Chapter 11

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괴옥 대
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1 Chapter 14 Regulation of Bacterial Gene Transcription 1

2 14.1 Messenger RNA Characteristic of Bacterial mrna; 1. monocistronic or polycistronic 박테리아에서는전사가끝나기전에해독이일어나 nascent RNA 를변화시킬수있는기회가없으나진핵세포에서는초기전사체를핵내에서성숙된 mrna 로변화시켜세포질로보내해독이일어난다. 해독틀과단백질합성의 start 와 stop signal 에해당하는지역을 cistron 이라고하며하나의 polypeptide 를암호화하는 mrna 를 monocistronic mrna 라고함. 두개나세개의 cistron 을포함하는 mrna 를 polycistronic mrna 이라고한다. 박테리아에서는 mono 보다는 poly 가더보편적이며대부분 single metabolic pathway 를위해필요한단백질들을암호화한다. coding region 이외의지역중앞부위를 5 untranslated region (5 -UTR) 이라고하며아래부위를 3 untranslated region (3 -UTR) 이라고함. 2. Bacterial mrna 는다른 RNA 에비하여 short-life time 을갖고있다. mrna 의수명은단지수분에불과하여낭비적으로보일지모르지만조절에중요한역할을한다. 3. mrna 의합성을조절함으로유전정보의흐름을조절할수있다. 4. mrna 의합성은 negative 그리고 positive regulation 에의하여조절된다. 2

3 Negative versus positive regulation Figure

14.2 Lactose operon lactose 의 metabolism 에는그림처럼 lactose 를 galactose 와 glucose 로분해하는 β-galactosidase 와세포내로 lactose 를들어가게하는 lactose permease 가필요하다. lacz 유전자는 β-galactosidase 의구조유전자이며그림 14.

4 14.2 Lactose operon lactose 의 metabolism 에는그림처럼 lactose 를 galactose 와 glucose 로분해하는 β-galactosidase 와세포내로 lactose 를들어가게하는 lactose permease 가필요하다. lacz 유전자는 β-galactosidase 의구조유전자이며그림 14.3 에서보듯이 o-nitrophenyl- β-galactoside (lactose analog) 를분해하여노란색을띄는 o-nitrophenoxide 를만든다. lacy 는 lactose permease 의구조유전자임 laca 유전자는 β-galactoside transacetylase 를암호와하며 acetyl-coa 로부터 acetyl group 을 lactose analog 로옮기는역할을하나 lactose metabolism 에는필요가없다. 정확한역할은연구중이다. Figure

그러나배지에 lactose 를가해주면이들단백질의농도는세포당 10 5 까지증가한다. 그림처럼다시제거하였을때 lac mrna 는감소하나단백질은당장감소하지않는다. Figure 14.

5 The lac structural genes are regulated E. coli (lac+ genotype) 를 lactose-free 배지에서키우면세포내의 β-galactosidase, permease, tranacetylase 의농도가매우낮다 ( 세포당 1-2 개의분자 ). 그러나배지에 lactose 를가해주면이들단백질의농도는세포당 10 5 까지증가한다. 그림처럼다시제거하였을때 lac mrna 는감소하나단백질은당장감소하지않는다. Figure 14.5 Inducible enzymes; 위의경우처럼배지에특정분자 (lactose) 를가했을때합성이증가하는단백질을의미함. Repressible enzyme; 특정분자 ( 예 ; tryptophan) 를가하면 tryptophan 을합성하는데필요한단백질이감소하는것처럼감소하는단백질. Constitutive enzymes; 항상일정한농도로합성되는단백질. lactose 를가해서생산된 β-galactosidase 는 lactose 를분해하기때문에농도가계속감소하여 lactose 를실험에거의사용하지않는다. 대신에 TMG 와 IPTG 같은 analog 를사용하며이들은 β-galactosidase 의기질이되지않고반응을계속유도한다. 5

Genetic studies provide information about the regulation of lac mrna 1950 년대 Monad 와 Jacob 은 lac system 의기작을조사하기위하여 mutant 를분리하여실험을함 (laci 와 laco 에돌연변이가생긴것을이용함 ).

6 Genetic studies provide information about the regulation of lac mrna 1950 년대 Monad 와 Jacob 은 lac system 의기작을조사하기위하여 mutant 를분리하여실험을함 (laci 와 laco 에돌연변이가생긴것을이용함 ). laci 에돌연변이가생긴것을 laci - laco 에돌연변이가생긴것을 laco C 라고함. (a) laci + 에서만들어지는 repressor protein 이 trans 로작용하며박테리아염색체의 operator 에결합하여효소의생산을막음. 그러나 lactose 가첨가되면 inducible synthesis 가된다. plasmid 는 lacz - 라서효소가생산이안된다. (b) lac s 는 super repressor 를생산하여박테리아염색체의 operator 에결합하고 lactose 가첨가되어도반응을하지않아효소의생산이 induce 되지않는다. (non-inducible synthesis) (c) laco c 는 operator 돌연변이라서 repressor 가결합하지않는다. 그러므로 constitutive synthesis 를한다. 6

The lac operon model Figure 14.7 Monad 와 Jacob 는 1961 년 operon 모델을창안함. 1. single polycistronic lac mrna 분자에서 lacz, lacy, laca 유전자의 product가나온다. 2. promotor 지역은 laco의바로옆에위치하며 laci와 laco의중간에위치. 3.

7 The lac operon model Figure 14.7 Monad 와 Jacob 는 1961 년 operon 모델을창안함. 1. single polycistronic lac mrna 분자에서 lacz, lacy, laca 유전자의 product가나온다. 2. promotor 지역은 laco의바로옆에위치하며 laci와 laco의중간에위치. 3. operator는 repressor 단백질이결합하는염기서열이다. 4. repressor protein이 operator에결합하면 lac mrna가생산되지않는다. 5. inducer는 repressor에결합하여 lac mrna의합성을증가시킨다. 이때 operator는비워있고 mrna 합성은시작된다. 이를 depression이라고한다. 7 이는 negative regulation이나 positive regulation을받는다는것도후에배운다.

Allolactose; true inducer of the lactose operon. operon model 에는두가지문제점이존재 1. lactose (inducer) 는 repressor 와결합하기위하여세포내로들어가야하는데이때 permease 가필요하다. 2.

8 Allolactose; true inducer of the lactose operon. operon model 에는두가지문제점이존재 1. lactose (inducer) 는 repressor 와결합하기위하여세포내로들어가야하는데이때 permease 가필요하다. 2. 분리된 lac repressor 는 lactose 와결합하지않고 isomer 인 allolactose 와결합한다. 그림처럼 lactose 에서 β-galactosidase 에의하여만들어진다. 이는초기에 basal synthesis 에의하여소량의 β-galactosidase 와 permease 가합성되어존재하기때문이다. Lac repressor 와 inducer 의결합 Gilbert 와동료들이 repressor 를 1966 년분리함. 그림에서보는것처럼 repressor ( 붉은색 ) 을 bag 에넣고 radioactive IPTG ( 푸른십자가 ) 를가함. repressor 가없으면 IPTG 의농도는항상일정하나 repressor 가있으면 bag 안의 IPTG 농도가높다. lac repressor 는 154 kda 의 homotetramer 이며각각은 360 개의아미노산으로되고한분자의 IPTG 가결합한다. 8

9 Lac repressor 와 operator 의결합이들간의결합을보기위하여 filter-binding assay 를시행함. 위의표에서보는것처럼 lac DNA 와 repressor 를같이넣어준것이필터에남게된다. repressor는 -7에서 +28까지 35base에결합한다. 그러므로 operator는전사시작부위 (+1) 와 promoter의 -10box 일부를포함한다. 또한 operator는 two-fold axis symmetry이나 (11번을중심으로 ) 완전한 palindrome은아니다. 9

하나혹은그이상의 opeator 에돌연변이를야기시킨후에결과를관찰함. laco 1 에 point mutation 이생기면 repression 이 5-50 배감소.

10 The lac operon has three operators for repressor binding operon 은 3 개의 operator 를갖고있음. 앞에서배운 +11 의 operator 는 laco 1 이며 +412 에 laco 2 가있고 -82 에 laco 3 가존재함. 이들이 lac operon 의조절에어떠한영향을미치는가? 하나혹은그이상의 opeator 에돌연변이를야기시킨후에결과를관찰함. laco 1 에 point mutation 이생기면 repression 이 5-50 배감소. laco 2 나 laco 3 에문제가생기면 repression 이 2 배감소. 둘다파괴되면 70 배가감소된다. laco 1 과다른어느하나에문제가생기면 repress system 이완전히파괴된다. 그러므로 laco 1 이주된역할을하고다른것은보조적인역할을한다. 이제 lac repressor 의구조를배우며어떻게 operator 와작용하는가를배운다. 우측그림 ; repressor monomer 분자의구조 10

The Lac repressor 의구조 Figure 14.14 Figure 14.15 Figure 14.16 Figure 14.17 1.

( 그림 14.14) 특히 recognition helix 부위가 DNA major groove에자리잡고다른부위인 stabilization helix는결합을안정화시킨다.

subdomain으로나뉜다. lac repressor dimer 형성에중요한역할을하며 IPTG가두 subdomain간의 pocket에결합하게된다. ( 그림 14.

11 The Lac repressor 의구조 Figure Figure Figure Figure N-terminal domain (headpiece, residue 1-45); headpiece 내의 helix-turn-helix motif가 operator에결합. ( 그림 14.14) 특히 recognition helix 부위가 DNA major groove에자리잡고다른부위인 stabilization helix는결합을안정화시킨다. 2. Repressor dimer의두개의 hinge region (residues 46-62) 은연결되어 lac operator의 minor groove의결합하여 DNA를휘게한다. ( 그림 14.15) 3. ligand binding 혹은 core domain (residue ) 은 N-terminal subdomain과 C-terminal subdomain으로나뉜다. lac repressor dimer 형성에중요한역할을하며 IPTG가두 subdomain간의 pocket에결합하게된다. ( 그림 14.16) repressor와 IPTG가결합하였을때의구조를오랜지색으로나타내고 repressor와 DNA 가결합하였을때를붉은색으로표시하여구조가바뀜을알수있다. 그러므로 IPTG가결합하면구조에변화가생겨더이상 DNA에결합하지못한다. 4. tetramerization helix (residue ) 는tetramer를만드는데중요한역할을함. 11 ( 그림 14.17)

Figure 14.18 repressor dimer 가 DNA 에결합한 model.

12 Figure repressor dimer 가 DNA 에결합한 model. IPTG ( 초록색 ) 가결합하여구조의변화가생겨 DNA 와의결합이분리된다. repressor 가 tetramer 로존재하는이유를그림으로나타냄. DNA looping 에의하여 lac repressor 가두개의 operator 지역에결합을하게됨. 12

13 14.3 Catabolite repression 박테리아를 glucose 와 lactose 가동시에존재하는배지에서키우면 glucose 를다사용할때까지는 lac operon 이작동이안된다. glucose ( 혹은다른쉽게사용될수있는 carbon source) 에의하여 lactose 나다른 inducible enzyme 등의발현이저해되는것을 catabolite repression 이라고한다. 그림에서화살표는 glucose 가다쓰인시기이며이때부터 β-galactosidase 가만들어진다. 610nm 에서는세포의양을측정한다. The inhibitory effect of glucose on expression of the lac operon is a complicated process 1965년 E. coli 배양에 glucose를가하면 camp (3 5 -cyclic adenylate) 농도가급감하는것을발견하였으며. camp는 adenylate cyclase에의하여 ATP로부터만들어진다. camp의역할을보기위하여 glucose가없고 lactose만있어도 lac enzyme를합성하지못하는두가지돌연변이체를조사함. Class I mutants; adenylate cyclase에결함이있어 ATP를 camp로만들지못한다. Class II mutants; camp에결합하는단백질에결함이있으며이들을 camp receptor protein (CRP) 혹은 catabolite activator protein (CAP) 이라고한다. 즉 camp CRP 는 positive regulator 13 로작용을한다.

14 CRP-cAMP 에의한 lac operon 의 positive regulation 14

23 Catabolite repression by camp modulation and inducer exclusion camp modulated mechanism; glucose 가존재하지않으면 EIIA 의 P 가 AC (adenylate cyclae) 를

15 adenylate cyclase 는 phosphorylation 이되어야활성화되어 camp 를만드는데 glucose 는 adenylate cyclase 의 phosphorylation 을막아 camp 를합성못하게한다. PTS phosphoenolpyruvate (PEP) phosphotransferase system PEP 에서나온 P 는 glucose 가존재하면 glucose 를 phosphorylation 시키는데사용된다 Figure Catabolite repression by camp modulation and inducer exclusion camp modulated mechanism; glucose 가존재하지않으면 EIIA 의 P 가 AC (adenylate cyclae) 를 phospholylation 시키는데사용되어 camp 가만들어진다. inducer exclusion mechanism; dephosphorylated 된 EIIA는 lactose permease에결합하여 permease를불활성화시킨다. 즉 Glucose가많으면 dephosphorylated 된 EIIA가많아 lactose가 15 세포내로들어오지못한다.

The camp CRP complex binds an activator site (AS) upstream from the lac promoter and activates lac operon

각각에두개의 camp 가결합. camp 가없으면 CRP DNA 결합은아주약하나 camp CRP complex 는 activator site (AS) 라는특정 DNA 서열에결합을한다.

AS 는 5 -AAATGTGATCTAGATCACATTT-3 3 -TTTACACTAGATCTAGTGTAAA-5 camp CRP complex 는또한 RNA polymerase holoenzyme

16 The camp CRP complex binds an activator site (AS) upstream from the lac promoter and activates lac operon transcription Figure camp CRP 가 DNA 에결합한구조를연구함. 그림처럼 CRP 는 209 아미노산으로된두개의동일한 polypeptide 로이루어짐. 각각에두개의 camp 가결합. camp 가없으면 CRP DNA 결합은아주약하나 camp CRP complex 는 activator site (AS) 라는특정 DNA 서열에결합을한다. lac operon 의 AS 중앙은 61.5bp upstream 이다. AS 는 5 -AAATGTGATCTAGATCACATTT-3 3 -TTTACACTAGATCTAGTGTAAA-5 camp CRP complex 는또한 RNA polymerase holoenzyme 과도결합을한다. CRP 의 residue 에는 AR1 (activating region) 이라는 RNA 중합효소의 α factor 와결합하는부위존재. 그림처럼다양한 CRP 와돌연변이된 AR1 을만들어실험한결과 promoter proximal subuint 에존재하는 AR1 이필수적이고 promoter distal subunit 에존재하는 AR1 은필요치않은것이밝혀짐 16

17 14.4 galactose operon galactose operon 은 repressor 와 camp CRP 에의하여조절된다. Figure gal operon 은그림처럼 4 개의구조유전자를갖고있으며 galactose 를 glucose-1- phosphate 로전환시킨다. gal operon 은 repressor 와 camp CRP 에의하여영향을받는다. repressor 구조유전자인 galr 은다른유전자보다훨씬위쪽에위치하며두개의 operator 인 galo E 와 galo I 를갖고있다. 두개의 promotor 지역 (P1 과 P2 가존재하나중복됨 ) 과하나의 camp CRP AS 부위를갖고있다. galo E 는 promoter 의윗쪽에존재하며 galo I 는 gale 내에존재한다. 17

classii camp-dependent promoters; gal operon 에서는 activator site (AS) 가 -41.5 위치에존재하며 (lac operon 에서는 -61.

18 gal repressor 는 dimer 를이루지만 lac repressor 처럼 tetramer 를만들지않는다. lac repressor 는 tetramer 를만들어 DNA looping 이일어나나 gal operon 에서는 HU 라는 histone-like protein 이 promoter 지역에결합하여 DNA looping 을만든다. classii camp-dependent promoters; gal operon 에서는 activator site (AS) 가 위치에존재하며 (lac operon 에서는 -61.5) lac promotor 와는다른결합을한다. 그림처럼 CRP 는 3 개의 activating region 을갖고있으며 AR1 은 CRP dimer 의 upstream subunit 에 AR2 와 AR3 는 down stream subunit 에존재하며 αctd, αntd 와동시에결합한다. 또한 σ subunit 과도결합을한다. lac operon 과는완전히다른결합을한다. 18

19 14.5 The arabad Operon L-arbinose 는 carbon source 로이용되며그림처럼대사작용을한다. arabinose 가존재할때만작동하기때문에 inducible 하며 arabinose 자체가 inducer 이다. Figure arabad operon; arac 유전자는 regulatory 단백질을만들고이곳에 arabinose가결합하여전사를촉진시킨다. arabinose가없어서 regulatory protein에결합하지못하면전사가일어나지않는다. arab, araa, arad는 arabinose degradation에필요한효소를만든다. P C 는 arac에대한 promoter이고 P BAD 는 arabad에대한 promoter이다. 서로전사의방향은반대임. 또한 ara operon의전사는 camp CRP가필요하며 camp CRP AS 부위가존재함 19

AraC undergoes a conformation change after binding arabinose AraC는 homodimer로각각 N-terminal과 C-

C-terminal은 DNA와결합하고 N-terminal은 dimerization을이루고 arabinose binding pocket이존재한다.

그러나 arabinose가첨가되면 N-terminal arm이 N-terminal domain 쪽으로이동하여 DNA의결합에영향을준다.

20 AraC undergoes a conformation change after binding arabinose AraC는 homodimer로각각 N-terminal과 C- terminal을 linker가연결해준다. C-terminal은 DNA와결합하고 N-terminal은 dimerization을이루고 arabinose binding pocket이존재한다. arabinose가없으면 N-terminal arm은 C-terminal 에붙어서 linker와함께구조를강하게만든다. 그러나 arabinose가첨가되면 N-terminal arm이 N-terminal domain 쪽으로이동하여 DNA의결합에영향을준다. 그리고 I 1,I 2 에결합을하여전사가개시됨. CRP provides further activation of arabad after activation by AraC 하나의 α subunit의 c-terminal 지역이 arac protein과 CRP와결합을하고 NTD가 σ와결합. 다른 α subunit의 c-terminal 지역이 CRP와결합하고 NTD가 β와결합. 이러한결합에의하여 RNA polymerase가전사를개시함. 20

Chapter 26

Chapter 26 11 주 RNA 합성 11.1 DNA-dependent synthesis of RNA: Bacteria에서의 transcription l RNA polymerase (5 subunits로구성 : 2α, β, β, σ) l 효소에의한 RNA 합성의특징 - Complementary sequence to template DNA - RNA chain의합성방향 : 5