은 diisopropylphosphoro -thrombin (DIP -thrombin ) 껑대한임상병리사회지 : 제 21 권제 1 호 1989 Protein C 의생리작용및구조 지산간호보건전문대학임상병리과 권헌영 혈액응고에관여하는효소원의발견과이들의활성 에대해서는지난 1

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하은 학
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은 diisopropylphosphoro -thrombin (DIP -thrombin ) 껑대한임상병리사회지 : 제 21 권제 1 호 1989 Protein C 의생리작용및구조 지산간호보건전문대학임상병리과 권헌영 혈액응고에관여하는효소원의발견과이들의활성 에대해서는지난 10 년간많은발전을하여서대부분 의효소와효소반응에관여하는조절단백질이정제되

1 은 diisopropylphosphoro -thrombin (DIP -thrombin ) 껑대한임상병리사회지 : 제 21 권제 1 호 1989 Protein C 의생리작용및구조 지산간호보건전문대학임상병리과 권헌영 혈액응고에관여하는효소원의발견과이들의활성 에대해서는지난 10 년간많은발전을하여서대부분 의효소와효소반응에관여하는조절단백질이정제되 고화학적인특성도밝혀졌다. 그후연구의방향은 혈액응고의형성, 응고의개시괴 - 정, 섬유소용해계의 조절기전쪽으로옮겨지게되썼다. 본고찰에서는 혈액응고저해제로알려져있는 protein C 의생리적 작용기전및구조를중심으로판하고자한다. 혈장내에있는혈액응고인자들인 F actor 11, VlI, lx, X 과유사한구조상의특성을 - 갖고있으나이와는 대조적인기능을갖고있는활성화된 protein C 는활성 화된혈액응고인자를불활성화시키므로응고억제 기능을갖고있는응고저해제이다. Protein C 유천자 는제 2 염색체상에존재하며상염색체우성유전형식 을취하는데, 선천적으로결핍된경우에는폐색전증 (pulrnonary em bolism ), 표재정맥혈전증 ( superficial venous thrombosis), 심부정맥펠전증 (deep venous thrombosis) 등을유발하고, 후천적으로는파종성혈관 내응고중후군 (disseminated intravscular coagulation), 만성신부전증으로투석중인환자, 간경변이나 만성간염으로간장기능이저하된환자, warfarin 투여 환자, 임신중의여성이나경구피엽약을복용중인여성 등에서도혈중농도가낮은치렐보이는경우가있 다. 특히선천적으로결핍된경우에는혈중농도가 정상인의 50% 이하를나타내고, heterozygote 한 경우에는사춘기후반이나청장년기에증세가나타나 는것으로알려지고있다 년 Seagers 에의하여 소의혈장에서처음으로검출되어소개된후같은해에 Sweden 에있는 Stenflo 에의해서역시소의혈장에서 처음으로분리하였다. 분리과정에서 4 개의분획을 얻었는데 3 번째분획에서얻어진단백질이항응고 능력이있음을발견하고이단백질을 protein C 라고 명명하였다. 사람의혈장에서는 1979 년에 Kisiel 이 분리하 였으며 1981 년에 Griffin 당에의하여혈전증상 을나타내는선천성 protein C 증이발견되고그후 특성이많이밝혀졌다. Protein C. 는간장에서합성되는 vitamin K 요구성혈장단백질로서혈장내에는 3-5 mg/l 정도함유되어있으며 23% 의당을포함하고 있는데주로 mannose, galactose, glucosamine 과 neurammlc acid 를포함하는당단백질로이루어져 있다. 그구조는분자량이 62, 000 에 2 개의 ch 없 n 으로 구성되어있는데 heavy chain 의분자량이 41,000, light chain 이 21,000 으로밝혀졌고, 이두 polypeptide chain 은 disulfide bond 로연결되어있다. light chain 은소의경우 155 개의아미노산잔기들로되어있으 며, N 말단근처에 10 개의 glutamic acid 들이카르복실 화되어있고, 비타민 K 요구성단백질에서공통적인 현상으로 11 번째와 22 번째 cystine 에의해 disulfide 결합을하고았다. 핵자기공명 spectrophotometer 와 mass spectrometry 를이용하여관찰한결과 71 번째 위치에 1 개의 β-hydroxyaspartic acid 가존재하는 것이확인되었는데이물질은 2 개의부제탄소가있어 erythro 형과 threo 형의구조가존재하나이의기능은 완전히밝혀지지않았다. 이물질은아마 Ca 결합 부위와관련이있을것 S 로보고있다. Heavy chain 은반응성이대단히큰 serine 을함유하고있으며, 사람의경우아미노산서열 14 번째인 arginylisoleucyl 결합부위가 thrombin 에의해서절단되면서활성을 갖는것으로알려졌고, 이때분자량이 41, 000 에서 40, 000 으로감소되는경향을보였다. Protein C: 가혈장 중에는불활성화형인 zymogen 으로순환하고있는데 thrombin 에의하여활성화되나 Ca 이존재하면 활성화가더욱지연되는것으로알려져있다. 이 protein C 의활성화에는 thrombin 외에도 trypsin 이나 Russell sv 뼈 r venom 에의해서도활성화된다. 활성화 된 protein C 의항응고능력은 heavy chain 의아미노 산서열의 14 와 15 사이 (Arg- Ile) 가절단된구조로서 혈액응고인자 Va 와 VIIla 의 polypeptide ch 려 n 을 분해하여이두인자의불활성화결과로웅고가저해 되며이때인지질과 Ca 을필요로하여 0.2.μ~g /1 정도의농도이하에서항응고능력이나타난다. 생체 내에서의활성화는혈관내피셰포표면에있는혈관내 피세포단백질인 thrombomodulin ( 세포의파괴나장애 에의하여혈중으로유리 ) 이라는당단백절로되어 있는 cofactor 단백질과결합하고 thrombin 에의하여 활성이촉진되고있다. 이 throm 벼 modulin 의분자량 은 74,000 정도로알려졌으며, 또한 Ca 의존재하에 thrombin 과 thrombomodulin 이 1:1 의비율로강하게 결합하는것으로알려져있다. 이 thrombom 여 ulin

2 과높은친화력이있는것이밝혀져서 thrombαnod 띠 m 분리에 DIP-thrombin 천화성컬럼을이용하고 있다. thrombin -thrombom 여 ulin 복합체는 protein C 의활성을 20,000 배나증가시키는것으로알려졌다. Thrombin 의활성화에의하여활성화된 protein C 는 분자량이 78,000 정도가되는 single chain 의당단백절 인 proteins (1977 년 DiScipio 와공동연구자들에의하 여처음으로분리되고않 attle 에서연구된뜻을기념 하고자그도시의첫글자를사용 ) 라고불리워지는 형질막인지질에있는 cofactor 와 1:1 로결합하여 웅고인자 Va 와 VIIIa 를분해하여이용고인자를불활 성화한다. 실험결과에의하면활성화된 protein C 200ng 을 0.2ml 의혈장에첨가하기전과후에 kaolin -cephalin clotting time 을측정했을때첨가천에는 45 초였던것이첨가후에는 1200 초만에응고가되었 다. Protein C 의측정법에는면역학적측정법과생물학 적측정법이사용되고있는데생물학적측정법은 protein C의회수율이측정시마다같지않으며분리한 protein C의활성화방법의번잡성이따르는문제가 있어현채에는주로면역학적측정법을이용하고있는 데측정방법에따라 Immunoelectrophoresis 법 (Rocket 볍 ), Radioimmuno assay 법 (RIA 법 ), Immunoradiometric assay 법 (IRMA 볍 ), Enzyme -li~ed immunosorbent as 잃 y 법 (ELISA 법 ) 등이소개되고있으나 각검사마다측정방법상의문제가있어앞으로예민하 고간단한측정법의 J 개발이요구되고있다. Thrombomodulin I IIIIIIUIIII 代젠 r 밟 1 Endothelial cell - S-S L. 함첸. ~~ ~.. 햄 Thrombin Thrombin Thrombomodulin slsll - λååå Protein C Thrombin Thrombomodulin l--다끼a P m -n ; l 1 C Activation of protein C by the thrombin -thrombomodulin -~3-

3 쯤 ~ Activated -Protein S Complex - Activated Protein. C Protein S /ιν.~ζ/,,~, f;. Factor 싫 Factor (, %Va~ 씻 Villa 씻 ι ι~ Proteolysis of factors Va, Vllla Formation of the activated protein C-protein S. Activated Protein C Protein S Factors Va, Vllla 4 Inactive factors Va, Vllla prolonged APTT i Anticoagulant activity Increased plasminogen activator activity Enhanced fibrinolysis Summary of protein C activities -24-

4 Comparison of the Amino acid and Carbohydrated compositions of Human and Bovine Plasma Protein C Components Amino acid Lysine Histidine Arginine Aspartic acid Threonine Serine Glutamic acid Proline Glycine Alanine Half -cystirie Valine Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine Tryptophan Carbohydrate Galactose Mannose N -Acetylglucosamine N -Acetylneuraminic acid Protein, % Carbohydrate, % Composition expressed as residues / 62,000g glycoprotein. Human Bovine References Baker, M.E., French, F.S., and ]oseph, D.R Vitamin K-dependent Protein S is similar to rat androgen -binding protein. Biochem. ] 243: Comp, P.C. et al Activation of protein C in Vivo. ]. Clin. Invest. 70: Comp, P.C., Nixon, R.R., and Esmon, C.T Determination of Functional Levels of Protein C, an Antithrombotic Protein, Using Thrombin Thrombomodulin Complex. Blαxi 63: Denver, a Reactive Site Variant. J. Biol. Chem. 262: Eguchi, Y., and matsuda, MM Congenital Deficiency and.molecular Abnormality of Protein C. ]ap. Clin. Path. 35 : Esmon, C. T. and Esmon, N. L Protein C Activation. Seminars in Thrombosis and hemostasis 10: Freyssinet, J. M., Gauchy, J. and Cazenave, J. P The effect of phospholipids on the activation -25-

5 of protein C by the human thrombin thrombomodu1in comp1ex. Biochem. J. 238: Griffin, J. H., et al Deficiency of Protein C in congenita1 Griffin, J. H. et al Protein C, an Antithrombotic protein, Is Reduc 어 in Hospita1ized Patients With Intravascu1ar Coagu1ation. B1ood. 60: Ikeda, K The Diagnosis of Protein C deficiency. Jap. C1in. Path. 36: Kisie1, W., et al Anticoagu1ant Pro 야 rties of Bovine P1asma Protein C following Activation by Thrombin. Biqchemistry 16:~) Kisie1, W Human P1asma Protein C. J. Clin. Invvest. 64: La Croix, K.A A review of Protein C and its Ro1e in Hemostasis J. Med. Tech. 2: Preissner, K. T., Zwicker, L, and Berghaus, G.M Formation, characterization anddetection of a ternary comp1ex between S protein, thrombin and antithrombin III in serum Biochem. J. 243: Smith, J. W., and D. J. Knauer A Heparin Binding Site in Antithrombin III. J. Biol. Chem. 262: Stenflo, J Structure "and Function of Protein C. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 10: Stephens, A. W., B. S. Thalley, and C. H. Hirs Antithrombin-III Thrombotic Di 않 ase. J. Clin. Invest. 68: Straight, D. L The Physio1ogic Inhibitors of B1 d Coagu1ation and Fibrino1ysis. J. Med. Tech. 3:8: Suzuki, K Congenita1 Protein S deficiency in a Japanese Fami1y with Recurrent Venous Thrombosis. Jap. C1in Path. 35: Wakabayashi, K., Sakata,Y., and Aoki,N Conformation s 야 cific Monoc1ona1 Antib 여 ies to the Calcium-induced Structure of Protein C. J. Biol. Chem. 261:

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