Chapter 3

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효진 위
5 years ago
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1 Chapter 4 Deoxyribonucleic Acid Structure 1

2 4.1 DNA 의크기의다양성 DNA 는옆의표에서보는것처럼크기와염기구성이다양하다. 원핵세포에서 DNA 는하나의단일분자이며진핵세포에서는여러개의염색체에나뉘어있다. 또한 histone 이라는단백질이결합됨. DNA 의염기간의길이는 0.34nm, DNA 분자의폭은 2.0nm 이다. 표에있는 DNA 의길이는 1.7μm 에서 8.3cm 임. 4.2 연약성 DNA 는일상적인작용에의하여생기는유체역학적인절단력에의하여쉽게부서진다. 그럼으로진핵세포의 DNA 를분리할때는각별한주의를필요로한다. 2

4.3 DNA conformations ( 형태 ) 선형이중가닥 DNA 는 A-DNA, B-DNA, Z-DNA

5bp 2) A 의염기쌍의평면은나선축의수직에서 20 도 B 형은 -6 도기울음 3) A 는구멍이있으나 B 는없다.

3 4.3 DNA conformations ( 형태 ) 선형이중가닥 DNA 는 A-DNA, B-DNA, Z-DNA 중의하나로존재한다. A 형과 B 형의차이점 ; 1) A 는나선회전당 11bp, B 는 bp 2) A 의염기쌍의평면은나선축의수직에서 20 도 B 형은 -6 도기울음 3) A 는구멍이있으나 B 는없다. 4) A 는깊은주홈과얕은부홈, B 는거의비슷 A-DNA B-DNA Z-DNA B-DNA 는왓슨과크릭의 DNA 의기본적인모델살아있는생명체는거의 B 형임. A 형은살아있는생명체의습한환경에간혹존재하나이중나선 RNA 나 DNA-RNA 교잡시존재함 A-DNA, B-DNA 모두우회전나선이나특별한환경하에서는좌회전나선을나타냄. 알렉산더리치는특정서열을합성하여조사하던중새로운형태의 Z-DNA 를발견함 5 - CGCGCG GCGCGC 5 3

그림 ; 지그재그당인산골격을갖는 Z-DNA 와 Z-DNA 에항체가결합하여흰색을나타냄 단 Z-DNA

세포내의염의농도는 2M 이되지않기때문에생체내에서는거의존재를하지않으나특정한환경의세포내에존재할것으로간주됨.

4 그림 ; 지그재그당인산골격을갖는 Z-DNA 와 Z-DNA 에항체가결합하여흰색을나타냄 단 Z-DNA 는높은염의농도를갖는용액속에서만존재. 5 - CGCGCG 3 서열이있는경우 2M 이상의염화나트륨속에서는 Z-DNA 로존재하나나머지 DNA 는 B 형태로존재. 세포내의염의농도는 2M 이되지않기때문에생체내에서는거의존재를하지않으나특정한환경의세포내에존재할것으로간주됨. 형광항체법을이용하여동물 DNA 의일부지역이 Z 형태라는것을알수있음. 초파리의침샘염색체를이용함. Z-DNA 에대한토끼의항체가가해지고형광염소항 - 토끼 - 면역글로블린을가한후형광현미경으로관찰. 그러나 B-DNA가가장흔하게세포내에존재하기때문에앞으로는 B-DNA에관하여 4 배움

5 The A-, B-, and Z-DNA forms have different characteristics Adapted from Ussery, D. W. Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd., May [doi: /npg.els ]. 5

Polydeosyribonucleotide 사슬이자연적인회전이가능하기때문에다른 DNA 의형태를갖게됨.

6 Figure 4.4 좌 ;The C 2 -endo conformation 우 ;The C 3 -endo conformation Polydeosyribonucleotide 사슬이자연적인회전이가능하기때문에다른 DNA 의형태를갖게됨. 당에서 4 개의원자는거의동일한평면상에존재하나 5 번탄소는 0.05nm 벗어남 C-2 혹은 C-3 도이처럼고리의면에서어긋날수있다. ( 좌 ) 의 C 2 -endo 는 B-DNA, ( 우 ) 의 C 3 -endo 는 A-DNA 이고 Z-DNA 는두가지가섞여있다. 좌 ; Deoxyguanylate in B- DNA in anti conformation 우 ; Deoxyguanylate in Z- DNA in syn conformation 다음은 C 1 과푸린염기를연결하는 N-글리코시드결합의변화가중요함. Pyrimidine deoxynucleotide는 syn의형태에있으면당과피리미딘사이에입체적간섭이있어항상 anti로존재. Purine deoxynecleotide는 A-, B-DNA에서는 anti( 좌 ), Z-DNA에서는 6 syn( 우 ) 으로존재함.

7 역반복 십자구조 염기서열이 DNA 의구조에영향을미친다. 회문구조 ( 역의반복 ) 는어느쪽으로읽으나서열이동일한경우를말하며약 50bp 까지계속되기도한다. 이들이간격을두고분리된경우십자구조를이루기도한다. 5 -CCGCCAGTTCCGCTGGCGG-5' 3'-GGCGGTCAAGGCGACCGCC-5' RNA 등은자체내에서동일가닥내에수소결합을만들어머리핀 (hair pin 혹은 stem-loop) 구조를만든다 7

4.4 DNA denaturation ( 변성 ) 자연상태의이중나선구조가열에의하여외가닥으로변하는현상을변성이라고한다. DNA 변성을조사하는간단한방법은파장이 260nm 인자외선을흡수하는능력을조사하는것이다. 즉더질서가잡힌구조일수록흡수되는빛의양이적다. absorbances of 50 mg/ml solutions dsdna A 260 = 1.

8 4.4 DNA denaturation ( 변성 ) 자연상태의이중나선구조가열에의하여외가닥으로변하는현상을변성이라고한다. DNA 변성을조사하는간단한방법은파장이 260nm 인자외선을흡수하는능력을조사하는것이다. 즉더질서가잡힌구조일수록흡수되는빛의양이적다. absorbances of 50 mg/ml solutions dsdna A 260 = 1.0 ssdna A 260 = 1.37 free bases A 260 = 1.60 이중가닥 DNA 를저흡광성 (hypochromic), 자유뉴클레오티드를과흡광성 (hypercromic) 이라고함 0.15M 염화나트륨용액에있는 DNA 를서서히가열하면서 A 260 을측정 1) A 260 은살아있는세포들이만날수있는온도까지일정하게상승. 2) 6 0 C 에서 8 0 C 의범위에서 A 260 이상승 3) 가장높은 A 260 값은초기값보다 37% 가높다. 용해온도 (Tm, melting temperature); A 260 의상승이절반까지이루어졌을때의온도. 그러나다시실내온도까지냉각이된다면 A 260 은초기의비변성값까지떨어진다. 이를복원이라함 8

염기중첩중첩에는정전기상호작용, 반데르발스힘, 소수성효과등이작용하며이는 DNA 의구조를안정화하는데일조를한다. 염기중첩과수소결합모두약한비공유결합으로열에의하여파괴된다.

9 수소결합은이중 DNA 가닥을안정화시킴 G+C 의양에대하여 Tm 이어떻게변하는가조사한결과 G+C 의양에비례하여 Tm 이증가함. G+C 에는 3 개의수소결합이있어파괴시키는데더많은에너지가필요하기때문임. A+T 는 2 개의수소결합을갖음. 염기중첩중첩에는정전기상호작용, 반데르발스힘, 소수성효과등이작용하며이는 DNA 의구조를안정화하는데일조를한다. 염기중첩과수소결합모두약한비공유결합으로열에의하여파괴된다. 많은염기쌍을갖고있는이중가닥 DNA 분자보다는적은염기쌍을갖는것의 Tm 값이변화가심하다. 선형이중가닥 DNA 의끝은염기쌍이풀어진상태이나어떤것은말단에서도중첩이되어있다. 15 개이하의염기쌍을갖는이중가닥은특히낮은 Tm 값을갖는다. 쌍을이루는지역이짧거나그옆의지역은생리적인온도에서존재하는형태를유지하지못한다. 9

10 이온의세기 DNA 의염기와두가닥사이에는서로끌어당기는힘도있지만음으로전하된인산간에는정전기적반발력이있어두가닥을떨어지게한다. 그러나염이가해질경우 Na + 같이양전하인이온이인산을감싸서반발력을없앤다. 이는 0.2M 의생리적인염농도근처에서일어남. 높은염의농도 ( 붉은곡선 ) 혹은낮은염의농도 ( 푸른곡선 ) 를포함하고있는용액속에서 DNA 분자를 90 도까지가열하여두가닥을분리한후다시 25 도까지급격히냉각하였다. 냉각후 A 260 을측정하면높은높은염농도의값이낮은염농도에비해서훨씬적다. 이는높은염농도에있는 DNA 의가닥내에서염기쌍을형성하기때문이다 Figure

4. 5 Renaturation of DNA ( 복원 ) Requirements for DNA renaturation: salt concentration must be high (0.15-0.

11 4. 5 Renaturation of DNA ( 복원 ) Requirements for DNA renaturation: salt concentration must be high ( M NaCl) to eliminate electrostatic repulsion between phosphates in the two strands temperature must be 20-25º below the T m allows stable interstrand base-pairing Renaturation is a slow process compared to denaturation because precise collision between complementary sequences is required ( 상보적인가닥이정확히만나야함 ) 그림과같은분자를조사함으로변성과복원에관한연구를수행함. IA 와 IC 의만남은염기쌍을형성하나주위의염기쌍들이불안하고안정된중첩이일어나지않아오래가지못함. IB 와 IB 이쌍을이루자마자즉시이중가닥 DNA 가생김. 변성된 DNA 용액에서외가닥은자유롭게혼합되고무작위적으로만난다. 예를들어 14 NH 4 Cl 와 15 NH 4 Cl 의배지에서균을각각키운후 DNA 를추출한후이들을혼합시켜서변성, 복원시키면 25% 는양가닥에 14 N 을포함하고 50% 는한가닥은 14 N 다른가닥에는 15 N 을갖으며나머지 25% 는양가닥에 15 N 을갖는다 11

4.6 DNA helicases ( 풀기효소 ) DNA helicase ( 풀기효소 ) 는초당 500-1000bp 의속도로이중가닥 DNA 를외가닥 DNA

coli 에서 14 종, 효모에서 15 종, 바이러스에서 6 종, 사람에서 24 종등이분류되었고사람에서풀기효소에돌연변이가생기면 Werner syndrome

그림처럼어떤풀기효소는갈라진 DNA 분자를요구하고어떤것은 3 혹은 5 꼬리에작용하고다른것은비점착말단에작용.

12 4.6 DNA helicases ( 풀기효소 ) DNA helicase ( 풀기효소 ) 는초당 bp 의속도로이중가닥 DNA 를외가닥 DNA 중간매개체로만들기위하여 nucleotide triphosphate 와결합하고가수분해를한다. E.coli 에서 14 종, 효모에서 15 종, 바이러스에서 6 종, 사람에서 24 종등이분류되었고사람에서풀기효소에돌연변이가생기면 Werner syndrome 이생김. 풀기효소는보통 2 6 개의 polypeptide subunit 이모인 oligomer 로작용함. 그림처럼어떤풀기효소는갈라진 DNA 분자를요구하고어떤것은 3 혹은 5 꼬리에작용하고다른것은비점착말단에작용. 어떤풀기효소는외가닥 DNA 를따라 3 에서 5 으로이동하고다른것은반대로이동한다. 위그림은 helicase 의기질중 ( 좌 ) 비점착말단을갖는 DNA 분자기질이며 ( 우 ) 3 혹은 5 꼬리를갖는기질을나타내며 A 분절은 5 에서 3 으로이동한다는것을의미하며 B 분절은 3 에서 5 로풀기효소가이동한다는것을나타냄. 12

13 DNA helicases 의구조 T7gp4 풀기효소 / 프리마제육합체 풀기효소는초록리본, 프리마제는푸른색리본으로표시함. 5 에서 3 방향으로중앙에있는외가닥을따라서이동함. Figure 4.15 DNA helicase 는보통 6 개의동일한 subunit 가고리같은구조로배열된육합체이다. 현재잘연구된육합체풀기효소는 T7 phage helicase 와 E.coli DnaB helicase 이다. 이들은 DNA 복제에중요한역할을하며갈라진 DNA 분자에결합을하고결합된단일가닥을따라서 5-3 으로이동하며 nucleoside triphosphate 를이용한다. 13

4.7 Single-stranded DNA binding proteins (a) 낮은농도의 SSB (b) 높은농도의 SSB 외가닥 DNA 결합단백질은 DNA

T4 phage 의 SSB 인 gp32 는첫번째분자가일시적인용해현상에의하여생긴외가닥 DNA 에결합을하면다음으로부가적인 gp32 가결합을한다.

각각의세포는 800 개의 SSB 를갖음. 협동적인방법으로외가닥 DNA 에결합을하지만반응하는방법은다르다.

14 4.7 Single-stranded DNA binding proteins (a) 낮은농도의 SSB (b) 높은농도의 SSB 외가닥 DNA 결합단백질은 DNA 풀기효소에의하여생기는일시적인단일가닥을안정화시킨다. 그림 (b) 에서보는것처럼 SSB 는하나가결합하면다른것들이협동적으로결합을하게된다. T4 phage 의 SSB 인 gp32 는첫번째분자가일시적인용해현상에의하여생긴외가닥 DNA 에결합을하면다음으로부가적인 gp32 가결합을한다. 이때 DNA 의분절과 gp32 의 argine 과 lysine 이나열된틈과결합을한다 E. coli 의동형사합체 ( 분자량 75kDa) 인 SSB. 각각의세포는 800 개의 SSB 를갖음. 협동적인방법으로외가닥 DNA 에결합을하지만반응하는방법은다르다. 즉옆의그림처럼실패의주위를실이감싸는것같이외가닥 DNA 가하나혹은두개의결합단백질사중합체의중심부를둘러싼다. 다른 SSB 로는효모나사람에서분리된복제단백질 A (RPA, Replication protein A) 이있으며이는 70, 30, 14kDa 로된이형삼합체이다. 70kDa 소단위의중간부위와 DNA 가결합을한다. 14

4.8 topoisomer and topoisomerase ( 위상이성질체와 DNA 회전효소 ) 대부분의박테리아 DNA

coli 는길이가약 1mm 이며자신보다약 1000 배긴이중가닥환형의분자이다.

환형분자는두개의상보적이고끊어지지않은 covalently closed circle 이거나하나혹은그이상의 Nick 가있는

Closed covalent circle Singly & multiply- nicked & circle Figure 4.

15 4.8 topoisomer and topoisomerase ( 위상이성질체와 DNA 회전효소 ) 대부분의박테리아 DNA 분자와바이러스 DNA 분자는환형이다. 예를들어 E. coli 는길이가약 1mm 이며자신보다약 1000 배긴이중가닥환형의분자이다. 실험실에서는박테리아의 chromosomal DNA 보다는 plasmid DNA 를이용하여연구한다. 환형분자는두개의상보적이고끊어지지않은 covalently closed circle 이거나하나혹은그이상의 Nick 가있는 nicked circle( 새김눈고리 ) 이다. Closed covalent circle Singly & multiply- nicked & circle Figure 4.18 폐공유결합환형분자 (covalently closed circle) 는축이교차되거나비틀어져서초나선 (superhelix 혹은 supercoil) 으로존재한다. 동일한염기서열을갖고있으나다른정도의초나선을갖는두개의이중나선환형 DNA 분자를위상이성질체 (topological isomer 혹은 topoisomer) 라고한다. 15

Supercoiled DNA ( 초나선 DNA) 선형이중가닥 DNA 는연결되면이완된고리를만든다.

wrap around each other equals the sum of the twisting and writhing numbers Twisting

16 Supercoiled DNA ( 초나선 DNA) 선형이중가닥 DNA 는연결되면이완된고리를만든다. 음성초나선양성초나선 선형이중가닥이연결전에풀어지면음성초나선구조 ( 좌 ) 를갖고만일초기회전이더많은꼬임을야기시킨다면연결된고리는반대로비틀어져서양성초나선 ( 우 ) 구조를만들게된다. LK = Tw +Wr Linking number ( 고리수 ) related to the number of times the two backbones wrap around each other equals the sum of the twisting and writhing numbers Twisting number ( 꼬임수 ) determined from the total number of turns of the double stranded DNA total base pairs divided by base pairs per turn Writhing number ( 초나선회전수 ) 16 number of times the helix crosses itself

DNA topoisomerase ( 회전효소 ) 박테리아의복제는두가지점에서위상학적인문제가야기된다. 1. 복제기간에 DNA 분자는풀려야하며폐공유결합고리이기때문에한지역이풀린다는것은다른지역에더많은꼬임을야기시킨다. 많은꼬임은복제를불가능하게한다. 2. DNA 복제가끝난후두개의딸 DNA 가닥이서로맞물린연쇄체를형성하는데이들이풀려서낭세포로나뉘어져야한다.

17 DNA topoisomerase ( 회전효소 ) 박테리아의복제는두가지점에서위상학적인문제가야기된다. 1. 복제기간에 DNA 분자는풀려야하며폐공유결합고리이기때문에한지역이풀린다는것은다른지역에더많은꼬임을야기시킨다. 많은꼬임은복제를불가능하게한다. 2. DNA 복제가끝난후두개의딸 DNA 가닥이서로맞물린연쇄체를형성하는데이들이풀려서낭세포로나뉘어져야한다. 이러한문제를해결하는것이 DNA topoisomerase 이며한위성이성질체를다른위성이성질체로전환시킨다. 회전효소에는두가지가있는데 I 형회전효소는한가닥과일시적인연결을하고 II 형회전효소는두가닥과일시적인연결을한다. I 형회전효소는두개의아형인 IA 형과 IB 형으로나뉜다. 제임스왕이최초로 IA 아형회전효소인 E. coli 회전효소를발견하였다. 이들효소는활성화부위의티로신이 DNA 가닥의 5 - 인산말단과일시적인결합을하여자른다. 다음으로잘라진부위가봉합되기전에잘라지지않은가닥은일시적으로생긴틈새를통하여움직인다. Figure

3) 두개의상보적인단일가닥고리를이중가닥 DNA 고리로연결한다 4) 최소한하나의새김눈을갖는이중가닥고리를연쇄체로전환하다. Figure 4.24 E.

18 DNA topoisomerase I 은네가지의위상학적인변화를촉매 옆의그림처럼회전효소 I 은네가지변화를촉매하며어느반응도 ATP 를요구하지않는다. 1) 음성초나선 DNA 를이완시킨다 2) 단일가닥 DNA 고리를매듭짓고푼다. 3) 두개의상보적인단일가닥고리를이중가닥 DNA 고리로연결한다 4) 최소한하나의새김눈을갖는이중가닥고리를연쇄체로전환하다. Figure 4.24 E. coli 회전효소 I 의 N-terminal 구조 ( 잔기 2-590) 단일가닥이나이중가닥 DNA 를모두에워싸는직경 2.7nm 의중앙구멍을중심으로 4 개의영역으로구성됨. 영역 I, III, IV 는하부, II 는상부에아치를만든다. 영역 II 와 III 는경첩으로연결된것처럼효소가열리거나닫힌형태가되게한다. 영역 III 의티로신 319 는잘라진가닥의 5 말단과일시적인인산디에스터결합을한다. 18

19 Topoisomerase I 의작용기작 음성초나선플라스미드 DNA 에서한회전을이완시키는동안발생한다고제안된과정. DNA 의두가닥은푸른색이며네개의영역은앞장그림과동일. 회전효소의형태는닫힌형 ( 패널 a, d, f) 과중앙구멍을통하여 DNA 가들어갈수있는열린형 ( 패널 b, c, e) 간에변동이되는것으로묘사되었다. 열린형의형태는 II/III 과 II/IV 경첩모두에서움직일수있도록모형이만들어졌다. 19

Topoisomerase II 의작용기작 II 형 DNA 회전효소는다른이중가닥을통한하나의온전한이중가닥 DNA 분자의 ATP 의존성운반을촉매. 진핵세포의회전효소 II 의기작을그림으로설명. E. coli 의대표적 II 형효소는 DNA 자이레이즈이며 ATP 의존재하에음성초나선구조를공유결합된폐환형 DNA 로바꾼다.

20 Topoisomerase II 의작용기작 II 형 DNA 회전효소는다른이중가닥을통한하나의온전한이중가닥 DNA 분자의 ATP 의존성운반을촉매. 진핵세포의회전효소 II 의기작을그림으로설명. E. coli 의대표적 II 형효소는 DNA 자이레이즈이며 ATP 의존재하에음성초나선구조를공유결합된폐환형 DNA 로바꾼다. 회전효소 II의 ATP 가수분해효소부위와핵심영역은각각초록과연한푸른색으로표시되었다. ( 단계 1) 촉매적순환은회전효소가두가닥의 DNA 분절에결합할때시작되며이 DNA 분절은문분절혹은 G 분절 ( 붉은색 ) 과운반분절혹은 T 분절 ( 진한푸른색 ) 로명명되었다. ( 단계 2) ATP 분자가 ATP 가수분해효소영역에결합을하여영역들이연관을맺게된다. ( 단계 3) G 분절이잘라진다. ( 단계 4) T 분절이 G 분절에있는틈을통하여이동하면서동시에하나의 ATP 분자를가수분해한다. ( 단계 5) G 분절이재결합되고남아있는 ATP 분자가가수분해된다. ( 단계 6) 두개의 ADP 분자가떨어져나간후에 T 분절은핵심영역의통로를통하여운반된다. ( 단계 7) 핵심영역의출구는닫히고 ATP 가수분해 20 효소가분리되면서효소를 DNA로부터분리시킨다.

Chapter 14 유전정보 (Genetic Information) A + G = C + T 일정 ( 샤가프룰 ] - Watson & Crick(1953년 ) : double helix model of DNA( 이중나선구조 ) 제시 1. 유전정보의전달경로 DNA 상의정

Chapter 14 유전정보 (Genetic Information) A + G = C + T 일정 ( 샤가프룰 ] - Watson & Crick(1953년 ) : double helix model of DNA( 이중나선구조 ) 제시 1. 유전정보의전달경로 DNA 상의정보를 RNA로옮겨주는과정 ex) retrovirus 2. DNA Replication ( 유전자복제