Wnt and other signalings

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1 Wnt and other signalings 발생은진화적으로하등동물부터인간까지보전되어있는여러가지 signaling에의해적절한때, 적절한장소에서이들의 target genes의발현을통하여조절되어지는것으로알려져있다. 대표적으로발생동안에중요하다고알려진신호로는 Wnt singaling과 TGF-βs, activins 그리고 BMPs와같이크게세가지 families로나뉠수있는 TGF-β superfamily signaling이있으며이들은 body axis specification, cell fate determination, organogenesis등에관여하고있다. 또한그외에도여러가지 cancers와같은 human diseases의발병기전과연관성이있음이밝혀지고있다. TGF-β superfamily signal은 2가지 type의 transmembrane serine/threonine kinase reciptor를통하여전달된다. 먼저, TGF-β ligands가 typeii 수용체와결합하고이는 typei 수용체를불러와 lignad/typeii/typei ternary complex를이루며, typeii 수용체는 typei 수용체를인산화시켜이는차례로세포내에존재하는 receptor regulated Smads(Rsmads) 라불리는 Smad family proteins을인산화시킨다. R-Smads의인산화는 Co-Smads라불리는 Smad4와결합, 이는핵내로들어가 CBP/p300과같은전사활성인자와함께 target genes의발현을조절한다. TGF-β superfamily signal은 signal을전하는 Smads라는 protein의종류에따라다른신호를전달한다. R-smads는두개 classes로나뉘며 smad2와 3는 activin/tgf-β signal을전하고 Smad1,5와 8은 BMP signal을전한다 (1).( 그림1) Fig. 1 Crosstalk of the BMP-Smad pathway with other signal transduction pathways.

2 Wnt signaling 은전반적인 embryogenesis동안에 axis결정이나, 여러 organogenesis 그리고 adipogenesis와연관된비만이나, 알츠하이머와같은뇌신경질환등에도관여하고있음이밝혀지고있다. 어떻게 Wnts가이렇게다양한일을수행할수있을까? 부분적인실마리를그림1에서보는것처럼여러 signalings간의 crosstalk에서찾을수있을것이라생각된다. 위에서언급하였듯이 Wnt signaling과함께중요한 signal로알려진 TGF-β superfamily signaling간의연관성에대하여크게 Wnt target genes을조절하는것과서로의 inhibitor 를발현함으로 fine tunning을하는것으로나누어살펴보겠다. Wnt이세포내에신호를전달하여결국은 β-catenin과 TCF/LEF를통한 target genes의발현을조절한다. 몇년전새롭게 Wnt의 target gene의발현이 TGF-β의 Smad를통하여조절이됨이밝혀졌다 (2). Xtwn의 promoter를이용한연구에서이 gene의 promoter에 TCF/LEF binding sites(tbe) 뿐아니라 Smad binding sites(sbe) 가존재하며이둘은서로 synergistic 하게 Xtwn의발현을조절한다는것을밝혔다. 최근 2004년에발표된또다른논문에서는 Wnt의 target gene인 Gastrin 또한 Wtn와 TGF-β에의해그발현이 synergistic 하게조절이된다는것을확인하였고, 이러한조절은기존에연구되었던 TBE와 SBE가주변에같이존재할때에만일어나는것이라는메커니즘과는조금다르게, 세포내에서 β- catenin - TCF Smads CBP/p300가 multiprotein complex를이룰수있고이 complex가 promoter의 binding site(sbe or TBE) 에결합함으로써 target genes의발현을조절할수있다고얘기한다 (3). 이렇듯서로다른 pathway를갖고서로다르게 target genes을조절하는것으로알려졌던 Wnt와 TGF-β signal이세포내반응을유도하는 target genes의발현을서로조절할수있다는것은여러 signalings이할수있는역할에대한이해의폭을넓혀줄수있는새로운초석이될것이라생각된다. TGF-β superfamily 중하나이며 ectopic bone과 cartilage를형성할수있는인자로처음알려진 BMP signaling(4) 과 Wnt signaling은초기 embrypgenesis동안에 dorso-ventral axis 를결정하는중요인자로잘알려져있다. Wnt는 dorsal region에발현양이높으며 BMP는 ventral region에발현되는것으로알려져있고, 이둘의서로다른발현양상은 dorsal과 ventral region에전달하는 signal이다르게되고결국중요한 dorso-ventral body axis를결정하게된다. Xenopus에서연구된바에의하면, β-catenin이 dorsal side에위치하게됨으로써 dorsal organizer를형성할수있으며, 만약 maternal β-catenin이소실된경우, dorsal structure가망가지고 ventralization되는결과를얻었다 (5). 우리는 Wnt의새로운 target genes을찾고자 microarray 실험을한결과, 재미있는결과를얻을수있었다. Mouse fibroblast cell lien인 L929cell 에 control로 EGFP를발현시키고, Dvl1 그리고 stabilized form의 β-catenin을 inducible하게발현시켰을때, Wnt signal을

3 전하는 Dvl1 과 stabilized form 의 β-catenin 을발현시킨 cell 에서 PRDC 라는 gene 의발현이 증가되는것을확인 ( 그림 2) 할수있었으며, 여러가지실험으로재검증할수있었다. PRDC GAPDH β-actin E D β Dan Cerl Dte Drm E D β Fig.2 Expression pattern of putative Wnt target genes using RT-PCR 재미있게도새로운 Wnt target gene으로확인된 PRDC(protein related Dan and Cerberus gene) 는 cystine knot motif를가지고있는 Dan/Cerberus protein family에속한다. cystine knot motif는 TGF-β superfamily protein들이갖는구조로많은수의 cystein 잔기에의한 disulfide bond를통하여단백질간의결합을이루게한다. 지금까지 cystine knot motif를가지고있는 BMP의 extracellular antagonists가많이알려져있으며, 이들은 cystine ring의크기를기반으로하여크게세개의 subfamilies: CAN(eight-membered ring), twisted gastrulation(nine-membered ring) 그리고 chordin and noggin(ten-mambered ring) 으로나뉠수있다 (6). Dan/Cerberus protein family는 CAN family이며여기에속하는 genes에대한연구는최근 5년안팍에이루어진것들로 table 1에정리되어있다. Table 1. Mouse models involving the different BMP antagonists(ref.7 에서부분발췌 ) Model type Phenotypical abnormalities Dan -/- Dan -/- /Noggin -/- Cerberus LacZ/LacZ /Noggin -/- Knockout Transformation of last lumbar vertebrate to sacral fate Knockout Only defects due to lack of noggin

4 Gremlin - Dante - Left/right axis defect PRDC - Sclerostin - Sclerostin-like - 이들 preteins의경우, CAN domain과 BMP의결합으로 BMP가 receptor와결합하는것을방해하여신호전달을억제하는 infibitor로작용한다고알려져있다 (6). 지금까지발표된논문을살펴보면, head inducer로알려진 Cerberus는 Xenopus에서 Nodal, BMP, Wnt의 antagonist로 multifunction을감당함을보여줬고 (8) 또한새로운 Coco라는 protein도 BMP, TGF-β, Wnt의 inhibitor로작용한다는것도확인되었다 (9). 최근 2004년에는 knock-out을이용한 loss of function study에서 Cerberus like2(dante) 가 left/right axis 결정에중요하게작용함을밝혔으며, Chick에서는 Caronte(10), zebrafish에서는 Charon(11) 이각각 left/right axis를결정하는 CAN family gene으로그기능이알려졌다. 우리가새롭게확인한 PRDC의경우, 그기능에대해서알려진바가거의없는데, 작년 JBC 에서 PRDC 역시같은 family 에속하는다른 genes들과마찬가지로 BMP antagonist로작용한다는것을밝혔다 (12). Wnt signal에의한 PRDC의발현증가는같은 family에속하는다른 genes의조절에 Wnt가작용하는가를궁금하게했으며, 이를 RT-PCR로확인해본결과 Dan을제외한 Cerberus like, Drm(Gremlin), Dte(Dante, Cerberus like2, Coco) 의발현이증가되는것을확인할수있었다 ( 그림2). 이는, 위에서살펴보았듯이, embryogenesis동안에여러 signaling에대한 antagonist로작용함으로써 embryo body patterning(left/right and anterior-posterior) 을결정하고 kidney development(13) 나 osteoporosis(14) 와같은질환에도관여하는 CAN family genes이 Wnt에의해서조절된다는새로운발견이며, Wnt signlaing의기능이전체발생에있어서매우다양하며또한매우정교하게조절되어야하는중요한 signal이라는것과여러질환의 therapeutic target으로서의가능성을유추해볼수있게해준다. 그리고아직기능이많이밝혀지지않은 PRDC의 functional study는 Xenopus와 Mouse data에서조금은상이하였던부분을메꿔줄수있는가능성을기대하게한다. (1) Bubnoff et al, 2001, Intracellular BMP signaling regulation in vertebrates: pathway or Network? Dev Biol. 239, 1-14 (2) Labbe et al, 2000, Association of Smads with lymphoid enhancer binding factor 1/T cell specific factor mediates cooperative signaling by the transforming growth factor

5 β and Wnt pathways. PNAS. 97, (3) Lei et al, 2004, The murine gastrin promoter is wynergistically activated by transforming growth factor-β/smad and Wnt signaling pathway. JBC. 279, (4) Hogan et al, 1996, Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, (5) Weaver et al, 2004, Move it or lose it: axis specification in Xenopus. Development, 131, (6) Avsian-kretchmer et al, 2004, Comparative genomic analysis of the eight membered ring cystine knot containing bone morphogenetic protein antagonists. Mol Endocrinology. 18, 1-12 (7) Balemans et al, 2002, Extracellular regulation of BMP signaling in vertebrates: A cocktail of modulators. Dev Biol. 250, (8) Piccolo et al, 1999, The head inducer Cerberus is a multifunctional antagonist of Nodal, BMP and Wnt signals. Nature, 397, (9) Bell et al, 2003, Cell fate specification and competence by Coco, a maternal BMP, TGF-β and Wnt inhibitor. Development 130, (10) Esteban et al, 1999, The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, (11) Hashimoto et al, The Cerberus/Dan-family protein Charon is a negative regulator of Nodal signaling during left-right patterning in zebrafish. Development. 131, (12) Sudo et al, 2004, Protein related to DAN and cerberus is a bone morphogenetic protein antagonist that participates in ovarian paracrine regulation. J Biol Chem. 279, (13) Murphy et al, 2002, Gremlin: an example of the re-emergence of developmental programes in diabetic nephropathy. Nephrol Dial Trnasplant, 17, (14) Balemans et al, 2001, Increased bone density in sclerosteosis is due to the deficiency of a novel secreted protein(sost). Hum Mol Genet, 10,

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2016 학년도약학대학면접문제해설 문제 2 아래의질문에 3-4분이내로답하시오. 표피성장인자수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 는수용체티로신인산화효소군 (receptor tyrosine kinases, RTKs) 의일종으로서세 본문제에대한지적소유권은동국대학교에있습니다. 본교의서면허락없이무단으로출판, 게재, 사용할수없습니다. 문제 2 2016 학년도약학대학면접문제 아래의질문에 3-4 분이내로답하시오. 표피성장인자수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 는수용체티로신 인산화효소군 (receptor tyrosine kinases, RTKs) 의일종으로서세포의생존과증식