bp내에존재한다. forward나 reverse orientation으로작용하나 4 전사개시부위보다 downstream에있을경우는작동하지않는다.

16.2 Transcription Activator proteins 진핵세포에서는전사를위하여 transcription activator protein 을필요로한다. 이들은최소한두개의영역으로되었으며 DNA-binding domain 과 activation domain 을포함한다.

Activation domain 은유전자로다른 transcription machinery 의구성분을불려드리며이들과전사를촉진하기위하여다양한 interact 를한다.

5 16.2 Transcription Activator proteins 진핵세포에서는전사를위하여 transcription activator protein 을필요로한다. 이들은최소한두개의영역으로되었으며 DNA-binding domain 과 activation domain 을포함한다. ( 그림참조 ) DNA-binding domain 은유전자의 regulatory promoter 나 enhancer 의특정서열에결합한다. DNA binding domain 은몇가지의 folding pattern 을갖고있으며앞으로 folding pattern 에대하여공부할예정임. Activation domain 은유전자로다른 transcription machinery 의구성분을불려드리며이들과전사를촉진하기위하여다양한 interact 를한다. 다른부가적인구조를갖고있으며 nuclear localization signal, nuclear export signal 이있어핵과세포질간의이동을가능하게하며 dimerization domain 은동일하거나다른 activator protein 과 homodimer 혹은 heterodimer 를이루게한다. 또한 ligand binding domain 이있어 steroid hormone 같은작은물질이나 ligand 와결합을하여결합물질에대하여반응을하게함. dimerization 과 ligand binding domain 에대하여다음에자세히배운다. 5

6 초기에는 regulatory promoter 와 enhancer 는완전히다른형태의조절부위로생각하였으나동일한서열이양쪽모두에서발견되는등두개의구분이모호해졌다. 또한동일한 activator protein 이양쪽에결합하기도한다. 그림처럼 DNA looping 에의하여두개의 activator protein 이가까워져서이들의 activation domain 이협동적으로작용하여유전자로 transcription machinery 를불러드린다. 유전자의활성은이들의 activation domain 이얼마나협동적으로작용하여유전자에 transcription machinery 를불러드리느냐에달려있다. Figure 16.6 DNA looping occurs between regions bound to activator proteins 6

transcription activator protein 을포함하는핵추출물과 sonicate 된 calf thymus DNA 를반응시킨후 column 을통과시키면무작위로 DNA 에결합하는단백질 (thymus DNA 에결합 ) 과결합하지않는단백질은 column 을통과하고 activator protein 만 bead

7 transcription activator protein 의분리및분석 DNA affinity chromatography 를이용하여 transcription activator protein 을분리함. transcription activator protein 이결합하는 tandem repeat sequence motif 를갖는 DNA fragment 를합성하여 bead 에결합시킴. transcription activator protein 을포함하는핵추출물과 sonicate 된 calf thymus DNA 를반응시킨후 column 을통과시키면무작위로 DNA 에결합하는단백질 (thymus DNA 에결합 ) 과결합하지않는단백질은 column 을통과하고 activator protein 만 bead 에결합한다. high salted buffer 를이용하여결합한 activator protein 을 elution 시키고분석을한다. Transfection assay; transcription activator protein 유전자를 clone 한후 cell based assay 를이용하여능력을측정함. 한 plasmid 는 activator protein gene 을갖고다른것은 reporter 유전자와 activator protein 의결합부위를갖는다. 이들을 host cell 로 transfection 시킨후 reporter gene 의 mrna 가발현하는가를조사함. 7

16.3 DNA-binding domains with helix-turn-helix structure transcription activator protein 은 DNA-binding domain 의구조에따라구분을하며유사한구조를갖는단백질은유사한기능을한다. helix-turn-helix motif 는이미 E.

8 16.3 DNA-binding domains with helix-turn-helix structure transcription activator protein 은 DNA-binding domain 의구조에따라구분을하며유사한구조를갖는단백질은유사한기능을한다. helix-turn-helix motif 는이미 E. coli 의 lac repressor 나 camp receptor protein (CRP) 에존재하며진핵세포에서는초파리의 homeotic (HOM) 유전자로알려진 8 개의발달유전자연구시발견되었다. HOM 유전자는초파리의 anterior-posterior 축을따라서세포들이각각다른지역에위치하게끔한다. HOM 유전자는염색체 3 의두개의적은구역에위치하며 Antennapedia complex 에위치한유전자는머리와가슴상부를조절하고 bithorax complex 에위치한유전자는가슴하부와배부위를조절한다. 염색체상의유전자들의순서는 embryo 의 anterior 와 posterior axis 에따른순서와동일하다. HOM 유전자에돌연변이가일어나면대개 lethal이고 Antennapedia 유전자에돌연변이가일어나면그림처럼 antenna가위치할부위에다리가생기기도한다. 8

Vertebrate 도 Hox 유전자로알려진 homeotic 유전자를갖고있다. Mammalian 세포는 38 개의 hox 유전자를갖고있으며 HoxA, HoxB, HoxC, HoxD 로알려진 4 영역에존재한다. 각각의영역은길이가 100kb 이며다른염색체에존재한다. ( 그림참조 ) 중간그림은 bilateral animal 의조상을가정함.

9 Vertebrate 도 Hox 유전자로알려진 homeotic 유전자를갖고있다. Mammalian 세포는 38 개의 hox 유전자를갖고있으며 HoxA, HoxB, HoxC, HoxD 로알려진 4 영역에존재한다. 각각의영역은길이가 100kb 이며다른염색체에존재한다. ( 그림참조 ) 중간그림은 bilateral animal 의조상을가정함. Homeotic genes specify transcription activator proteins. 초파리의 homeotic 유전자는 180bp (60개의아미노산을암호화 ) 길이의 helix-turn-helix 영역이있는것을발견하고 homeobox 라명명함. 이 box는효모, 식물, 척추동물등에모두존재함. 1. homeobox 단백질은 regulatory promoter와 enhancer에 sequence-specific manner에의하여결합함. 2. homeobox 단백질은 activator protein이나 repressor protein으로작용. 3. 조절부위에이들이결합하는것은 in vivo나 invitro나동일함. 9

homeodomain 과 DNA 의구조 ; 3 개의 helix 로되었으며 helix1 과 2 는 short loop 로연결되고 helix 2 와 3 는 turn 에의하여연결되어 helix-turn-helix

10 Homeobox proteins have activation and DNA binding domains homeobox protein 은두영역으로되어있으며 N-terminal 은 activation domain 이고 C-terminal 은 60 개의아미노산으로되어 homeodomain (DNA-binding domain) 이다. homeodomain 과 DNA 의구조 ; 3 개의 helix 로되었으며 helix1 과 2 는 short loop 로연결되고 helix 2 와 3 는 turn 에의하여연결되어 helix-turn-helix 구조를이루어 DNA 와 sequence specific contact 를한다. helix3 은 recognition helix 로 5 -ATTA-3 (5 -TAAT-3 ) 를갖는 DNA 분절의 major groove 에맞게되어있다. N-terminal arm 은 minor groove 에결합하여 DNA 가단백질에고정되게한다. 10

Pou proteins have a homebox and a POU domain POU transcription activator protein 은 histone, immunoglobulin, growth factor 등의발현을조절하며두종류의 helix-turn-helix motif 를갖고있다.

11 Pou proteins have a homebox and a POU domain POU transcription activator protein 은 histone, immunoglobulin, growth factor 등의발현을조절하며두종류의 helix-turn-helix motif 를갖고있다. Octanucleotide sequence (ATGC AAAT) 에결합하기때문에 Oct-1, Oct-2 transcription activator protein 이라고부른다. 그림은 Oct-1 transcription factor 를나타내며 DNA 에결합하는푸른색지역과 activation domain ( 핑크 ) 을볼수있다. POU 지역은 75 아미노산의 POU-specific sub domain (POU S ) 과 60 아미노산의 POU homeodomain (POU H ) 이있으며 linker 지역이존재하여이들이연결되어 POU region 을만든다. Oct-1 POU region 이 DNA 에결합하는모양은교과서그림 를참조할것. 11

16.4 DNA binding domains with zinc fingers 많은 transcription activator protein 은 zinc ion

16; TFIIIA 에존재하는 9 개의계속되는 zinc finger sequence motif.

이 sequence motif 를 zinc finger 라고하며 DNA 를잡는데도움이된다.

12 16.4 DNA binding domains with zinc fingers 많은 transcription activator protein 은 zinc ion 에의하여안정화되는 DNA 결합부위를갖고있다. 5S RNA 합성을조절하는 TFIIIA transcription factor 에서발견을함. 그림 16.16; TFIIIA 에존재하는 9 개의계속되는 zinc finger sequence motif. N-terminal 쪽에한쌍의 cysteine 이있고 C-terminal 쪽에한쌍의 histidine 이존재하며이들이상호작용하여 zinc 와결합을한다. 이 sequence motif 를 zinc finger 라고하며 DNA 를잡는데도움이된다. 이곳에서배운 zinc finger 를 Cys 2 His 2 zinc finger 혹은 classical zinc finger 라함. Figure 푸른색 ; histidine, 노란색 ; cysteine 왼쪽은 α-helix, 왼쪽은 β-strand모양을나타냄. α-helix의 His-19, His-23과 β-strand의 Cys-3 Cys-6과 zinc ion에결합. 12

13 어떻게 zinc finger protein 이 DNA 와결합하는가? 그림 ; mouse transcription activator protein Zif268과 DNA complex. zinc finger protein은 DNA와반복적인접촉을한다. mouse transcription activator protein인 Zif268은 3개의 C 2 H 2 zinc finger motif를갖고있으며서로짧은 linker로연결되어있다. 3개의 zinc finger는 DNA에있는인접한 3-bp sub-site에결합하고 zinc finger 지역이 DNA helix의한 turn을둘러싼다. 그림 ; Cys 2 His 2 zinc finger motif 와 Zif268 finger sequence. 각 zinc finger 의 α-helix 는 major groove 에적합하며 helix 시작부위로부터 -1,2,3,6 위치에있는잔기가 major groove 에있는 base 에특별한접촉을한다. short linker region 이인접한 zinc finger 를연결하는데 TGEKP 라는 consensus sequence 가있다. 13

thyroid receptor 는핵내에존재하며 free receptor form 과 receptor-ligand complex form 모두 DNA 에결합한다.

14 Nuclear receptor superfamily 에는다른종류의 zinc finger motif 가존재한다. Nuclear receptor 는 higher organism 에서특정유전자의발현을높임으로써외부나내부의화학적신호에반응을한다. Nuclear receptor 는 steroid hormone, thyroid hormone, vitamin D, retinoic acid 등에결합하는핵내단백질로발견이됨. receptor-ligand complex 는 regulatory promoter 와 enhancer 등에결합하여 activator protein 으로작용함. thyroid receptor 는핵내에존재하며 free receptor form 과 receptor-ligand complex form 모두 DNA 에결합한다. 그러나 free form 은유전자의발현을억제하고 complex form 은발현을촉진한다 Nuclear receptor 의일반적인구조 ; AF-1; poorly conserved activation domain DBD; highly conserved DNA-binding domain LBD; conserved ligand binding domain AF-2; second activation domain glucocorticoid receptor; DNA 결합부위에두개의 Cys 4 finger motif 가존재. 한 zinc 는 DNA 와결합하는 recognition helix 를안정화. 다른 zinc 는 receptor 가 dimer 를만들게하는부위를안정화시킴. receptor 가 DNA 결합하는 glucocorticoid response element (GRX) 두개의 palindromic half site 가 3 개의염기를두고분리됨 14

( 앞장그림참조 ) homodimer 에존재하는두개의 DNA-binding domain 은 DNA 의같은방향의 major groove 에결합한다.

15 Glucocorticoid receptor binding domain bound to DNA Steroid receptor (Glucocorticoid receptor 혹은 estrogen receptor 등 ) 는 homodimer 로 DNA 에결합. 즉두개의 DNA binding 부위가 DNA 에결합한다. 두개의 DNA binding domain 이 head-to-head 로연결되어대칭구조를이룬다. dimerization loop 는두번째 zinc finger 내의 Cys 내에존재한다. 이들은 homodimer 의안정화에기여한다. ( 앞장그림참조 ) homodimer 에존재하는두개의 DNA-binding domain 은 DNA 의같은방향의 major groove 에결합한다. 첫번째 zinc finger 의 α- helix 는 recognition helix 로 DNA 에직접결합하고두번째 α-helix 의 zinc finger 는 recognition helix 가제자리에있게끔도와준다. homodimer 가 DNA 에결합하는서열을 hormone response element 라고하며 3bp spacer 에의하여떨어져있는 inverted 6bp repeat 로된불완전한 palindrome 이다. 5 -AGAACA-3 과 5 -AGGTCA-3 등이다. 15

Heterodimer 를이루는 nuclear receptor protein; 9-cis-retinoic acid 의 receptor 인 retinoid X receptor (RXR) 와

receptor (RAR) peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) 등이있다.

16 Heterodimer 를이루는 nuclear receptor protein; 9-cis-retinoic acid 의 receptor 인 retinoid X receptor (RXR) 와 dimerization 을이루는것에는 thyroid receptor protein (TR), vitamin D receptor (VDR), the retinoic acid receptor (RAR) peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) 등이있다. RXR 의 DNA binding domain 은 hormone response element 존재시해당하는 heterodimeric partner 와결합을하여 full length receptor 로작용을한다. hormone response element 는 AGGTCA 라는서열이 direct repeat (DRs) 에의하여분리되고이지역의염기의수에따라서결합의 specificity 가결정된다. ( 그림참조 ) 즉 RXR-VDR response element 의 spacer 에 1bp 를첨가하면 RXR-TR response element 로바뀐다. 우측그림 ; RXR 이 heterodimer 를만들어 DNA 와결합하는모형 16

The ligand binding domain of nuclear receptors Figure 16.28 ligand binding domain 은 hormone binding site 를포함한다. ligand binding domain 은 ligand 가결합하거나 antagonist 가결합하면형태의변화를야기. 그림 16.

17 The ligand binding domain of nuclear receptors Figure ligand binding domain 은 hormone binding site 를포함한다. ligand binding domain 은 ligand 가결합하거나 antagonist 가결합하면형태의변화를야기. 그림 16.28; (a) ligand 가없는경우의 retinoid X receptor (RXR) ligand binding domain. (b) ligand 가결합한경우구조가바뀌어 ligand binding pocket (LBP) 에있는 ligand 를에워싼다. (c) antagonist 가결합한경우도구조가변화. 그림 16.29; Hormone antagonist Estradiol; estrogen receptor 에작용하는정상 estrogen Tamoxifen, Raloxifene; antagonist Tamoxifen은 estrogen의대체물로작용. estrogen은유방의정상세포나변화된세포의 proliferation을일으켜서유방암을야기한다. 그러므로유방암환자에게 estrogen 대신에 tamoxifen을사용하면 estrogen이야기시키는 cell profilation을막아암을예방할수있다. 그러나다른부작용도있어오히려 uterine cancer을야기시키기도함. 17

The Gal4, a yeast transcription activator protein belong to the Cys6 zinc family. Gal4 는 Zn 2 C 6 binuclear cluster 를이루며두개의 zinc ion 이 6 개의 cysteine 과결합을한다.

잔기 51-64 ( 푸른색 ) 는 weak dimerization 을만듬. 잔기 41-50 ( 노란색 ) 은 linker 를이룬다.

18 The Gal4, a yeast transcription activator protein belong to the Cys6 zinc family. Gal4 는 Zn 2 C 6 binuclear cluster 를이루며두개의 zinc ion 이 6 개의 cysteine 과결합을한다. Gal4 는효모에서 galactose metabolism 에사용되는유전자를조절하는 transcription activator protein 이다. 그림 ; Gal4 protein 의아미노산잔기 1-40 ( 붉은색 ) 은 Zn 2 C 6 binuclear cluster 를만들어 DNA 와결합. 잔기 ( 푸른색 ) 는 weak dimerization 을만듬. 잔기 ( 노란색 ) 은 linker 를이룬다. Domain swapping experiment; (a) Gal4 trancsription activator protein은 Gal4 site에결합 (b) Ppr1 activator protein은 Ppr1 DNA site에결합 (c) Ppr1 zinc cluster, Gal4 linker, Gal4 dimerization을포함하는 chimera 1은 Gal4 site에결합 (d) Ppr1 zinc cluster, Ppr1 linker, Gal4 dimerization 을포함하는 chimera 2는 Ppr1 site에결합. 18 결론 ; linker 지역이 binding specificity를결정함.

16.5 DNA binding domain with basic region leucine zippers 여태까지배운것은 globular structure

domain 인 basic region leucine zipper (bzip) protein 을갖는 activator protein 에대하여배운다.

leucine zipper의구조. leucine은 ball과 stick으로표시. leucine은 side to side 접촉을한다.

19 16.5 DNA binding domain with basic region leucine zippers 여태까지배운것은 globular structure ( 공모양 ) 의 DNA-binding domain 을갖는 activator protein 에관한것이고이제는 fibrous DNA-binding domain 인 basic region leucine zipper (bzip) protein 을갖는 activator protein 에대하여배운다. 그림 ; 효모의 general control of nitrogen metabolism을조절하는 activator protein (Gcn4) 의 leucine zipper의구조. leucine은 ball과 stick으로표시. leucine은 side to side 접촉을한다. 우측그림 ; α-helix는한 turn당 3.6 residue가있고그림은 two helical turn을나타내는 7개의아미노산을나타내며 two turn (7번째위치 ) 당하나의 leucine이존재함을보여줌. 19

그러면어떻게 Gcn4 dimer 가 DNA 와 interact 하는가를살펴보자. leucine zipper motif 바로옆에 basic ( 염기성 ) 아미노산이존재하며 DNA recognition 을위하여필요하다. basic amino acid 서열은 leucine zipper 과함께 bzip DNA binding domain 을만든다.

20 그러면어떻게 Gcn4 dimer 가 DNA 와 interact 하는가를살펴보자. leucine zipper motif 바로옆에 basic ( 염기성 ) 아미노산이존재하며 DNA recognition 을위하여필요하다. basic amino acid 서열은 leucine zipper 과함께 bzip DNA binding domain 을만든다. 또한중간에 activation domain 이존재한다. Gcn4 DNA-binding domain 과 DNA 분절 ; basic 아미노산 ( ) 은보라색으로표시되고 leucine zipper 지역 ( ) 은 blue 로표시됨. leucine side chain 은노란색으로표시 DNA 서열 ; 각각의 polypeptide chain 은 helical 구조를이루며 quasi ( 유사 ) palindrome ( 붉은색 ) 의끝에존재하는 major groove 의 half-site 에결합을함. 20

c-jun and c-fos functional domains Ap-1 단백질은 cellular

oncogene 인 c-fos 와 c-june 에대하여배운다이들은그림처럼 bzip

그러나 c-fos는그림에서보듯이 charge repulsion이 e와 g에위치한 negatively

21 c-jun and c-fos functional domains Ap-1 단백질은 cellular proliferation 을조절하는 activator protein 의모임이며이곳에서 oncogene 인 c-fos 와 c-june 에대하여배운다이들은그림처럼 bzip transcription activator protein 으로작용을한다. c-june은 homodimer로결합을하고또한 c-june c-fos heterodimer로결합을하여작용한다. 그러나 c-fos는그림에서보듯이 charge repulsion이 e와 g에위치한 negatively charged side chain간에일어나 homodimer를형성하지못한다. 교과서그림 16.40은 June-Fos heterodimer가 Ap1 recognition element base sequence (TGAGTCA) 에결합하는것을보여줌. 21

22 16.6 DNA binding domains with helix-loop-helix structure 일부 transcription activator protein 은 helix-loop-helix (HLH) motif 를갖고있다. MyoD (myogenesis 즉근육세포를분화시키는데작용하는 transcription regulator) 가만드는 complex 에서 HLH motif 가존재하며 cognate DNA 에결합한다. HLH motif 는 dimerization site 로작용하며두개의 subunit 가모여 4 개의 helix bundle 을만든다. 그림에서 loop 는보라색으로표시되며길이가 5-24 residue 가된다. 초록색은 N-terminal 쪽에위치하며 basic recognition sequence 를의미하고 DNA 의 major groove 에결합한다. MyoD 와같은성질을갖는것을 bhlh activator protein 이라고하며 DNA recognition element 서열이 CANNTG 인곳에결합한다. 22

bhlhzip proteins have both HLH and leucine zipper motifs 많은

zipper site 도있다. 이들을 bhlh zip protein 이라고하며일부는정상세포를암세포로전환시킨다.

leucine zipper (Zip) 는노란색 Myc protein 은 homodimer

23 bhlhzip proteins have both HLH and leucine zipper motifs 많은 transcription regulator 는 HLH motif 의 c-terminal 쪽에 leucine zipper site 도있다. 이들을 bhlh zip protein 이라고하며일부는정상세포를암세포로전환시킨다. 그림에서 basic recognition helix 는푸른색 HLH 는회색. leucine zipper (Zip) 는노란색 Myc protein 은 homodimer 를만들지못하고특정한상황하에 Max 와결합하여활성이있는 Myc Max transcription regulator 를만든다. 이들은세포의성장과발달에영향을미치며 Max 는 Mad 와결합하기도한다. 23

24 16.7 Activation domain 다양한 transcription activator protein 의 DNA-binding domain 에관하여그동안배웠으며이제 activation domain 에대하여배울것이나많은것이알려지지않았다. 즉공통적인구조등이밝혀지지않았기때문이다. Mechanisms for transcriptional activation by activator proteins activation by recruitment activation domain interacts with one or more components of the transcriptional machinery and stabilizes its binding to the template DNA activation by conformational change activation domain induces a conformational change in the transcriptional machinery to stimulate RNA polymerase II to initiate transcription 24

Gal4 has DNA binding and activation domains Gal4 regulator protein 을이용한 activation domain 연구.

II (768-881, strong activating region) 에대하여배운다. 배지에 glucose 가없고 galactose 가첨가되면 GALI (galacto kinase) 유전자가발현되어야한다.

Mig1 은 multicopy inhibitor of GAL gene 으로 C 2 H 2 zinc finger 를 DNA binding domain 에갖고있다.

25 Gal4 has DNA binding and activation domains Gal4 regulator protein 을이용한 activation domain 연구. 그간은 Zn 2 C 6 binuclear cluster 부위만배웠으나그림처럼 activating domain I ( , weak activating region) 과 activating domain II ( , strong activating region) 에대하여배운다. 배지에 glucose 가없고 galactose 가첨가되면 GALI (galacto kinase) 유전자가발현되어야한다. GALI 유전자의 upstream 지역을보면 118bp 의 UAS GAl 내에각 17bp 인 4 개의 Gal4 binding site 가있으며하나의 Mig1 site 가있다. Mig1 은 multicopy inhibitor of GAL gene 으로 C 2 H 2 zinc finger 를 DNA binding domain 에갖고있다. galactose가있건없건 Gal4는 UAS에결합하나galactose가없으면 Gal80 단백질이결합하여 activating region이다른전사구성분과작용을하지못하게한다. 그러나 galactose가있으면 Gal3이 Gal80에결합하여 Gal80이제거되어 activating region이다른구성분과작용하여유전자를 turn on 25 할수있다.

이로인하여 activating region II 가자유로워지고 RNA polymerase transcription machinery 와작용을하여전사가일어나게한다.

26 The GAL gene switch model for GAL activation and repression galactose 가첨가되면 Gal3 는 galactose 와 ATP 와결합하여 Gal3 galactose ATP complex 를만든다. 이때 Gal80 monomer 와 dimer 는핵과세포질내를이동할수있다. Gal3 galactose ATP complex 는세포질에서 Gal80 monomer 에결합하여 Gal80 dimer 가 monomer 로전환되게한다. 이로인하여 activating region II 가자유로워지고 RNA polymerase transcription machinery 와작용을하여전사가일어나게한다. glucose 가없으면 Snf1 kinase (sucrose non-fermenting kinase) 가 Mig1 을인산화시켜서 Mig1 site 에결합하지못한다. 그러나 glucose 가존재시는 Snf1 이비활성화되어 Mig1 을인산화시키지못한다. 이때 Mig1 은 site 에결합하여 GAL1 의전사를막는다. 26

에결합을못해전사가안됨 Gal4 activating domain 과 LexA DNA-binding domain 을 fusion 시키면 LexA site 에결합한후 Gal4 의 activating

27 Gal4 activation domain 이어떻게작용하는가? Gal4 의 activation domain 의일부를제거하거나다른단백질과 fusion 을시켜서조사한다. 정상적인 Gal4 는전사를촉진 앞부분의아미노산 100 개만을갖은것은 UAS 에결합은해도 activating domain 이없어전사가안됨 아미노산 개만을갖는것은 UAS 에결합을못해전사가안됨 Gal4 activating domain 과 LexA DNA-binding domain 을 fusion 시키면 LexA site 에결합한후 Gal4 의 activating domain 에의하여전사가개시됨. 마지막실험을 domain swap 라고하며그결과 transcription activator protein 은 activation domain 과 DNA-binding domain 모두가필요하다는것이밝혀짐 27

The DNA-binding and activation domains can be on separate

dimerization region 에직접연결하여약화된 Gal4 를만들면약간의전사가발생함.

Gal80 에 bacterial peptide (activating region 으로알려진 peptide)

이는 DNA-binding domain 의 polypeptide 가 activating region 의

28 The DNA-binding and activation domains can be on separate polypeptides Gal4 activating region 의일부 ( 아미노산 ) 를 dimerization region 에직접연결하여약화된 Gal4 를만들면약간의전사가발생함. 약화된 Gal4 에야생형 Gal80 이만들어져결합하면예상대로전사가거의일어나지않는다. Gal80 에 bacterial peptide (activating region 으로알려진 peptide) 를넣어변형시킨후약화된 Gal4 와결합하면강한전사가일어남. 이는 DNA-binding domain 의 polypeptide 가 activating region 의 polypeptide 와 non-covalent interaction 을통하여기능이있는 transcriptional activator protein 으로작용한다는것을의미함. Herpes simplex virus 에서 VP16 은감염초기에유전자를발현시키는 factor 로작용. 그러나 VP16 자신은 DNA-binding domain 이없어유전자에직접결합하지못한다. Oct1 은 ATGC AAAT 에결합하여약한전사를야기. Oct1 은 TAATGARAT 에도결합하나이곳에결합후형태변화가일어나고 VP16 이결합하면강한전사가일어난다. 28

The yeast two-hybrid system detects protein-protein interactions 바로앞에서 DNA-binding domain 과 activation domain 이다른 peptide 에있어도작용한다는원리를이용하여 proteinprotein interaction 을조사하는것이 two-hybrid system 이다.

29 The yeast two-hybrid system detects protein-protein interactions 바로앞에서 DNA-binding domain 과 activation domain 이다른 peptide 에있어도작용한다는원리를이용하여 proteinprotein interaction 을조사하는것이 two-hybrid system 이다. 하나의 plasmid 는 protein X 유전자가 DNA binding domain 에 fusion 되어있고다른 plasmid 는다른 protein 유전자인 Y1 혹은 Y2 등이 activation domain 과 fusion 되어있다. ( 상 ) 단백질 X 와 Y1 이상호작용을한다면 DBD 가 DNA 에결합하고 AD 가작용을하여 reporter gene 의전사가일어난다. ( 하 ) X 와 Y2 가상호작용하지않으면 AD 가작동을하지않아전사가일어나지않는다. 실제실험에서 protein-protein interaction 을보기위하여많이사용되고 bait 를이용하여 prey 를찾는다. 29

이들은 activator 간에어떠한 limiting target 에대하여경쟁을하기때문이다. limiting factor 는 TBP 나 RNA polymerase 등이아니라 mediator 라는물질임.

30 16.8 Mediator transcription activator protein 은많은경우 basal transcription machinery 인 TBP 나 TAF, TFIIB 등에직접접촉을하나이는활성화된전사를위하여충분치않다. 이때전혀새로운 protein complex 인 mediator 가필요함. Squelching; 한종류의 transcription activator protein 의농도가높으면다른 activator 가유전자의전사를촉진하는것을막는다. 이들은 activator 간에어떠한 limiting target 에대하여경쟁을하기때문이다. limiting factor 는 TBP 나 RNA polymerase 등이아니라 mediator 라는물질임. Squelching occurs when activator protein compete for target proteins target protein (blue) 이 transcription activator A (light green) 에결합하여전사가일어남. transcription activator B 에 target protein 이결합하여 A 에결합할 target protein 이거의없음. activator 간에경쟁이생겨 squelching 이일어나전사가거의일어나지않는다. 30

Middle domain 은 Med 9/10 을포함하며 CTD 지역과관계를맺으나 activator protein 이결합한후에 regulatory signal 을전달하는데역할을한다.

31 yeast mediator two-hybrid experiment 에의하여밝혀짐 Head 와 middle, tail 로나뉘어짐붉은색의 Cdk 는거의모든 mediator 에존재함. Head 부위는 RNA polymerase II 의 CTD 인 Rpb1 subunit 와관련을맺어 RNA polymerase II 의활성에영향을준다. 이부위가없는세포는죽음. Middle domain 은 Med 9/10 을포함하며 CTD 지역과관계를맺으나 activator protein 이결합한후에 regulatory signal 을전달하는데역할을한다. Tail domain 은 Gcn4 와같은 gene-specific transcription activator protein 으로부터의 signal 을감지. Mediator 는 general RNA polymerase II transcription machinery 와 gene-specific activators (ACT) 간에다리역할을한다. Head 와 middle 가 polymerase II 와결합하고 tail 은 ACT 와결합한다. 31

32 16.9 Chromatin modification and remodeling 염색체는 nucleosome 이라는기본적인단위로구성되어있다. (6 장참조 ) 염색체내에는두종류의 chromatin 이 interspersed 되어있으며강하게 packing 된 heterochromatin 과보다 open 된 euchromatin 이다. ( 아래표를참조 ) Heterochromatin 에는모든세포에존재하는말단소체나동원체같은부위를 constitutive heterochromatin 이라고하며단지 inactive X 염색체처럼특정세포에만존재하는것을 facultative heterochromatin 이라고한다. 32

33 Tight 한 chromatin 구조는 transcription machinery 가 DNA 에작용하기위해서는 loosened 되어야하며 chromatin 구조를풀기위해서는두가지기작을이용한다. 1. ATP-dependent chromatin-remodeling factors alter histone-dna or histone-histone interactions so DNA becomes more accessible to the transcriptional machinery 2. Enzymes modify the amino terminal tails of histones by covalent modifications to alter their affinity for DNA 예를들어 histone acetylase 가 acetyl CoA 로부터 acetyl group 을 histone 의 lysine side chain 으로옮겨서 DNA 에대한 affinity 를감소시킨다. (a) (b) (c) (d) (e) ATP-dependent remodeling complex Swi/Snf multisubunit protein complex는 naked DNA와 nucleosome에강하게결합하며 ATP hydrolysis에서나오는에너지를이용하여 chromatin을 remodeling한다. (a) Dnase I cleavage pattern을변형시킴 (b) transcription factor ( 푸른색 ) 가접근하게함. (c) restriction endonuclease 접근을변화시킴. 화살표는접근가능지역. asterisk는불가능지역 (d) histone octamer의 translational position을변화시킴. (e) histone octamer를한 DNA 분자로부터다른분자로이전함. 33

Histone modifications influence transcriptional activity acetylation histone acetyltransferases (HATs) occurs on specific Lys residues in N-terminal tails enhances transcription by destabilizing

34 Histone modifications influence transcriptional activity acetylation histone acetyltransferases (HATs) occurs on specific Lys residues in N-terminal tails enhances transcription by destabilizing nucleosomes deacetylation by histone deacetylases (HDACs) stabilizes compact chromatin structure tends to lower transcription Histone modifications on the nucleosome core particle methylation on specific Lys and Arg residues phosphorylation on specific Ser residues ubiquitination on specific Lys residues 34

35 Histone modification influences chromatin structure histone N-terminal 의 modification 에의하여 chromatin 의구조가바뀜을보여준다. 더많은연구가필요함. HATs and remodeling complexes can act in different orders histone acetyl transferase (HAT) complex 의 regulator (a) 와 SWI/SNF 같은 ATP-dependent remodeling complex (b) 가각각다른순서로작용하고전사를위하여경쟁을함을보여준다. 그림에서는 gene activation 에도달하는세가지방법을보여주었으나 general transcription factor 가먼저 promoter 지역에가서붙고다음에 HAT 나 remodeling 이일어나기도한다고생각됨. 35

Chapter 26

Chapter 26 11 주 RNA 합성 11.1 DNA-dependent synthesis of RNA: Bacteria에서의 transcription l RNA polymerase (5 subunits로구성 : 2α, β, β, σ) l 효소에의한 RNA 합성의특징 - Complementary sequence to template DNA - RNA chain의합성방향 : 5