특허청구의범위청구항 1 단백질을포함하는샘플로부터단백질을정제하는방법으로서, 프로테아제저해제와상기프로테아제저해제에대한특이적결합활성을보유한펩티드태그를결합시키는것을포함하는단백질정제방법. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기프로테아제저해제는지지체에고정되어있고, 상기펩티드태그는정제

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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) C07K 1/22 ( ) C07K 19/00 ( ) C12N 15/62 ( ) G01N 33/53 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제출원일자 ) 2009 년 05 월 15 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2010 년 10 월 06 일 (86) 국제출원번호 PCT/KR2009/ (87) 국제공개번호 WO 2009/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2009 년 11 월 19 일 년 05 월 16 일대한민국 (KR) 년 04 월 24 일대한민국 (KR) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2011년03월04일 (71) 출원인 삼성전자주식회사 경기도수원시영통구매탄동 416 (72) 발명자 이재일 경기도용인시수지구신봉동 LG 신봉자이 1 차아파트 116 동 1303 호 이영선 경기도용인시기흥구언남동푸른솔신일아파트 105 동 1203 호 (74) 대리인 김순영 전체청구항수 : 총 41 항 (54) 단백질정제방법및단백질정제용친화성컬럼 (57) 요약 본발명은펩티드태그와프로테아제저해제사이에특이적친화성을사용하여샘플로부터단백질을정제하는방법을개시한다. 또한, 단백질정제를위한친화성크로마토그래피매질과지지체상에고정된프로테아제저해제를가지는지지체및친화성크로마토그래피매질을포함하는친화성크로마토그래피컬럼을개시한다. 대표도 - 도 1-1 -

2 특허청구의범위청구항 1 단백질을포함하는샘플로부터단백질을정제하는방법으로서, 프로테아제저해제와상기프로테아제저해제에대한특이적결합활성을보유한펩티드태그를결합시키는것을포함하는단백질정제방법. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기프로테아제저해제는지지체에고정되어있고, 상기펩티드태그는정제될단백질과연결되어있는단백질정제방법. 청구항 3 제 1 항또는제 2 항에있어서, 상기단백질정제방법은태깅된단백질을포함하는샘플을프로테아제저해제가고정된지지체에접촉시키는것을포함하고, 상기태깅된단백질은펩티드태그에공유결합으로연결된단백질이고, 펩티드태그는프로테아제저해제에대한특이적결합친화성을가지며, 상기접촉은프로테아제저해제가펩티드태그에결합하는조건하에서이루어지고, 결합되지않은성분들은제거하는것 ; 및지지체로부터단백질을제거하는것을포함하는단백질정제방법. 청구항 4 제 3 항에있어서, 상기지지체로부터단백질을제거하는것은태깅된단백질을지지체로부터용출시킨다음, 태깅된단백질로부터펩티드태그를분리하여단백질을얻는것을포함하는단백질정제방법. 청구항 5 제 4 항에있어서, 상기태깅된단백질을지지체로부터용출시키는것은펩티드태그와프로테아제저해제사이에결합친화성을저하시키는 ph에서용출을수행하여태깅된단백질이지지체로부터제거되는단백질정제방법. 청구항 6 제 4 항에있어서, 상기태깅된단백질로부터펩티드태그를분리하는것은용출된태그단백질을프로테아제로처리하는것을포함하는단백질정제방법. 청구항 7 제 6 항에있어서, 상기프로테아제는 TEV 프로테아제, 파파인또는펩신인단백질정제방법. 청구항 8 제 3 항내지제 7 항중어느하나에있어서, - 2 -

3 상기지지체로부터단백질을제거하는것은결합된펩티드태그를태깅된단백질로부터분리하여단백질을얻는단백질정제방법. 청구항 9 제 8 항에있어서, 상기결합된펩티드태그를태깅된단백질로부터분리하는것은펩티드태그가결합된단백질을프로테아제로처리하여수행되는단백질정제방법. 청구항 10 제 1 항내지제 9 항중어느한항에있어서, 상기펩티드태그는프로테아제유래인단백질정제방법. 청구항 11 제 10 항에있어서, 상기펩티드태그는단백질가수분해활성이결여된프로테아제의단편, 정상프로테아제에서단백질가수분해활성이결여된돌연변이프로테아제또는돌연변이의단편인단백질정제방법. 청구항 12 제 10 항에있어서, 상기프로테아제는파파인, 트립신, 펩신, 키모트립신, 레닌, 카텝신 D, 써몰리신, 엘라스타아제, 플라스민, 트롬빈, 유로키나아제또는콜라게나아제프로테아제이고, 상기프로테아제저해제는에코틴, 파파야쿠니쯔트립신저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸 )-Ala-Ala 아미드인단백질정제방법. 청구항 13 제 1 항내지제 12 항중어느한항에있어서, 상기프로테아제저해제는에코틴, 파파야쿠니쯔트립신저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸 )-Ala-Ala 아미드인단백질정제방법. 청구항 14 제 1 항내지제 13 항중어느한항에있어서, 상기단백질은항체인단백질정제방법. 청구항 15 제 3 항내지제 14 항중어느한항에있어서, 상기태깅된단백질은융합단백질인단백질정제방법. 청구항 16 제 15 항에있어서, 상기융합단백질은펩티드태그를코딩하는핵산을단백질을코딩하는핵산에연결시켜융합단백질을코딩하는핵산을얻고, 융합단백질을코딩하는핵산을발현벡터에삽입하고, 숙주세포에서융합단백질을발현시켜얻는단백질정제방법

4 청구항 17 지지체상에프로테아제저해제를고정시키는것을포함하는친화성크로마토그래피를제조하는방법. 청구항 18 제 17 항에있어서, 상기프로테아제저해제는에코틴, 파파야쿠니쯔트립신저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸 )-Ala-Ala 아미드인방법. 청구항 19 제 17 항또는제 18 항에있어서, 상기지지체는아가로스, 셀룰로오스또는아크릴아미드인방법. 청구항 20 지지체및프로테아제저해제를포함하는친화성크로마토그래피매질. 청구항 21 제 20 항에있어서, 상기지지체는아가로스, 셀룰로오스또는아크릴아미드인친화성크로마토그래피매질. 청구항 22 제 20 항또는제 21 항에있어서, 상기프로테아제저해제는에코틴, 파파야쿠니쯔트립신저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸 )-Ala-Ala 아미드인친화성크로마토그래피매질. 청구항 23 제 22 항에있어서, 상기프로테아제저해제는에코틴인친화성크로마토그래피매질. 청구항 24 제 20 항내지제 23 항중어느하나에따른친화성크로마토그래피매질로팩킹 (pack) 된컬럼을포함하는친화성크로마토그래피컬럼. 청구항 25 제 24 항에있어서, 상기프로테아제저해제는에코틴, 파파야쿠니쯔트립신저해제, 펩스타틴 A, 루펩틴, Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1-안티트립신, 브델린, 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L-Ala 또는디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일-베타-(2-나프틸 )-Ala-Ala 아미드인친화성크로마토그래피컬럼. 청구항 26 태깅된단백질의발현을위한재조합세포를제조하는방법으로서, 펩티드태그를코딩하는핵산을단백질을코딩하는핵산에연결하여태깅된단백질을코딩하는핵산을얻는것 ; - 4 -

5 태깅된단백질을코딩하는핵산을발현벡터에연결하여재조합백터를얻는것 ; 및숙주세포를재조합벡터로형질전환시키는것을포함하는방법. 청구항 27 제 26 항에있어서, 상기펩티드태그는단백질가수분해활성이결여된돌연변이트립신인방법. 청구항 28 제 27 항에있어서, 상기돌연변이트립신서열은프로테아제저해제에대한특이적결합친화성을보유한서열번호 2의단편을포함하는방법. 청구항 29 제 27 항또는제 28 항에있어서, 상기돌연변이트립신서열은서열번호 2의 24 내지 244번째아미노산을포함하는방법. 청구항 30 제 27 항또는제 28 항에있어서, 상기돌연변이트립신서열은서열번호 2의 16 내지 244번째아미노산으로구성된방법. 청구항 31 제 26 항내지제 30 항중어느한항에있어서, 상기단백질은이뮤노글로불린헤비체인인방법. 청구항 32 제 31 항에있어서, 상기이뮤노글로불린은항-EGFR 항체인방법. 청구항 33 프로테아제저해제에대한특이적결합친화성을지닌펩티드태그 ; 및단백질을포함하는융합단백질. 청구항 34 제 33 항에있어서, 상기펩티드태그는파파인, 트립신, 펩신, 키모트립신, 레닌, 카텝신 D, 써몰리신, 엘라스타아제, 플라스민, 트롬빈, 유로키나아제및콜라게나아제프로테아제로구성된군으로부터선택된프로테아제로부터유래된융합단백질. 청구항 35 제 33 항또는제 34 항에있어서, 상기펩티드태그는단백질가수분해활성이결여된프로테아제의단편, 정상프로테아제에서단백질가수분해활성이결여된돌연변이프로테아제또는돌연변이의단편인융합단백질. 청구항 36 제 33 항내지제 35 항중어느한항에있어서, - 5 -

6 상기펩티드태그는돌연변이트립신인융합단백질. 청구항 37 제 36 항에있어서, 상기돌연변이트립신의서열은프로테아제저해제에대한특이적결합친화성을보유하는서열번호 2의단편을포함하는융합단백질. 청구항 38 제 36 항또는제 37 항에있어서, 상기돌연변이트립신의서열은서열번호 2의 24 내지 244번째아미노산을포함하는융합단백질. 청구항 39 제 36 항또는제 37 항에있어서, 상기돌연변이트립신의서열은서열번호 2의 16 내지 244번째아미노산을포함하는융합단백질. 청구항 40 제 33 항내지제 39 항중어느한항에있어서, 상기단백질은이뮤노글로불린헤비체인인융합단백질. 청구항 41 제 33 항내지제 40 항중어느하나에따른융합단백질을코딩하는분리된폴리뉴클레오티드를포함하는재조합세포. 명세서 [0001] 기술분야 본출원은단백질을정제하는방법및단백질을정제하는데에사용하는친화성컬럼에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술최근에단백질을질병의치료및진단에사용하고자하는시도가많이있다. 특히, 치료용항체시장이비약적으로성장하고있고많은생명공학기업이항체개발에뛰어들고있다. 재조합항체공학분야는초기의키메릭항체나인간화항체의개발단계를거쳐최근에는항체의탈면역화기술이나형질전환생쥐및파지디스플레이기술을이용한완전인간항체개발단계까지발전하고있다. 종종질병의치료또는진단용단백질은이를발현하는벡터로형질전환된세포를배양하여원하는단백질을발현시켜생산될수있다. 경우에따라서, 이러한단백질은재조합식물또는동물에서과발현될수있다. 예를들어, 단백질은젖을분비하는재조합동물에서발현되어, 원하는단백질을생산하는형질전환동물의우유를통해얻는방법등으로생산될수있다. 이경우, 세포배양물또는우유로부터원하는단백질을분리및정제하여야한다. 식물이나미생물에서단백질을발현시키는경우에는우선저장기관이나세포내부로부터단백질을추출하는과정이필요하게된다. 이러한소스로부터발현된단백질을분리해내는작업또한결코용이하지않다. 숙주세포단백질이나 DNA를제거또는분리해내야하고, 인체에감염가능한바이러스를제거해야하고, 식물의경우렉틴을, 그람음성균의경우내독소를제거해야한다. 포유동물세포배양물상층액 (e.g., CHO 또는 NSO 세포배양물 ) 또는조단백질혼합물 (crude protein mixture) 예를들어혈청또는복수액으로부터항체의정제공정에가장널리쓰이는방법은단백질 A 크로마토그래피법이다. 단백질 A는많은포유동물종유래의단백질에결합한다. 특히, 이는헤비체인과의상호작용을통해이뮤노글로불린의 Fc 부분에결합한다. 단백질 A는이뮤노글로불린 IgG에높은친화성으로결합한다. 발명의내용 - 6 -

7 [0005] 해결하려는과제 본명세서에개시된내용은샘플로부터단백질을정제하는방법에관한것이다. [0006] [0007] [0008] 과제의해결수단하나의실시예에서, 상기방법은프로테아제저해제와상기프로테아제저해제에대한특이적결합활성을보유한펩티드태그를연결 (coupling) 시키는것을포함한다. 다른실시예에서, 상기방법은프로테아제저해제와상기프로테아제저해제에대한특이적결합활성을보유한펩티드태그를연결시키는것을포함하고, 상기프로테아제저해제는지지체에고정되어있으며, 상기펩티드태그는정제될단백질에결합되어있는것일수있다. 하나의실시예에서, 상기방법은태깅된단백질을포함하는샘플을프로테아제저해제가고정된지지체에접촉 (contact) 시키는것을포함하고, 상기태깅된단백질은펩티드태그에공유결합으로연결된단백질이고, 펩티드태그는프로테아제저해제에대한특이적결합활성을가지며, 상기접촉은프로테아제저해제가펩티드태그에결합하는조건하에서이루어지고, 결합되지않은성분들은제거하는것및지지체로부터단백질을제거하는것을포함할수있다. 또한, 지지체및프로테아제저해제를포함하는친화성크로마토그래피매질이개시된다. 친화성크로마토그래피매질로팩킹 (pack) 된컬럼을포함하는친화성크로마토그래피컬럼또한개시된다. 프로테아제저해제에대한특이적결합활성을지닌펩티드태그및단백질을포함하는융합단백질이개시된다. 융합단백질을발현하는재조합세포또한개시된다. [0009] 발명의효과 본명세서에개시된방법및컬럼을통해항체와같은단백질을효율적으로정제할수있다. [0010] 도면의간단한설명 도 1 은본명세서에개시된하나의실시예에따른단백질정제과정을개략적으로도시한것이다. 도 2는정제된에코틴을전기영동한후의단백질겔사진이다. 도 3은에코틴친화성컬럼을이용하여정제된트립시노겐 (human cationic trypsinogen: PRSS1) 을전기영동한후의단백질겔사진이다. 도 4는단백질 A 친화성컬럼또는에코틴친화성컬럼중어느하나를각각이용한항-에코틴항체의친화성정제과정을나타낸모식도이다. 도 5는단백질 A 친화성컬럼또는에코틴친화성컬럼중어느하나를각각이용하여정제된항-에코틴항체의전기영동후단백질겔사진이다. 도 6은폴리펩티드서열 ( 서열번호 13) 및이의구조적특징을보여주는트립시노겐 (human cationic trypsinogen: PRSS1) 에대한스위츠-플랏엔트리 P07477(Swiss-Prot entry P07477) 의일부를재생한것이다. 도 7은 HEK293 세포에서돌연변이트립신태그가태깅되고, TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제절단자리또한삽입되도록돌연변이된헤비체인을포함하는재조합항-EGFR 항체의발현을확인한전기영동후의단백질겔사진이다. 도 8은 CHO-DG44(DHFR-) 세포에서발현된후에코틴친화성크로마토그래피에의해정제된돌연변이트립신태그로태깅된항-EGFR 항체를전기영동한후의단백질겔사진이다. [0011] [0012] 발명을실시하기위한구체적인내용본명세서는단백질정제를위한방법및단백질정제를위한친화성크로마토그래피매질을개시한다. 상기방법은프로테아제와프로테아제저해제사이의높은결합특이성을이점으로하여, 단백질예를들어항체를신속하게정제할수있도록한다. 본명세서에서언급된용어인 " 프로테아제 (protease)" 라함은, 단백질분해 (proteolysis) 를수행하는효소를의미하는것으로즉, 폴리펩티드체인에서아미노산들을연결하고있는펩티드결합을가수분해함으로써단백질을분해하는효소를의미한다. 프로테아제는세린프로테아제 (Serine proteases), 트레오닌프로테아제 (Threonine - 7 -

8 proteases), 시스테인프로테아제 (Cysteine proteases), 아스파르트산프로테아제 (Aspartic acid proteases), 메탈로프로테아제 (Metalloproteases) 및글루탐산프로테아제 (Glutamic acid proteases) 를모두포함한다. [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] 본명세서에서언급된용어인 " 펩티드태그 " 는프로테아제저해제에대한결합활성을보유한펩티드라면그유래나길이를불문하고모두포함된다. 예를들어, 펩티드태그는프로테아제저해제에대한특이적결합활성을보유한프로테아제, 프로테아제저해제에대한결합활성을보유한그단편또는프로테아제저해제에대한결합활성을보유한그돌연변이체등을포함한다. 프로테아제단편의일예로서프로테아제저해제결합활성은보유하지만전장프로테아제의단백질가수분해활성은결여된펩티드를들수있다. 프로테아제단편의일예로서프로테아제저해제에대한결합활성을보유한프로테아제로부터가장짧은펩티드일수있으며, 가수분해활성은결여된것일수있다. 또한, 펩티드태그의일예로서, 프로테아제돌연변이체를들수있으며, 이는와일드타입프로테아제 (wild type protease) 의단백질가수분해활성이예를들어단백질가수분해활성자리의돌연변이등에의해결여된것이나, 프로테아제저해제에대한결합친화성은보유하고있는것이다. 펩티드태그의길이는프로테아제저해제에대한결합친화도가유지되고단백질가수분해활성이없다면, 프로테아제로부터유래된 6개이상의인접아미노산일수있다. 본명세서에서언급된용어인 " 프로테아제저해제 (protease inhibitor)" 라함은, 프로테아제를저해하는모든물질을의미한다. 프로테아제저해제는저분자량화합물, 예를들어비가역적저해제인 4-(2-아미노에틸 ) 벤젠설포닐플로라이드하이드로클로라이드또는페닐메틸설포닐플로라이드일수있으며, 또는고분자량화합물예를들어단백질중어느하나일수있다. 본명세서에서언급된용어인 " 태깅된단백질을포함하는샘플 " 이라함은원하는특정단백질이포함된모든혼합물을의미하며, 천연으로부터유래된것이거나인공적으로제조된것임을불문하고모든혼합물이포함된다. 서로다른액체의혼합물뿐아니라액체와고체가혼합된혼합물, 서로다른고체와고체가혼합된혼합물도포함한다. 예컨대, 원하는특정단백질이함유된샘플의예시에는혈액, 혈청, 복수액 (ascites fluid), 우유, 조직샘플, 세포배양물, 세포용해물또는세포배양의상층액이포함될수있다. 본명세서에서언급된용어인 " 지지체 " 는프로테아제저해제를고정하여친화성크로마토그래피매질을얻을수있는것이라면형태나만들어질재료등을불문하고모두사용될수있다. 예컨대, 친화성크로마토그래피에서통상적으로사용되는아가로스 ; 셀룰로오스 ; 및폴리아크릴아미드등을들수있다. 본명세서에서언급된용어인 " 크로마토그래피매질 " 은형태 ( 컬럼또는평판 ), 상태 ( 액체또는고체 ) 또는만들어진재료를불문하고크로마토그래피정제를위해사용되는고정상을의미한다. 통상적으로단백질정제를위해사용되는크로마토그래피매질의예시에는이온교환크로마토그래피수지, 친화성고정상및겔침투고정상이포함된다. 본명세서에서언급된용어인 " 연결된 ( 커플링된 : Coupled)" 은두종이상의유전자또는단백질이직접접촉하고있는것뿐만아니라사이에링커유전자또는단백질이개재되어있는것까지도포함한다. 또한, 공유결합및비공유결합으로연결된것을모두포함한다. 본명세서에서언급된용어인 " 단백질 " 은정제를원하는대상으로서의단백질을의미하며, 정제대상의단백질이라면그종류를불문하고모두포함될수있다. 일예로서, 항체등을들수있다. 본명세서에서언급된용어인 " 태깅된단백질 " 은펩티드태그에공유결합을통해연결된단백질을의미한다. 본명세서에서언급된용어인 " 융합단백질 " 은 2가지이상의별개폴리펩티드의모든조합을의미한다. 융합단백질의예시로는원래별개의폴리펩티드를코딩하는 2 이상의핵산을결합하여생성된단백질일수있다. 태깅된단백질은융합단백질일수있으며, 펩티드태그를코딩하는핵산이단백질을코딩하는핵산에연결되어융합단백질을코딩하는핵산을얻을수있다. 융합단백질은 2 이상의폴리펩티드의조합을포함하며, 상기 2 이상의폴리펩티드는공유결합으로연결된다. 상기융합단백질은 2 이상의별개의폴리펩티드의조합을포함하며, 상기 2 이상의별개의폴리펩티드는비공유결합으로연결된것이다. 상기 2 이상의별개의폴리펩티드는어떠한매개자없이서로직접적으로접촉할수있다. 상기 2 이상의별개의폴리펩티드는링커펩티드와같은매개자에의해매개될수있다. 본명세서에개시된방법은프로테아제와특이적프로테아제저해제사이의높은결합특이성을이용하여단백질을정제하는것이다. 하나의실시예에서, 상기방법은태깅된단백질을포함하는샘플을고정된프로테아제저해제를가지는지지체 - 8 -

9 에접촉시키는것을포함하고, 상기태깅된단백질은펩티드태그에공유결합으로연결된단백질이고, 펩티드태그는프로테아제저해제에대한특이적결합활성을가지며, 상기접촉은프로테아제저해제가펩티드태그에결합하는조건하에서이루어지고, 결합되지않은성분들은제거하는것 ; 및지지체로부터단백질을제거하는것을포함한다. 몇몇실시예에서, 샘플은세포용해물, 세포배양물, 세포배양의상층액또는단백질을포함하는생물액 (biological fluid) 이다. 몇몇실시예에서, 지지체상에고정된프로테아제저해제를가지는지지체는친화성크로마토그래피컬럼인것을특징으로한다. [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] 본명세서에언급된단백질정제에사용되는방법및컬럼에서, 일회용컬럼이사용될수있다. 일회용컬럼은약 0.1 내지약 1.0 mm, 약 0.3 내지약 0.7 mm 또는약 0.5 mm의직경을가질수있다. 컬럼은약 16 x 125 mm 사이즈의글라스테스트튜브에위치할수있다. 하나의실시예에서, 약 0.5 mm의직경을가지는일회용컬럼이 16 x 125 mm의글라스테스트튜브에위치한다. 크로마토그래피매질, 예를들어아가로스겔은업계에알려져있는어떠한방법에따라컬럼내에팩킹된다. 하나의실시예에서, 충분한부피의탈기된버퍼 / 물을컬럼에첨가하여저수부분 ( 넓은개구 ) 까지채운다음, 컬럼내의모든공기버블이제거되도록할수있다. 이후, 겔은실온에서탈기된 50% 겔슬러리및탈기된버퍼용액 ( 또는물 ) 과함께컬럼에팩킹될수있다. 충분한부피의탈기된겔슬러리를첨가하여목적하는안정적인겔부피를얻을수있다. 겔은컬럼내에서 30분이상정치되도록할수있다. 팩킹된컬럼은 4 에서보관하여사용될수있다. 태깅된단백질을지지체로부터제거하는것은태깅된단백질을지지체로부터용출시킨다음, 태깅된단백질로부터펩티드태그를분리하여단백질을얻는것을포함할수있다. 태깅된단백질을지지체로부터용출시키는것은펩티드태그와프로테아제저해제사이에결합친화성을저하시키는 ph에서용출을수행하여태깅된단백질이지지체로부터제거되는것일수있다. 태깅된단백질로부터펩티드태그를분리하는것은용출된태깅단백질을프로테아제, 예를들어 TEV 프로테아제, 파파인또는펩신으로처리하는것일수있다. 경우에따라서, 컬럼상에서단백질과결합된펩티드태그를효소로절단하여단백질을컬럼으로부터제거할수있으며, 컬럼에결합된펩티드태그는남기고, 단백질은컬럼으로부터자유롭게용출된다. 도 1에는본명세서에개시된방법에따라단백질을정제하는과정이개략적으로도시되어있다. 보여지는하나의실시예에서, 단백질은이뮤노글로불린헤비체인의 C-말단에공유결합으로결합된펩티드태그를포함하는항체이다. 보여지는실시예에서, 특이적으로펩티드태그에결합하는프로테아제저해제가지지체상에고정되어친화성크로마토그래피매질을얻게된다. 만약단백질을포함하는샘플이친화성크로마토그래피매질을포함하는친화성크로마토그래피컬럼을통해흐른다면, 단백질은펩티드태그와프로테아제저해제사이의특이적결합에의해컬럼상에잔류할것이고, 기타샘플의다른성분은컬럼상에잔류하지않을것이다. 이후결합단백질은컬럼으로부터제거될수있다. 도 1에서보여지는바와같이, 펩티드태그가결합된단백질은펩티드태그가프로테아제저해제와더이상결합하지않는조건에서용출에의해, 예를들어더낮은 ph의버퍼에서용출하여컬럼에서제거될수있다. 용출된단백질은이후, 펩티드태그로부터분리될수있다. 예를들어, 도 1에서와같이, 태깅된항체를효소, 예를들어펩신또는파파인으로처리하여 F(ab)2 또는 Fab 단편을제조할수있다. 또한, 항체헤비체인을돌연변이시켜파파인절단자리를파괴하고, 펩티드태그와항체사이에새로운파파인절단자리를삽입한다음, 컬럼으로부터방출된융합단백질을파파인으로처리하여태깅된항체로부터펩티드태그를제거할수있다. 본명세서에서개시된방법에서펩티드태그를사용할수있으며, 하기프로테아제군중어느것에대한돌연변이프로테아제로부터유래된펩티드태그가포함된다 : 세린프로테아제 (Serine proteases), 트레오닌프로테아제 (Threonine proteases), 시스테인프로테아제 (Cysteine proteases), 아스파르트산프로테아제 (Aspartic acid proteases), 메탈로프로테아제 (Metalloproteases) 및글루탐산프로테아제 (Glutamic acid proteases). 구체적으로, 펩티드태그는파파인, 트립신, 펩신, 키모트립신, 레닌, 카텝신 D (Cathepsin D), 써몰리신 (Thermolysin), 엘라스타아제 (Elastase), 플라스민 (plasmin), 트롬빈, 유로키나아제 (Urokinase) 또는콜라게나아제 (Collagenase) 등의돌연변이로부터유래된펩티드태그를포함하나, 이에한정되는것은아니다. 펩티드태그는알려진어떠한방법에의해서라도제조될수있다. 가수분해활성을저해하는데필요한최소레벨에서돌연변이가일어날수있다. 예를들어, 단일뉴클레오티드또는단일아미노산의치환만으로도펩티드태그로사용될수있는프로테아제돌연변이가제조될수있다. 이와관련하여, 통상알려진방법으로사이트- 다이렉트돌연변이 (site-direct mutagenesis) 가사용될수있다. 몇몇실시예에서, 가수분해활성자리전체가펩티드태그에서제거된다. 제거는통상알려진어떠한방법을사용하여이루어질수있다. 본명세서에개시된방법또는친화성크로마토그래피매질에서사용될수있는프로테아제저해제로는에코틴 - 9 -

10 (ecotin), 파파야쿠니쯔트립신저해제 (papaya Kunitz-type trypsin inhibitor), 펩스타틴 A(pepstatin A), 루펩틴 (leupeptin), Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드, a2-마크로글로불린, a2-안티플라스민, 안티트롬빈 III 휴먼, a1- 안티트립신, 브델린 (bdellin), 펩시노스트렙틴, 키모스타틴, 포스포르아미돈, 이소아밀포스포닐-Gly-L-Pro-L- Ala 및디포타슘 2(R)-2-머캡토메틸-4-메틸펜타노일 -베타-(2-나프틸)-Ala-Ala 아미드등을들수있으나이에한정되는것은아니다. 구체적으로프로테아제저해제의예를들면하기표 1 또는표 2와같다. [0031] 프로테아제저해제 구체적인예 a2-안티플라스민 (a2-antiplasmin) Product Code A0914 (Sigma) 아프로티닌 (Aprotinin) Product Code A1153 (Sigma) 안티트롬빈 III 휴먼 (Antithrombin III, Human) Product Code A2221 (Sigma) a1-안티트립신 (a1-antitrypsin) Product Code A6150 (Sigma) 안티파인 (Antipain) Product Code A6191 (Sigma) 안티트롬빈 III 소 (Antithrombin III, Bovine) Product Code A9141 (Sigma) 브델린 (Bdellin) Product Code B3906 (Sigma) 에코틴 (Ecotin) Product Code B3910 (Sigma) 또는 manual 정제 루펩틴 (Leupeptin) Product Code B3912, L2023 (Sigma) a2-마크로글로불린 (a2-macroglobulin) Product Code B3913, M6159 (Sigma) N- a-p-토실-l-라이신클로로메틸케톤 Product Code B3918, T7254 (Sigma) 하이드로클로라이드 (N- a-p-tosyl-l-lysine chloromethyl ketone hydrochloride) 트립신-키모트립신저해제 (Trypsin-chymotrypsin Product Code B3923 (Sigma) inhibitor) 키모스타틴 (Chymostatin) Product Code C7268 (Sigma) 시스타틴 (Cystatin) Product Code C8917 (Sigma) E-64 Product Code E3132 (Sigma) 엡셀렌 (Ebselen) Product Code E3520 (Sigma) Gly-Gly-Tyr-Arg Product Code G5386 (Sigma) N- a-p-토실-l-페닐알라닌클로로메틸케톤하이드로클로라 Product Code A0917 (Sigma) 이드 (N- a-p-tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone hydrochloride) 글리신맥스유래트립신저해제 (Trypsin Inhibitor from Product Code T1021, T9767 (Sigma) Glycine max) (soybean) papaya Kunitz-type trypsin inhibitor Mannual 정제 표 1 [0032] 또한, 본명세서에개시된방법에서사용될수있는프로테아제 - 프로테아제저해제의조합의예를들면하기표 2 와같다

11 표 2 [0033] [0034] [0035] 본명세서에개시된방법의일실시예에서프로테아제저해제는에코틴이고, 대장균 (E.coli) 유래의세린프로테아제저해제로서, 트립신과다른췌장프로테아제를저해하는활성을갖는다. 에코틴은 100 및 ph 1.0의조건하에서도 30분이상안정된상태를유지할수있다. 에코틴의분자량은 18kD이며, 등전점 (Pi) 는 6.1이다. 에코틴은트립신, 키모트립신, 췌장엘라스타아제, 래트마스트셀, 카이마아제, 및인간의세로살유로키나아제 (serosal urokinase) 에의해분해되지않는다. 또한, 에코틴은인간의폐트립타아제 (human pulmonary tryptase), 칼리크리엔 (kallikrein), 파파인 (papain), 펩신 (pepsin), 스타필로코쿠스아우레우스 V8 프로테아제 (Staphylococcus aureu8 V8 protease), 서브틸리신 (subtilisin) 및써몰리신 (thermolysin) 은저해하지않는다. 더욱이, 대장균으로부터분리된여덟가지의가용성엔도프로테아제인 Do, Re, Mi, Fa, So, La, Ci 및 Pi를저해하지않으며, 키모트립신유사에스테라아제 (protease I) 및트립신-유사에스테라아제 (protease 11) 를저해하지않는다. 본발명의방법에따른하나의실시예에서, 프로테아제저해제는에코틴이고, 프로테아제는트립신이다. 트립신은소화계에서발견되는세린프로테아제로서, 단백질을분해한다. 예를들어, 트립신은우유중카제인을분해한다. 트립신은프롤린이뒤따르지않는한라이신과아르기닌의카르복실사이드의펩티드체인을주로절단한다. 트립신은췌장에다량존재하며, 쉽게정제될수있다. 본명세서에개시된방법의또다른일실시예에서프로테아제저해제는카리카파파야 (Carica papaya) 에서유래된파파야프로테이나아제저해제 (Papaya proteinase inhibitor, PPI) 의일종인파파야쿠니쯔-타입트립신저

12 해제이다. 파파야쿠니쯔-타입트립신저해제는소의트립신을 1:1 몰비로저해한다. 파파야쿠니쯔-타입트립신저해제는매우넓은 ph 범위 ( ) 와 80 까지의고온에서도완전한저해활성을보유하는저해제이다. 그뿐아니라, 강한화학적변성제 ( 예컨대, 5.5M 구아니딘하이드로클로라이드 ) 가고농도인경우에도안정하다. 파파야쿠니쯔-타입트립신저해제는또한펩신에대해현저히우수한단백질분해저항성을나타낸다. 본명세서에개시된방법의몇몇실시예에서, 프로테아제저해제는파파야쿠니쯔-타입트립신저해제이고, 프로테아제는트립신이다. [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] 단백질을코딩하는핵산은펩티드태그를포함하여설계즉, 유전자가단백질및펩티드태그를포함하는융합단백질을코딩하도록설계될수있다. 융합단백질을코딩하는유전자는그다음벡터에도입되고, 이후벡터는적합한숙주세포를변형시키는데사용된다. 앞서언급한바와같이, 만약단백질이펩티드태그가유래된프로테아제에민감한서열을포함한다면, 펩티드태그프로테아제에의해단백질의단백질가수분해활성을막는것이중요하다. 이는예를들어, 단백질가수분해활성자리부분에서프로테아제의유전자돌연변이에의해막을수있다. 돌연변이, 융합단백질 ( 태깅된단백질 ) 을코딩하는재조합핵산의형성, 재조합발현벡터의형성및숙주세포의형질전환은관련기술분야에서알려진어떠한방법에의해서라도수행될수있다. 용어 " 벡터 " 는이에연결된다른핵산을전달할수있는핵산분자이며, 이에연결되어작동되는단백질을코딩하는핵산의발현을지정한다. 더욱이, 벡터는적절한마커를가져형질전환된숙주세포를스크리닝할수있다. 사용가능한벡터로는박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피좀, 바이러스및삽입가능한 DNA 단편 ( 상동성재조합에의해숙주세포게놈으로삽입가능한단편 ) 이포함될수있다. 용어 " 연결되어작동되는 " 은단일핵산상의핵산서열연관성으로하나의기능이다른것에의해조절된다는것을의미한다. 예를들어, 프로모터가코딩서열의발현을제어할수있는경우 ( 즉, 코딩서열이프로모터의전사조절하에있는경우 ) 프로모터는코딩서열과연결되어작동되거나, 리보좀결합자리가번역을촉진시킬수있도록위치하고있다면, 리보좀결합자리는코딩서열에연결되어작동되는것이다. 코딩서열은센스방향또는안티센스방향에서조절서열에연결되어작동될수있다. 벡터는숙주세포에도입되어, 융합단백질또는앞서언급한핵산에의해코딩되는펩티드를생산할수있다. 몇몇경우에, 벡터는숙주세포에의해인식되는프로모터를포함할수있다. " 프로모터 " 는전사를지시하기에충분한최소서열을의미한다. 또한, 세포유형특이적또는외부의신호또는제제에의해유도되는조절가능한프로모터의존적유전자를발현하도록하는데충분한프로모터구성이포함될수있으며, 이러한구성들은유전자의 5' 또는 3' 부분에위치할수있다. 보존적프로모토및유도적프로모터둘다포함된다. 프로모터서열은원핵생물, 진핵생물또는바이러스로부터유래될수있다. 숙주세포-숙주중목적하는정도의핵산발현을위한적합한프로모터활성을가지는양립적프로모터를선택하는것은당업자의능력범위내에있다. 벡터는추가적발현조절서열을가질수있다. " 조절서열 " 은소정의숙주개체내에서연결되어작동되는코딩서열의발현에필요한 DNA 서열을의미한다. 조절서열은샤인-달가노서열 (Shine-Dalgarno sequence) 유래일수있다. 예를들어, 샤인-달가노서열은 MS-2상의레플리케이스유전자 (replicase gene) 또는박테리오파지 1의 cii 유전자유래일수있다. 숙주의형질전환은잘알려진다양한기술중어느하나에의해수행될수있다. 본발명의일실시예에따른프로테아제저해제친화성컬럼은프로테아제저해제를알데히드에의해활성화된아가로스비드및소디움시아노보로하이드라이드 (NaBH3CN) 를사용하여환원적아미노화 (reductive amination) 에의해고정화킴으로써제작될수있다. 본발명의또다른일실시예에따른프로테아제저해제친화성컬럼은하기과정을통해제작될수있다 : 1. 지지체의제조 : [0044] 프로테아제저해제가커플링될수있는지지체가제조될수있다. 지지체로서는아가로스젤을사용할수있다. 예컨대, 동결건조된아가로스비드를용매에현탁하여사용할수있다. 동결건조된아가로스비드로는시아노겐브로마이드 (CNBr)-활성화된세파로오스 (Sepharose) 4B (GE Health care) 를들수있다. 시아노겐브로마이드 (CNBr)-활성화된세파로오스 (Sepharose) 4B를첨가제의존재하에동결건조시킴으로써제조될수있다. 반응기의활성을보존하여야하기때문에세파로오스 (Sepharose) 4B에프로테아제저해제를커플링하기전에, 첨가제는낮은 ph에서시아노겐브로마이드 (CNBr)-활성화된세파로오스 (Sepharose) 4B를세척하여제거된다

13 이를위해바람직한 ph는약 3 이하일수있으며, 이는만일높은 ph로하는경우가수분해를유발할수있기때문이다. 동결건조된아가로스비드는용매예를들어 1mM HCl 중에현탁시킨다. 보통 1g의동결건조된용매중현탁된시아노겐브로마이드 (CNBr)-활성화된세파로오스 4B 비드가부풀어오른후약 3.5 ml의최종지지체부피를생성한다. 상기현탁직후지지체가올랐을때, 예를들면, porosity가 G3인소결글래스필터상에서 1mM HCl로 15분간세척하는것을들수있다. [0045] 2. 프로테아제저해제의커플링 (Coupling) [0046] 프로테아제저해제를항목 1의지지체와커플링시키는단계이다. 먼저프로테아제저해제를커플링용액에용해시킨다. 사용되는커플링용액은상기동결건조된세파로오스파우더 1g 당약 3-7ml의양으로사용될수있다. 또한, 부풀어오른지지체 1ml 당약 5-10mg의프로테아제저해제를사용할수있다. 프로테아제저해제의분자량이작은경우 (5kD이하) 에는지지체 1ml 당 1-10μ몰의농도로첨가될수있다. 커플링용액의예로는 0.1M NaHCO 3 (ph 8.3)/0.5M NaCl를들수있다. 이렇게하여제조된프로테아제저해제함유커플링용액에 항목 1 에서제조된지지체현탁물을첨가하고교반시킨다. 온화한교반방법이라면그종류에제한없이모두 사용될수있으며, 예를들어엔드 - 오버엔드 (end-overend) 로샘플을회전시켜교반할수있다. [0047] [0048] [0049] 단백질정제방법중하나의실시예에서, 결합된단백질의용출은프로테아제저해제친화성크로마토그래피컬럼으로부터단백질의용출을허용하는적합한용매중에서일어날수있다. 몇몇실시예에서, 용출은 ph 용출을통해서수행될수도있다. 예컨대, ph를 2-5 정도로조정함으로써프로테아제돌연변이태그가붙어있는항체를용출시킬수있다. 예를들어프로테아제저해제로서에코틴을사용하는경우, 에코틴은강한산에서도매우안정하고상보적인펩티드태그와도결합력이매우강한단백질이므로용출은 ph 2-3에서가능하게된다. 용출 ph가낮을수록 (3) 단계의세척이용이하고용출효율을높일수있으므로, 항체수율과순도를더욱높일수있게된다. 프로테아제저해제로서파파야쿠니쯔-타입트립신저해제 (papaya Kunitz-type trypsin inhibitor) 를사용하는경우파파야쿠니쯔-타입트립신저해제는산에서는매우안정하나에코틴에비해상보적펩티드태그와의결합력이 1/100 정도낮으므로용출이 ph 3-4에서가능하게된다. 이처럼프로테아제돌연변이태그와프로테아제저해제간의결합력은매우다양함으로, 경우에따라다른용출 ph를다른프로테아제저해제친화성매질및상보적펩티드태그의조합에대하여사용할수있다. 펩티드태그가붙어있는단백질을컬럼에서분리하는또다른방법으로활성프로테아제를이용할수있다. 이때사용되는활성프로테아제는컬럼내의프로테아제돌연변이태그를분해하지못하거나또는단백질이불활성이도록하는성질의것을선택적으로사용한다. 예를들어, 앞서언급한바와같이이러한방법이항체에사용되는경우용출되는것은항체단편 (Fab, F(ab)2) 이나항체전체분자가될수있다. 단백질로부터펩티드태그를분리하는것은특별히제한되지는않지만, 효소처리를하여수행될수있다. 예컨대, 단백질로항체를사용하는경우태깅된항체를파파인이나펩신과같은효소로처리하게되면, 앞서언급된바와같이 F(ab)2 단편이나 Fab 단편이얻어진다. 파파인으로단백질가수분해하여이뮤노글로불린전체를제공할수있는태깅된항체를얻기위해서는이뮤노글로불린헤비체인유전자의파파인절단자리를돌연변이시키고, 펩티드태그를코딩하는핵산과이뮤노글로불린헤비체인유전자사이에파파인절단자리를삽입한후, 얻어진태그가붙어있는항체에파파인을처리함으로써얻을수있다. 이는도 1의오른쪽하단부에도시되어있다. 경우에따라서, TEV 프로테아제절단자리가펩티드태그와단백질사이에삽입될수있다. 펩티드태그는융합단백질을 TEV 프로테아제로처리하여단백질로부터분리될수있다. 이하에서는실시예를들어본발명을더욱상세히설명하고자하나, 이는예시를위한것일뿐본발명의범위가이에한정되는것은아니다. [0050] 실시예 [0051] < 실시예 1: 에코틴의정제 >

14 [0052] 1. 에코틴의준비 [0053] [0054] 서열번호 1의에코틴을과발현벡터에클로닝하여대장균에서과발현시켰다. 발현된세포는 15분동안 5,000 x g에서원심분리하여수집하였다. 세포를초음파에의해분쇄하고, 30분동안 12,000 x g에서원심분리하여조추출물을얻는다. 조추출물을 1 M HCl을첨가하여처리하고 ph를 3으로조정한다. 10분동안 12,000 x g에서원심분리에의해상층액에서에코틴을얻었다. 재조합에코틴을 4 에서 20분간인큐베이션시킨다음, 1M 트리스베이스를첨가하여 ph를 7.8로재조정하고, 100 에서 20분간가열한다. 각단계에서, 12,000 x g로 10분간원심분리시켜불용성물질을제거하여상층액을얻고, 얻어진상층액에고체암모늄설페이트를첨가하여 80%(w/v) 로포화시킬때까지 10% 간격으로, 분획된단백질을수득하였다. 침전된단백질을 6mM MgCl 2 를함유한 10mM Tris-HCl (ph 7.8) 에대해투석시키고동일한버퍼로평형화된음이 온교환컬럼상에로딩하였다. 컬럼에결합하지않은단백질들을수거하여트립신친화성컬럼을사용하여정 제하고, 이후정제된에코틴을 4 에저장하였다. [0055] [0056] 2. 젤전기영동항목 1에서얻어진에코틴에대해폴리아크릴아마이드젤전기영동을수행하였다. 에코틴의정제도를결정하기위해, Laemmli 논문 ( Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, ) 에기재된바와같이 0.1%(w/v) 소디움도데실설페이트 (SDS) 를함유한 10-20%(w/v) 폴리아크릴아마이드그레디언트슬랩젤을이용하여전기영동을수행하였다. 전기영동결과는도 2에나타내었다. 상기얻어진에코틴의정제도는 95% 이상임을알수있었다. [0057] 3. 에코틴의활성측정 [0058] 얻어진에코틴이프로테아제활성을갖는지를알아보기위해, 형광성펩티드의절단에대해분석한다 (Woo, K. M., Chung, W. J., Ha, D. B., Goldberg, A. L., and Chung, C. H. (1989) J. Biol. Chem. 264, ). 트립신, 키모트립신및엘라스타아제의기질로서 N-벤질옥시카르보닐-Ala-Arg-Arg-4-메톡시 -β-나프틸아미드, N-숙시닐 (Suc)-Leu-Leu-Val-Tyr-7-아미도-4-메틸쿠마린 (AMC) 및 Suc-Ala-Ala-Ala-AMC를각각사용한다. 적량의에코틴을 10ng의트립신, 2ng의키모트립신또는 30ng의엘라스타아제를 100mM Tris-HCl 버퍼 (ph 8) 에서혼합하여얻어진반응혼합물 0.1ml를실온에서 30분간인큐베이션시킨후각펩티드기질 (0.1mM) 을첨가한다. 트립신및키모트립신을분석할때에는 20mM CaCl 2 를함께첨가시켰다. 인큐베이션시킨후, 상기반응혼합물 을 0.9ml의 0.1 x 소디움보레이트 (ph 9.1) 와혼합한다음보일링워터배쓰에서 6분간가열하였다. 4-메톡시- p-나프틸아미드에대해서는 310nm( 여기 ) 및 410nm( 방출 ) 에서형광을측정하였고, AMC에대해서는 380nm( 여기 ) 및 440nm( 방출 ) 에서측정하였다. Bradford의논문 (Bradford, M. M. (1976)Anal. Biochem. 72, ) 에기재되어있는바와같이표준으로서소혈청알부민을사용하여단백질을분석하거나, 소멸계수 (extinction coefficient) 가알려진단백질에대해서는 280nm에서흡광도를측정하여단백질을분석하였다. 그결과위 1에서얻어진에코틴은트립신, 키모트립신및엘라스타아제의활성을모두 100% 저해하는것을알수있었다. [0059] < 실시예 2: 에코틴친화성컬럼의준비 > [0060] 정제된에코틴을환원적아미노화 (reductive amination) 반응을이용하여시아노겐브로마이드 (CNBr)- 활성화된 세파로오스 (Sepharose) 4B (GE Health care) 에고정화시켜, 본실시예에서에코틴친화성컬럼을제조하였다. [0061] 1. 크로마토그래피매질 (medium) 의제조 [0062] 시아노겐브로마이드 (CNBr)- 활성화된세파로오스 (Sepharose) 4B (GE Health care) 를칭량하여 1mM HCl 중에현

15 탁하고 30분이상방치하여젤이부풀어오르도록한다. 1g의동결건조된세파로오스파우더가약 3.5ml의최종매질부피를생성한다. 현탁직후지지체가침전하면상층액을버리는과정을반복하여부서진지지체조각등을분리하여버리고차가운 1mM HCl로세척한다. 이때사용한 1mM HCl의양은젤양의 15배를사용한다. 지지체를 0.1M NaHCO 3 (ph 8.3)/0.5M NaCl의커플링버퍼로세척하여, 지지체의버퍼를커플링버퍼로치환한다. [0063] 2. 에코틴의커플링 [0064] 실시예 1 에서얻어진에코틴을 0.1M NaHCO 3 (ph 8.3)/0.5M NaCl 의커플링버퍼에용해시킨다. 커플링버퍼는상 기동결건조된세파로오스파우더 1g당약 7ml의양으로사용된다. 이때지지체 1ml 당약 10mg의에코틴을사용하였다. 이렇게하여제조된에코틴함유커플링용액에상기 1에서제조된세파로스현탁물을첨가하고, 실온에서 3~4시간동안또는 4 에서밤새교반시킨다. 에코틴이커플링된아가로오스에스톱버퍼 (0.1M 에탄올아민 ) 를첨가하여반응을중지시킨다. 그후과량의에코틴을배지 ( 젤 ) 부피의 5배의커플링버퍼로세척하여제거한다. 크로마토그래피매질을 1M 에탄올아민 (ph 8.0) 으로옮기고 2~4시간동안정치한다. 그런다음상기매질을 ph를변화시키는 8회의사이클을통해세척한다. 이때각세척용버퍼는매질부피의 5배를사용한다. 각사이클은 50mM glycine, 1M NaCl(pH3.5) 로 1차세척한후 50mM Tris-HCl(pH 8)/1M NaCl로 2차세척하는것으로구성된다. 세척후크로마토그래피매질을다시 PBS(phosphate buffered saline) 로세척하고, 이때 PBS는매질부피의 10배를사용한다. [0065] 3. 항체의정제에일회용컬럼 ( 직경 0.5 mm) 를사용한다. 컬럼은 16 x 125 mm의글라스테스트튜브 ( 테스트튜브랙에서 ) 에위치한다. 충분한부피의탈기된버퍼 / 물을컬럼에첨가하여저수부분 ( 넓은개구 ) 까지채운다음, 컬럼내의모든공기버블이제거되도록한다. 겔은실온에서탈기된 50% 겔슬러리및탈기된버퍼용액 ( 또는물 ) 과함께컬럼에팩킹된다. 충분한부피의탈기된겔슬러리를첨가하여목적하는안정적인겔부피를얻는다. 컬럼내에서 30분이상겔을정치시킨다. 팩킹된컬럼은 4ㅀC에서보관하여사용된다. [0066] < 실시예 3: 에코틴친화성크로마토그래피를이용한트립신태그의정제 > [0067] 사람의양이온성트립시노겐 (Cationic trypsinogen, Prss1) 을클로닝하였다. 단백질가수분해활성이결여된돌연변이 PRSS1을얻어항-EGFR 항체 ( 서열번호 2) 를가수분해하지못하도록와일드타입사람의 PRSS1 (HGNC: 9475; UniProtKB/Swiss-Prot P07477)( 도 6, 서열번호 13) 을단백질가수분해활성자리에서사이트다이렉트돌연변이 (site-directed mutagenesis) 시킨다. 특히, 사이트다이렉트돌연변이키트 (Stratagen, # , site-directed Mutagenesis kit) 을사용하여 200번째세린아미노산의코돈을알라닌에대한코돈으로돌연변이시킨다. 얻어진돌연변이 PRSS1 유전자 ( 서열번호 2) 를 pet21b(novagen) 벡터에클로닝한후 YT 배지에서자란 E. coli BL21(DE3) 에서발현시킨다. 흡광도 600에서 O.D. 0.6일때, 1mM IPTG(Isopropyl-β-D- Thiogalactopyranoside) 를넣고 37 에서 4시간더배양한다. 배양하여얻어진세포를 50 mm Tris-HCl, ph 8.0, 및 0.2 M NaCl, 6M Guanidine-HCl 조성의버퍼하에초음파로분쇄한후원심분리기 (10000g) 를이용하여상층액을얻는다. 상층액은 50 mm Tris-HCl, ph 8.0, 및 0.2 M NaCl, 0.9M Guanidine-HCl 버퍼로투석하여리폴딩한다. 이렇게얻어진샘플을실시예 2에서제조된 1-mL 에코틴컬럼에적용시킨다. 적용후상기와동일한버퍼로세척한후 50 mm HCl로용리하여정제된트립시노겐을얻는다. 얻어진트립시노겐을실시예 1에서와같이전기영동한다. 그결과는도 3에나타나있다. 레인 1( 맨왼쪽 ) 은사이즈마커, 레인 2( 왼쪽에서 2번째 ) 는조추출물 ( 미정제추출물 ), 레인 3( 왼쪽에서세번째 ) 은플로우쓰루 ( 에코틴미결합추출물 ), 레인 4( 맨오른쪽 ) 는정제된트립신돌연변이태그 (purified trypsin mutant tag only ) 이다. [0068] < 실시예 4: 에코틴친화성크로마토그래피를이용한항 - 에코틴항체의정제 >

16 [0069] [0070] 실시예 1에서얻어진에코틴 200ug를 10mM Tris-HCl (ph 7.8) 버퍼에녹여하얀수컷 2개월령뉴질랜드토끼에피하에주사한후항-에코틴항체를생성한다. 항체생성후, 토끼의혈장을수득한다. 혈장샘플을 50 mm Tris-HCl, ph 8.0, 및 0.2 M NaCl로구성된로딩버퍼를사용하여 Protein A sepharose CL-4B(GE Healthcare) 또는실시예 2에서제조된에코틴컬럼에각각적용한다. 각컬럼은 50 mm Tris-HCl, ph 8.0, 및 0.5M NaCl로구성된버퍼로세척한후, 글라이신버퍼 (50 mm Glycine-HCl, ph 2.5) 로용출한다. 도 4는단백질 A 컬럼을이용한항-에코틴항체의정제과정또는에코틴친화성컬럼을이용한항-에코틴항체의정제과정을나타낸모식도이다. 단백질 A 친화성컬럼크로마토그래피에의해정제또는에코틴친화성컬럼크로마토그래피에의해정제된항-에코틴항체를실시예 1에서와같이단백질겔전기영동에의해분석한다. 도 5는전기영동결과를나타내는사진이다. 도 5에서레인 1과레인 7은사이즈마커이며, 레인 2에서레인 6은프로테인 A 컬럼의결과이며, 레인 8에서레인 12는에코틴컬럼의결과이다. 특히, 레인 2 및 8은조추출물 ( 컬럼에적용하지아니한혈장 ), 레인 3 및 9는미결합단백질 (Flow-through extract) ( 컬럼통과미결합추출물 ), 레인 4 및 10은 0.5M NaCl이들어있는버퍼의세척으로얻어진추출물, 레인 5 및 11은용리액에 DTT첨가한용액, 레인 6 및 12는용리액에 DTT를첨가하지않은결과이다. [0071] [0072] < 실시예 5: HEK293세포중 anti-egfr-trypsin(m)) 단일항체의발현 > 본실시예에서는, 트립신태그로태깅된단일클론 EGFR 항체 (anti-egfr-trypsin(m)) 를 HEK293세포 (ATCC.CRL- 1573) 에서과발현시켜특성화한다. 하기표 3은본실험에사용된항-EGFR 항체의 CDR(Complementarity Determining Regions) 부위아미노산서열이다. [0073] CDR 아미노산서열 헤비체인 라이트체인 CDR 1 DYGMS ( 서열번호 7) TGTSSDVGGYNYVS ( 서열번호 10) CDR 2 GINWNGGSTGYADSVKG ( 서열번호 8) DVNRRPS ( 서열번호 11) CDR 3 DYWGSLDY ( 서열번호 9) SSYVSTNTYV ( 서열번호 12) 표 3 [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] 타겟항원으로 EGFR 단백질 (Sigma E3641) 을사용하여패닝한파지라이브러리디스플레이라이브러리를사용하여항-EGFR 단일항체를얻는다. 항-EGFR 항체의헤비체인및라이트체인의가변부위에대한아미노산서열을준비한다음, 변형된 pcdna3.3 헤비체인벡터상에서헤비체인서열의가변부위를인간전체 IgG1 헤비체인항체백본으로치환한다. 변형된 pcdna3.3 라이트체인벡터상에서라이트체인서열의가변부위를인간전체 IgG1 라이트체인항체백본으로치환한다. 또한, 항-EGFR 단일항체의 Fc(fragment crystallizable region) 는서열번호 : 5의서열을가진다. 서열번호 5 는헤비체인단독에서의 Hinge, CH2 및 CH3의서열이다. 트립신태그는사람의돌연변이 PRSS1 (HGNC:9475)( 서열번호 2) 로부터얻는다. 단백질가수분해활성이결여되어항-EGFR 항체를가수분해하지못하도록하게위해, 와일드타입인간 PRSS1(HGNC:9475; UniProtKB/Swiss- Prot P07477)( 도 6, 서열번호 13) 에대한유전자중가수분해활성자리에서사이트-다이렉티드돌연변이시킨다. 특히, 사이트-다이렉티드돌연변이키트를사용하여 200번째세린 (serine) 아미노산의코돈을알라닌 (alanine) 에대한코돈으로돌연변이시킨다. 다음의 PCR 프라이머를사용하여 PCR에의해돌연변이된 PRSS1 유전자를증폭한다 : XhoI-TEV-Forward( 서열번호 3, 5'-GAG-CTCGAG-GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGA TCC- ATCGTTGGGGGCTACAACTGTGAGGAG) 및 XhoI-TAA-R( 서열번호 4: 5'-GAG-CTCGAG-TTA GCT GTT GGC AGC TAT GGT GTT CTT A). 이러한프라이머를사용하여, 시그날펩타이드 (1-15aa) 와프로펩타이드 (16-23aa) 를제거한트립신도메인 (24-244aa, 서열번호 2) 을코딩하는핵산을돌연변이 PRSS1 유전자로부터증폭하여, 항-EGFR 항체의헤비체인을코딩하는핵산에연결하기위한트립신태그코딩핵산으로사용된다. 위에서얻어진트립신태그핵산을 XhoI 제한효소로절단하고, 항-EGFR 항체의헤비체인을코딩하는핵산의 C-말단 XhoI-사이트내 (Fc 부분의서열참조, 서열번호 5) 로, T4-DNA 라이게이즈 (NEB, M0202L) 를이용하여연

17 결한다. 항-EGFR 항체의헤비체인중 Fc를코딩하는 cdna( 서열번호 : 5) 의 697~699 위치에서헤비체인의중지코돈 (TGA) 을사이트-디렉티드돌연변이키트 (Stratagen, # ) 를이용하여제거한다. 중지코돈이제거된항체 cdna와제조된트립신태그핵산사이에 TEV 프로테아제절단부위 ( 염기서열 : 5'-GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGA TCC-3', 서열번호 : 6) 를삽입한다. [0079] pcdna 3.3-TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen) 을사용하여앞서언급한태깅된항-EGFR 항체의헤비체인구성을벡터에삽입한다. 또한, 항-EGFR 항체의라이트체인을코딩하는유전자역시 pcdna 3.3-TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen) 을사용하여백터에삽입한다. 이와같이얻어진헤비체인벡터와라이트체인벡터를각각 12μg씩준비한다. 전체 24 ug의플라스미드를리포펙타민 2000 (Invitrogen) 을이용하여 HEK293세포로트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션된 HEK293 세포의배양액으로서항생제 ( 페니실린 ( 최종농도가 100U/ml) 및스트렙토마이신 ( 최종농도가 100U/ml)) 및 10% FBS를포함하는 DMEM(Gibco cat no 11995) 를사용하여, 37, 5% CO 2 에서 3일간배양한다. 발현된항체의헤비체인및라이트체인은배지로각각분비되어, 헤비체인과라이트체인각각이결합하여항체복합체를형성한다. 그후세포배양액의상층액을수득하여, 실시예 2에서제조된에코틴컬럼에각각적용한다. 정제과정은다음과같다 : [0080] [0081] [0082] [0083] 위에서제조된에코틴친화성컬럼을당업계에널리공지된방법에따라세팅한다. 세포배양물상층액에 1/10 부피의 1.0M Tris-HCl(pH 8.0) 을첨가하여세포배양물상층액의 ph를조정한다. 그런다음, 세포배양물상층액을에코틴친화성컬럼에통과시킨다. 컬럼부피의 10배에해당하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)/0.5M NaCl로상기컬럼을세척한다. 그런다음컬럼부피의 10배에해당하는 50mM 소디움아세테이트 (ph 5.6)/0.5M NaCl로컬럼을다시세척한다. 그다음, 글라이신버퍼 (50 mm Glycine-HCl, ph 2.5) 을처리하여트립신이태깅된단일클론항체를용출시킨다. 그후 1M Tris-HCl (ph 9.0) 을첨가하여샘플의최종 ph를중성으로중화시킨다. 정제과정으로부터다양한샘플을도 1에서설명한바와같이단백질겔전기영동으로분석한다. 결과는도 7 에나타나있으며, 전기영동겔의사진이다. 도 7에서재조합항체의 HEK293에서의발현을확인한다. 도 7에서레인 1은사이즈마커이다. 레인 2에서레인 10은돌연변이트립신으로태깅된헤비체인을가지는항-EGFR 항체의에코틴친화성정제로부터얻은용액의전기영동결과이며, 레인 11과레인 12는트립신태그없는항-EGFR 항체를포함하며, DTT 존재또는부재하에서각각전기영동한것이다. 레인 2는대조군 (Control) 레인으로컬럼적용전세포배양액이다. 레인 3은 F: 미결합단백질 (Flow-through) 컬럼통과후용액즉, 컬럼에적용후에코틴에결합되지않은단백질이다. 레인 4는 E (+): 컬럼에서용출된용액 (Elution) 으로전기영동시에 DTT 첨가함. 레인 5는 E(-): 컬럼에서용출된용액 (Elution) 에전기영동시 DTT 첨가하지않음. 레인 6은 TEV 단독, TEV 프로테아제밴드는겔사진내에서 C로라벨링된다. 레인 7에서레인 10은 37 에서인큐베이션한경우로서, DTT의존재 (+) 또는부재 (-) 및 TEV 프로테아제의존재또는부재하에서용출된용액 (E) 에대한결과를나타내는것이다. 레인 7은 E(+): 레인 4와동일, 레인 8은 E(-): 레인 5와동일, 레인 9는 E+T, 레인 10은 E+T(-). 도 7의겔사진내의약칭과관련하여, A는항-EGFR 헤비체인-트립신융합단백질이고, B는 TEV 프로테아제처리후트립신이절단된항-EGFR 헤비체인이고, C는 TEV 프로테아제를, D는잘려진트립신 (5개 S-S결합을지닌단일체 ) 태그을, G는항-EGFR 라이트체인을가리킨다. [0084] < 실시예 6: 에코틴친화성크로마토그래피를이용한단일클론항체의정제 > [0085] 본실시예에서는, 실시예 5 에설명된항 -EGFR 단일클론항체가 CHO-DG44 (DHFR-) 세포 (Invitrogen. Cat.no ) 에서과발현시킨다

18 [0086] 도 5 에기재된바와같이, 돌연변이트립신으로태깅된항 -EGFR 헤비체인유전자는 pcdna 3.3-TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen) 을사용하여벡터로삽입한다. 또한, 항-EGFR 라이트체인을코딩하는유전자는 pcdna 3.3- TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) 을사용하여벡터로삽입한다. 본실험에서, 위에서얻어진헤비체인벡터와라이트체인 벡터각각을 18.75μg 씩준비한다. [0087] 이들벡터를트랜스펙션하기전에, 37, 8% CO 2 에서 130rpm 조건으로 48 시간전에, 24 시간전에각각한번씩두 차례에걸쳐 CHO-DG44 세포를 6 x 10 5 cells/ml 로 8mM L-glutamine 와 0.18% PLURONIC F-68 를첨가한 CD DG44 배지 (Gibco. Cat no.12610) 에서계대하여준다. 생존률이 95% 이상되는세포들을 3 x 10 7 cells로맞춰 125ml 플라스크에넣고, 최종 30ml이되도록 CD DG44 배지를넣어준다. 헤비체인벡터와라이트체인벡터각각 μg과 FreeStyle MAX reagent (Invitrogen, ) 37.5μl를 OptiPro SFM (Invitrogen의무혈청배지 ) 을이용하여전체부피 1.2ml이되도록넣으면서천천히섞어준다. 이후상온에서 10분간반응킨다. 플라스미드-지질복합체를 CHO-DG44(DHFR-) 세포가들어있는플라스크에천천히넣어주고, 제네티신 (Geneticin) 500 μg/ml를첨가한 CD DG44 배지에서 5일동안배양한다. 이후배양배지를수득하여정제하였고, 이때정제는실시예 2에서제조된에코틴친화성크로마토그래피매질에적용하였으며, 구체적인정제과정은다음과같다. [0088] [0089] 위에서제조된에코틴친화성컬럼을당업계에널리공지된방법에따라세팅한다. 위에서얻은세포배양물상층액에는약 4ug/ml의항체가존재한다. 상기세포배양물상층액에 1/10 부피의 1.0M Tris-HCl(pH 8.0) 을첨가하여세포배양물상층액의 ph를조정한다. 그런다음, 세포배양물상층액을에코틴친화성컬럼에통과시킨다. 그후컬럼부피의 10배에해당하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)/0.5M NaCl로컬럼을세척한다. 그런다음컬럼부피의 10배에해당하는 50mM 소디움아세테이트 (ph 5.6)/0.5M NaCl로컬럼을다시세척한다. 그후, 글라이신버퍼 (50 mm Glycine-HCl, ph 2.5) 를처리하여트립신이태깅된단일클론항체를에코틴친화성크로마토그래피매질로부터용출시키며, 1M Tris-HCl (ph 9.0) 을첨가하여샘플의최종 ph를중성으로중화시킨다. 정제과정으로부터다양한샘플을단백질겔전기영동으로분석하였다. 결과는도 8에나타나있다. 도 8에서레인 5는사이즈마커이다. 레인 1는세포배양액대조군 (Control) 으로컬럼적용전세포배양액이다. 레인 2 는에코틴에결합되지않은단백질 (Flow-through) 로컬럼통과후용액이다. 레인 3은 protein A 친화성컬럼으로정제된트립신태깅이없는대조군항-EGFR(anti-EGFR) 항체로, 라이트체인밴드 (C) 및헤비체인밴드 (B) 의위치를보여준다. 레인 4와 6는각각에코틴친화성크로마토그래피매질컬럼으로부터정제된트립신태깅된항-EGFR 항체 (anti-egfr-trypsin(m)) 를나타낸다. 레인 4에서, 트립신태깅된헤비체인밴드는 A로라벨링되고, C는라이트체인이다. 레인 6에서, DTT 부재시에체인은연결되어단일밴드로러닝 (run) 되며 (A/C로라벨링 ), 더큰분자량으로러닝된다. [0090] [0091] 본발명이속한분야에서통상의지식을가진자라면상기내용을바탕으로본발명의범주내에서다양한응용 및변형을행하는것이가능할것이다

19 도면 도면 1 도면

20 도면 3 도면

21 도면

22 도면

23 도면

24 도면 8 서열목록 <110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Method for purifying antibodies and affinity column for purifying antibodies <130> 10P002/SSE <150> KR <151> <150> KR <151> <160>

25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 162 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Lys Thr Ile Leu Pro Ala Val Leu Phe Ala Ala Phe Ala Thr Thr Ser Ala Trp Ala Ala Glu Ser Val Gln Pro Leu Glu Lys Ile Ala Pro Tyr Pro Gln Ala Glu Lys Gly Met Lys Arg Gln Val Ile Gln Leu Thr Pro Gln Glu Asp Glu Ser Thr Leu Lys Val Glu Leu Leu Ile Gly Gln Thr Leu Glu Val Asp Cys Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Lys Leu Glu Asn Lys Thr Leu Glu Gly Trp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Val Phe Asp Lys Val Ser Ser Pro Val Ser Thr Met Met Ala Cys Pro Asp Gly Lys Lys Glu Lys Lys Phe Val Thr Ala Tyr Leu Gly Asp Ala Gly Met Leu Arg Tyr Asn Ser Lys Leu Pro Ile Val Val Tyr Thr Pro Asp Asn Val Asp Val Lys Tyr Arg Val Trp Lys Ala Glu Glu Lys Ile Asp Asn Ala Val Val Arg <210> 2 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens

26 <400> 2 Met Asn Pro Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Asn Cys Glu Glu Asn Ser Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Gly His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Glu Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His Pro Gln Tyr Asp Arg Lys Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Arg Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ala Pro Pro Ala Thr Gly Thr Lys Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Ala Ser Ser Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Gln Cys Leu Asp Ala Pro Val Leu Ser Gln Ala Lys Cys Glu Ala Ser Tyr Pro Gly Lys Ile Thr Ser Asn Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Lys Trp Ile Lys Asn Thr Ile Ala Ala Asn Ser

27 245 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Forward Primer <400> 3 gagctcgagg aaaacctgta ttttcaggga tccatcgttg ggggctacaa ctgtgaggag <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Reverse Primer <400> 4 gagctcgagt tagctgttgg cagctatggt gttctta 37 <210> 5 <211> 717 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac

28 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgag tgcgacggcc gctcgag 717 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Tev cleavage site <400> 6 gaaaacctgt attttcaggg atcc 24 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Tyr Trp Gly Ser Leu Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 14 <212> PRT

29 <213> Homo sapiens <400> 10 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Val Asn Arg Arg Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Ser Tyr Val Ser Thr Asn Thr Tyr Val <210> 13 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Asn Pro Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Asn Cys Glu Glu Asn Ser Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Gly His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Glu Val

30 Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His Pro Gln Tyr Asp Arg Lys Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Arg Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ala Pro Pro Ala Thr Gly Thr Lys Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Ala Ser Ser Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Gln Cys Leu Asp Ala Pro Val Leu Ser Gln Ala Lys Cys Glu Ala Ser Tyr Pro Gly Lys Ile Thr Ser Asn Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Lys Trp Ile Lys Asn Thr Ile Ala Ala Asn Ser