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일국 신
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1 1 Gene Targeting 의기술에대한고찰 Conditional knockout 김도엽 CDI Bioscience To whom correspondence should be addressed 목차 Ⅰ. 서론 - Gene targeting 이란무엇인가? Ⅱ. 본론 - Knockout mouse 를만드는방법및고찰 Ⅱ-1. Targeting Vector design Ⅱ-2. ES cell selection for recombination Ⅱ-3. Injection into host blastocyst Ⅱ-4. Transfer into pseudopregnant foster mother Ⅱ-5. Birth of chimera Ⅱ-6. Germline transmission Ⅱ-7. Production of tissue-specific knockout mice (GOI loxp/loxp; Tsp-Cre) Ⅲ. 맺음말 Ⅳ. 참고문헌

2 2 Ⅰ. 서론 - Gene targeting 이란무엇인가? 현대과학은그야말로빠른속도로성장하고있다. 수많은새로운기술들이태어나고, 지금도연구개발이계속진행되고있다. 그중에서도 Gene Targeting 은실험자가원하는유전자를동물에서제거하는기술로서, 1990 년대에소개가되기시작하면서동물을다루는많은실험실에서연구목적으로사용되고있다. Gene targeting 의사전적의미는다음과같다. Gene targeting is a genetic technique that uses homologous recombination to change an endogenous gene. Also called replacement strategy based on homologous recombination. ( 출처 : Wikipedia) 영문글자그대로생명체에내재되어있는유전자를상동재배열에의해변화를주는유전적기술이다. Homologous recombination 에는몇가지가있는것으로알려져있지만, 여기서는 deletion ( 삭제 ) 에촛점을두기로한다. 주로사용되는 gene targeting 에는 conventional gene knockout 과 conditional gene knockout 이있는데, 전자는생체내의어떤특정한유전자를생체의모든부분에서다제거하는것이고많이알려져있는방법이기때문에, 이리뷰에서는 mouse 의 conditional gene knockout 에관한기술적인부분을다루기로한다. Ⅱ. 본론 - Knockout mouse 를만드는방법및고찰 Conventional gene knockout 과는달리 conditional gene knockout 은생체내의어떤특정한조직또는기관에서특정한유전자만을제거하는기술이다 (1). Conventional gene knockout 에비교해서, 기술적으로어려움이따르기도하고, 연구자가원하는 mouse 를얻기위해서는상당한시간이걸린다. 예를들면, 모든실험조건이정상적이고, 제대로수행되어졌다할때, conventional knockout 방법으로최종적으로연구자가원하는 mouse 를얻기까지보통 1 년정도의시간이필요하지만, conditional knockout 으로는적어도 2 년이상의시간이소요된다. Targeting vector 를가진 mouse embryonic stem cell 을구하는데에도시간이많이걸리지만, 시간이오래걸리는가장큰이유는, 여러횟수의 mouse 교배단계때문이다. mouse 가한세대를거치는시간은대략 2~3 달로본다. 그런데, conditional gene knockout 은적어도 4~5 세대를거쳐야하므로, 교배만 1 년이상이걸리기때문이다. Conditional knockout 의개략적인 time table 을보면, 아래와같다. Targeting vector design ES cell selection for recombination Determination of homologous recombination 2~4 months 3 months 1 month

3 Injection into host blastocyst Transfer into pseudopregnant foster mother Birth of chimera Production of tissue-specific knockout mice (GOI loxp/loxp; Tsp-Cre) Approximate months to be finished 0.

3 3 Injection into host blastocyst Transfer into pseudopregnant foster mother Birth of chimera Production of tissue-specific knockout mice (GOI loxp/loxp; Tsp-Cre) Approximate months to be finished 0.5 month 0.5 month 1 month 12 month 20~22 months Ⅱ-1. Targeting Vector design Targeting vector 는 host cell 의염색체의어떤특정한부위에재조합되어, host cell 에게돌연변이가일어나도록제작된다 (2). 이 vector 에필요한요소들은특정염색체부위에삽입될곳과상동염기서열을가지고있어야하고, 이를함유한 plasmid 골격을가지고있다. 또한, positive selection marker 와 negative selection marker 를가지고있어서목표로하는재조합유전자를가진세포가선택배지에서잘생존해야한다. 여기에주로사용되는 vector 는 replacement vector 이다 (3). 이 vector 안에는 target 의위치에 homologous recombination 이용이하게일어날수있도록약 2~5kb 크기의유전자를양쪽으로한개씩삽입하고, 그사이에 deletion 을시킬 ( 즉 knockout 을시킬 ) 유전자의 1 개또는그이상의 exon 을넣으면서, 그 exon 양쪽에 LoxP 라는염기서열이들어가도록한다 (flanking). 이 LoxP 는 Cre 라고하는 recombinase 가인식하고이를 deletion 할수있도록하는염기서열이다. 즉, Cre 가없는조건에서는 LoxP 안에있는 exon 들은정상적인발현을하지만, Cre 가존재하게되면, 이 LoxP 를인식하고그안에위치한 exon 들을제거하게된다. 따라서, gene of interest (GOI) 는 Cre

4 4 recombinase 가발현되는특정조건 ( 또는동물의특정기관 ) 에서만 knockout 이일어난다. 예로써, 실험자가연구하고자하는유전자를 conventional knockout 방법으로기능을제거했더니, 배아발생초기과정에서이미돌연변이가일어나서이시기에발생이멈추어버렸다면, 그유전자는 embryonic lethal 이라는결론을내릴수는있지만, 발생과정에서의유전자의기능을제대로연구할수는없다. 이러한경우에, 위와같은 conditional knockout 방법을도입하면, 동물은정상적인발생을진행하면서, 동시에실험자가알고자하는유전자의어떤조직 ( 또는기관 ) 에서의특수한기능을연구할수있게된다. Ⅱ-2. ES cell selection for recombination 실험자가원하는 targeting vector 가만들어졌다면, 이제는이 vector 를 mouse embryonic stem cell 에주입시키는과정이필요하다. 여러가지 transfection 방법이있겠지만, mouse ES 세포에흔하게쓰이는것은 electroporation 이다. ES 세포는 mouse feeder layer 위에서키우는데, 배지에는 leukemia inhibitory factor 를넣어줌으로써 ES 세포의분화를억제한다. Electroporation 이후에선택배지에서자란 ES 세포들을하나씩실험용 pipette 로집어내어 96 well plate 에옮긴후배양한다. 배양된세포들을가지고 PCR 이나 Southern blot 을통해서 targeting vector 가 ES 세포의염색체에 homologous

여기서한두개정도의 blastocyst 에만 ES 세포를주입하는것이아니고, 될수있는한많은 blastocyst 에주입시켜서여러개체의자손, 다시말해서 chimera 를얻어내는것이중요하다하겠다 (4).

5 5 recombination 이일어났는지를확인하여 targeting vector 가제대로삽입된 ES 세포를골라낸다. Ⅱ-3. Injection into host blastocyst 앞서선택된 ES 세포가 blastocyst 에 microinjection 되는단계를말한다. 여기서한두개정도의 blastocyst 에만 ES 세포를주입하는것이아니고, 될수있는한많은 blastocyst 에주입시켜서여러개체의자손, 다시말해서 chimera 를얻어내는것이중요하다하겠다 (4). Ⅱ-4. Transfer into pseudopregnant foster mother 앞서 ES 세포가주입된 blastocyst 를 female mice 의자궁에 implantation 시키는과정이다. 이렇게가임신된쥐는정상적인임신및출산을위한준비를하게되고, 대략그로부터 20 일이내에 chimera 들을출산하게된다.

6 6 Ⅱ-5. Birth of chimera Pseudopregnant mother 에서출산된쥐들은보통 chimera 라고부른다. 여기서중요한기술한가지가있다면, 앞서 targeting vector 가 homologous recombination 이일어난 mouse ES 세포와그 ES 세포가주입된 blastocyst 는다른 coat color 를가진 mouse 종류들을사용한다. 즉, mouse ES 세포는 albino mice ( 흰쥐 ) 에서유래된것이라면, 그 ES 세포가주입된 blastocyst 는 black mice ( 흑쥐 ) 에서유래된것을사용한다는것이다. 그래서 pseudopregnant mice 에서출생된생쥐들은두가지 coat color 가혼합된 chimera 가되는것이다. Chimera 의특징은몸체의어떤부분은 albino mice 의 ES 세포에서유래된반면에, 또다른어떤부분은 black mice 의 blastocyst 에서유래된것이다. 다시말하면, 실험자가원하는 targeting vector 는 ES 세포에서만유래된것이므로, chimera 는조직또는기관의어떤부분은 targeting vector 가들어있지만, 다른부분은그 vector 를가지고있지않다. 그러나우리는 mouse 의전신에그 vector 가들어있는 mouse 를얻는것이목적이다. 그 mouse 의 genotype 은 GOI +/flp.loxp 이다 (GOI = Gene of Interest). 다시말해서한개의 allele 은그의부모중 black mice 의 blastocyst 에서온 + (wildtype) 이고, 다른 allele 은 ES 세포에서온 flp.loxp 이다. Flp 는보통 targeting vector 에서 positive selection marker 를 flanking 하고있고, loxp 는실험자가 knockout 하기원하는 GOI 의일부 exon 을 flanking 하고있는 recombinase recognition site 를말한다 (5).

7 7 Ⅱ-6. Germline transmission Targeting vector 가모든조직및기관에들어가있는 mouse 를얻기위해서는, 앞서얻어진 chimera 와 black mice (blastocyst 가유래된 ) 를교배해야한다. 물론, 그들의자손은대부분 black mice 가되겠지만, 낮은비율로 albino mice 가얻어질수있다. 이과정을 germline transmission 이라하고 (6), 이 albino mice 가얻어진이유는, chimera 중에서그의 germ 세포안에 albino mice 의 ES 세포에서유래된유전자를가지고있어서, 이것이다음세대에발현이되어 albino mice 가발생된것이다. 물론, 이 albino mice 는모든조직및기관에 targeting vector 를가지고있다고할수있다. Ⅱ-7. Production of tissue-specific knockout mice (GOI loxp/loxp; Tsp-Cre)

8 8 마지막단계로, 실험자가최종적으로구하고자하는 tissue-specific conditional knockout mice 를얻는과정이다 ( 그림 Gene Targeting Protocol 참조 ). 앞서말한 targeting vector 에는 positive selection marker 가들어있는데, conditional knockout vector 안에는이 selection marker 가 flp 라고하는특정염기서열에의해 flanking 되어있다. Flippase 라는 recombinase 가 flp 를인식하고이부분을 deletion 하게된다 (7). 즉, 앞서얻어진 mouse (GOI +/flploxp ) 와 Flippase 가발현되는 mouse 와교배를하면, 그들의자손중에 flp 가제거된, 다시말해서 positive selection marker 가제거된 mouse (GOI +/loxp ) 가출현하게된다. 그다음이들 mouse (GOI +/loxp ) 끼리교배를하면, 대략 25% 의확률로 GOI loxp/loxp 라는 mouse 가얻어지게된다. 이 mouse 는 GOI 가정상적으로발현하기때문에, wild type 의 mouse 와는표현형에차이가없다 ( 또는, 정상적으로제작된 targeting vector 라면, 표현형에차이가없어야한다 ). 최종적으로 TSP mice 를 GOI loxp/loxp mice 와교배를하게되면, Cre recombinase 가특정한기관또는조직에서만발현되어, GOI 가그기관또는조직에서만 deletion 되는 conditional knockout 이일어나게된다. 일반적으로그 conditional knockout mouse 의 genotype 은 GOI loxp/loxp ; Tsp-Cre 로표기한다. 실제로유용한 TSP mice 는상당히다양하다 (8). 예를들어서, TSP mice 중에서 liver-specific 한 mice 를사용한다면, 그들의자손중에는 liver 에서만 GOI 가발현이되지않는 mice 가출현하게되는것이다. 이로써, GOI 의 liver 에서의기능을연구하는데에중요한실험동물로써쓰이게되는것이다 (9). Ⅲ. 맺음말 이리뷰에서는주로 conditional knockout 의기나긴제작과정을설명하였다. 실험자가원하는 knockout mice 를제작하는과정에만 2 년여의시간이소요될뿐만아니라, 이렇게힘들게얻어진 mice 를가지고조직, 유전학적, 생리학적분석등을하기위해서 1 년여의시간을또거쳐야한다. 그래서총 3 년여의시간을투자해야만가능한대작업이라말할수있다. 그렇지만이렇게시간적으로투자를한만큼, 한번얻어진 conditional knockout mice 를가지고다양한종류의 TSP mice 와교배하여, 생체내여러기관이나조직에서 GOI 를연구할수있다는커다란장점도수반한다. 필자의경험으로보았을때, 주변에 conditional knockout mice 를만들어내기위해서노력했던많은연구원들의 2 년여동안의노고가무산되는실패사례들을많이듣고목격했다. 그들이연구하려했던 GOI 자체가 conditional knockout 을해도아무런표현형의변화가나타나지않는경우도있을수있다 ( 즉, 다른유전자에의해 compensation 이되었을가능성이있다 ). 그러나, 어떤경우에는초기에 targeting vector 를제작하는단계에서본의아닌실수에의해서중요한염기서열이소실된것을알아차리지못하고 ES 세포에주입시킨

9 9 결과가야기될수도있다. 따라서, conditional knockout mice 를제작한다는것은, 그만큼오랜기간동안주의력과관찰력을기울여야한다는것을감히말하고싶다. Ⅳ. 참고문헌 1. Aoki K, Taketo MM. Tissue-specific transgenic, conditional knockout and knock-in mice of genes in the canonical Wnt signaling pathway Methods Mol Biol. 468: Liu P, Jenkins N, Copeland N. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations Genome Res. 13: Tzimagiorgis G, et al. Introduction of the negative selection marker into replacement vectors by a single ligation step Nucleic Acid Res. 24: Kaartinen V, Nagy A. Removal of the floxed neo gene from a conditional knockout allele by the adenoviral Cre recombinase in vivo Dev. Gen. 31: Lois C, et al. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors Science. 295: 년 5 월에발간된 BRIC 리뷰중에서저자김도엽의 Characteristics of tissue-specific Cre expressing transgenic mice 를참고바람. 9. Metzger D, Chambon P. Cre-mediated conditional gene targeting to understand liver functions Drug Discovery Today. 1: keyword: Conditional knockout, Cre-LoxP system, embryonic homologous recombination stem cell,

10 10 Disclaimer: "BioWave" is not political. The views and opinions expressed by its writers do not necessarily reflect those of the Biological Research Information Center(BRIC). c Copyright 2010, the Biological Research Information Center(BRIC), Pohang , Korea. 본글의저작권은 " 생물학연구정보센터 BioWave" 에있습니다. 일부내용인용시 " 생물학연구정보센터 BioWave ( Vol. 12 No. 2" 으로정보출처를밝혀야합니다. 전체내용에대한인용시생물학연구정보센터의사전허락 (mail: biowave@bric.postech.ac.kr Tel: ~8) 을받으신후전재가가능합니다. ( 단. 원저작자의경우는정보출처만밝히시면됩니다.)

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Microsoft Word - pv_0602.doc 1 씨감자 생산 체계와 바이러스병 검사 (화란체계를 중심으로) 함 영 일 대관령원예농협 기술자문위원 To whom correspondence should be addressed. E-mail :yih0512430@yahoo.co.kr 목 차 1. 서언 2. 화란 씨감자 생산단계와 검사 2.1. 보증된 씨감자의 중요성 2.1.1. 최소한의 질적 요구조건 2.1.2.