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영완 소
5 years ago
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1 KU Microbial Biotechnology Laboratory 1 KUmbl 경북대학교미생물공학연구실 7 장. 아미노산발효

2 KU Microbial Biotechnology Laboratory 아미노산발효의종류 * 아미노산발효의종류 1. 직접발효법 : 미생물을이용하여기질로부터발효에의해생산 1) 야생균주에의한방법 : Glu 2) 영양요구변이주에의한방법 : Lys, Thr 3) Analog 내성변이주 : Lys, Thr, Trp 4) 아미노산감수성변이주 : Thr, Met 5) 대사의 bypass 이용 : Ile 6) 전구체첨가법 : Ile 2. 효소법 : 주로미생물효소를이용하여기질을아미노산으로전환 -Lys, Asp, Trp, Phe, Tyr 일부 3. 화학합성 : Ala, Gly, Met - 극히일부

2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 3 - 아미노산의생합성경로 1) 세린계열 (Ser, Gly, Cys) 3-Phosphoglycerate Serine Glycine Cysteine 2)

α-ketoisovaleric acid 4) 글루탐산계열 (Glu, Gln, Pro, Orn, Arg) Proline Valine Leucine α-kg Glutamate Ornithine Arginine Glutamine 5) 아스파르트산계열

3 KU Microbial Biotechnology Laboratory 3 - 아미노산의생합성경로 1) 세린계열 (Ser, Gly, Cys) 3-Phosphoglycerate Serine Glycine Cysteine 2) 방향족아미노산계열 (pepptt) Phenylalanine PEP + E-4-P Chorismate Tyrosine Anthranilate Tryptophan 3) 피루브산계열 (Ala, Val, Leu) Alanine Pyruvate α-ketoisovaleric acid 4) 글루탐산계열 (Glu, Gln, Pro, Orn, Arg) Proline Valine Leucine α-kg Glutamate Ornithine Arginine Glutamine 5) 아스파르트산계열 (Asp, Asn, Lys, Met, Thr, Ile) Lysine OAA Aspartate Homoserine 6) 히스티딘의합성 Ribose-5-phosphate Histidine Asparagine Methionine Threonine Isoleucine

2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 4 7-1.

4 KU Microbial Biotechnology Laboratory Glutamate 계열의아미노산 * Glutamate 계열의아미노산 : Glu, Pro, Arg, Orn Lyase Acetyl CoA Citrate Isocitrate Succinate Fumarate Malate OAA H2O ADP+ ADP+ ADPH2 H3 ADPH2 Oxalosuccinate CO2 Glyoxylate CoASH AD+ Acetyl CoA CO2 ADH2 Glyoxylate cycle Glutamate α-ketoglutarate Succinyl CoA TCA Glu dehydrogenase O=C-COOH a-kg α dehydrogenase CH2 CH2COOH Glucose(mw 180) + H O Glu(mw 147) + CO2 + 3H2O

5 KU Microbial Biotechnology Laboratory 5 1. Glu 발효 (-CH2-CH2COOH)-- 야생균주에의한직접발효법에의해생산 가. 생산균주 : Corynebacterium glutamicum 의야생주 1) Glu dehydrogenase 활성강, α-keto glutarate dehydrogenase 활성약 : α-kg 로부터 Glu 생산 - 탄수화물의 50% 를 Glu 로전환 : Succinyl CoA 로전환능약 - TCA cycle 약화 2) Biotin or glycerol 생육에요구 : 세포막투과성개량-합성 Glu 세포외분비가 ) biotin 제한배지 (5ppm 이하 : 2-5ppm) * biotin: acetyl CoA + CO2--malonyl CoA 생성반응의조효소 : 결핍시 oleic acid 등지방산합성불량 - 포화, 불포화지방산비불균형나 ) glycerol 제한배지 : glycerol 부족 - 인지질즉세포막형성불량

6 KU Microbial Biotechnology Laboratory 6 나. Glu 발효관리 1) 탄소원 가 ) 포도당, 전분당화액 : Glu 세포외분비양호, biotin 결핍으로증식불량 - 배지에소량의 biotin 첨가 나 ) 당밀 : 값이싸나 biotin 고농도함유 - 적당한시기에생육저해물질첨가 * 생육저해물질 - 항생물질첨가 : Penicillin 또는 Cephalosporin C- 세포벽합성불량 - biotin 길항제첨가 고급포화지방산 : C16(palmitate),C17(margariate),C18(stearate) 계면활성제 : Tween40(palmitate), Tween60(stearate 함유 ) 2) 질소원적당량유지 - H3 gas, H4OH 등산업적주로사용, 유안, 요소첨가로유가배양 - 과잉시 : Gln 생산 Glutamate H3 H2O - 결핍시 : α-ketoglutarate 생산 3) 산소과잉시 : ADPH2 가부족하여 α-ketoglutarate 축적결핍시 : 혐기적대사로젖산, 호박산생성 Glutamine H2-CH-COOH CH2 CH2-COOH2

7 KU Microbial Biotechnology Laboratory 7 다. Glu 의분리및정제 : Glu 분리 --Glu 정제 --MSG 제조 등전점침전법 1) Glu의분리 : 등전점침전법발효액의 ph를 3.2로조절 (Glu의석출 ) 하여원심분리 - HCl로용해 (Glu-HCl) 후농축 2) Glu의정제 : 재침전 Glu-HCl 온탕용해 - aoh로 ph3.2 조절하여 Glu 재침전 - 원심분리로 Glu 결정회수 - 냉수세척 (acl 및불순물제거 ) 3) MSG의제조유리 Glu 용해후 aoh로 ph6.5 조절 : a-glu 생성 (ph7.0 이상 : a 2 -Glu 생성 ) - 탈철, 탈색후농축하여결정화탈철 : a 2 S + Fe Fe 2 S 3, a 2 HPO 4 + Fe FePO 4 탈색 : 활성탄처리

8 KU Microbial Biotechnology Laboratory 8 2. Orn, Arg 발효 -- 의약용으로중요 Carbamyl phosphate Asp Glu -Acetyl -Acetyl Ornithine Citrulline Arginosuccinate Arginine glutamate ornithine Urea 가. Ornithine 발효 : C. glutamicum의 Cit - - citrulline 영양요구성변이주 - Ornithine으로부터 citrulline 전환불가 - Ornithine 분해불가, arginine에의한조절해제 - 배지에소량의 citruline 첨가하여배양 나. Arginine 발효 : -(CH2)3-H-C(=H)-H2 - 동물단백질에함량고 -성장기어린이에게필요 준필수아미노산의하나 - 최종산물로서영양요구변이주이용불가능 ( 최종산물조절 ) * Analog 내성변이주에의한발효가주 AH(Arginine hydroxamate) 내성변이주- arginine에의한조절해제

9 7-2. Aspartate 계열 (Asp 제외모두필수아미노산 ) 1. Lys 발효 : 곡류단백질에특히결핍, 열에불안정--한계아미노산가. 발효법 : C. glutamicum 변이주이용 -Homoserine dehydrogenase 활성약, Aspartokinase 조절해제 Glc OAA Asp β-aspartyl-p Aspartic-β-semialdehyde Homoserine Thr Aspartokinase Homoserine dehydrogenase Thr+Lys 협조적조절 Lys Met Ile * 변이주의특성 1) Hom - homoserine 영양요구성변이주 : Thr 합성불가 : Thr+Lys 조절해제, Lys 축적 : inhibition, : repression 2) Met s, Thr s - 감수성변이주 - Thr, Met 많으면생육저해 - Thr, Met 생산량매우적은변이주 H2-CH-COOH : Thr+Lys 조절해제, Lys 축적 (CH2)4 H2 3) AEC r : 2-aminoethyl-cysteine 내성변이주 : AEC 및 Lys에의한조절해제 Lys SH CH2 H2-C-COOH (CH2)2 H KU Microbial Biotechnology Laboratory 9 AEC

10 * 발효조건 1) 탄소원 : 사탕수수당밀주로이용 2) 질소원 : 암모니아가스또는암모늄염 - 부원료 : 탈지대두박가수분해물등 3) 영양요구물질 : 필요에따라 homoserine, Thr, Met 소량첨가 4) Biotin 30ppm 이상유지 사탕수수당밀에충분히함유 나. 효소법에의한 Lys 의생산 : α-amino-ε-caprolactam 으로부터효소반응으로 Lys 생산 (cyclohexane 으로부터화학합성 - D, L 형 50% 함유 ) -D 형을 L 형으로전환후가수분해 D- -amino- -caprolactam L- -amino- -caprolactam L-Lysine Racemase Hydrolase H lactam H H2-CH-COOH Achromobacter obae Cryptococcus laurentii (CH2)4 O O ε -Racemase 강 -Hydrolase 강 H2 Hydrolase 약 Racemase 무 α H2 H KU Microbial Biotechnology Laboratory 10

11 KU Microbial Biotechnology Laboratory Thr 발효 Glc OAA Asp β-aspartyl-p Aspartic-β-semialdehyde Homoserine Thr Aspartokinase Homoserine dehydrogenase Lys Met Ile : 조절해제 (Thr, Lys, Met), Thr 의분해억제, 중간산물타물질로의전환방지 * E. coli와 C. glutamicum 변이주사용한직접발효법 : 포도당으로부터생산 : E. coli - Thr 합성경로는 Corynebacterium sp. 와동일하나조절현상상이 ***E. coli의 Asp 계열조절현상 :..\Asp 계열조절현상.ppt 가 ) α-ahv r : Thr analog 내성변이주 (α-amino-β-hydroxyvaleric acid) 나 ) DAP - : diaminopimelic acid 합성불가 - Lys 합성불가, ASA 분해방지다 ) Met - : homoserine으로부터 Met 합성불가 - Met 조절해제, homoserine 분해방지라 ) Ile - : Thr로부터 Ile 합성불가 - Thr 분해방지

12 KU Microbial Biotechnology Laboratory Ile 발효 1) S. marcescens, C. Glutamicum 변이주를이용한직접발효법 주 2) Serratia marcescens를이용한대사의 bypass 또는전구체첨가법 - 기질로서 D-Thr 또는 α-amino butyrate 사용 L-Threonine α-ketobutyrate Ile H3 α-amino butyrate α-ketobutyrate Ile H2O H3 AD+ ADH2 4. 효소법에의한 Asp의생산 : E. coli aspartase를고정화하여 fumarate를 amination시켜제조 E. coli의 aspartase Fumarate+ H3 또는 ammonium fumarate Aspartate ( 거의 100% 전환가능 ) CHCOOH HOOCHC CHCOOH4 HOOCHC H2-CH-COOH CH2-COOH

13 KU Microbial Biotechnology Laboratory 13 2 H + O Aromatic 계열 : Phe, Tyr, Trp : 구조유사, 생합성경로공통, 조절기구복잡 - 발효법생산곤란 - 효소적생산 1. Trp 의생산 : Lys 다음으로곡류 ( 특히옥수수 ) 에결핍되기쉬운필수아미노산 1) 효소법 : E. coli Trp synthetase 또는 Providencia rettgeri 의 tryptophanase 사용 + 3 H + HOOCOC 3 HC ) 발효법 : C. glutamicum 의 Phe -, Tyr -, 5-FT r H elodni Phenylalanine PEP + E-4-P Chorismate Tyrosine Anthranilate Tryptophan 2 HC HOOC- HC -

14 KU Microbial Biotechnology Laboratory Phe, Tyr의생산 - 생체내생합성경로거의유사 - C. glutamicum, B. subtilis의변이주를이용한직접발효법 1) 영양요구성변이주 : Tyr 생산시 Phe -, Phe 생산시 Tyr - 2) analog 내성변이주 : Phe - P(M)FP(p or m-fluorophenyl alanine), PAP(p-aminophenylalanine) : Tyr - 3-amino tyrosine, tyrosine hydroxamate * Phe : aspartame ( 설탕의 200배감미 ) 의원료 - L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester 3. DOPA (3,4-dihydroxy phenylalanine) : Parkinson 씨병 (P's syndrome) 등노인성뇌신경장해치료약 - 미생물의대사와무관 : 직접발효에의한생산불가 L- or D-Serine(-CH2OH) or Pyruvate + H3 pyrocatechol + OH OH β-tyrosinase -Erwinia herbicola 의효소주로사용 H2-CH-COOH CH2 OH OH + H2O DOPA

15 7-4. 기타 1. Histidine(His 하나뿐 ): hemoglobin에많이함유 - 빈혈치료제, Arg와함께소아의필수아미노산 - C. glutamicum의 analog 내성변이주 (2-TA r, 1,2,4-TA r 이용하여생산 ) (2-TA : 2-thiazole alanine, 1,2,4-TA : 1,2,4-triazole alanine) H2 - CH - COOH CH3 Alanine H2 - CH - COOH CH2 His S Thiazole alanine Triazole alanine 2. Pyruvate 계열 : 산업적으로중요한것없음 3. Serine 계열 : 생산거의무 KU Microbial Biotechnology Laboratory 15

Lehninger Principles of Biochemistry 5/e

David L. Nelson and Michael M. Cox LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY Fifth Edition CHAPTER 18 Amino Acid Oxidation and the Production of Urea 2008 W. H. Freeman and Company Dietary proteins Synthesis