응용자료 바이오리액터세포배양모니터링을위한유도체화하지않은아미노산의 LC/MS 분석 저자 Jordy Hsiao, Te-Wei Chu, Andrew Kennedy, Adam Bivens, Anne Blackwell 개요 이응용자료는발효배지내아미노산의 LC/MS 분석을위한솔루

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온조 엽
4 years ago
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1 응용자료 바이오리액터세포배양모니터링을위한유도체화하지않은아미노산의 LC/MS 분석 저자 Jordy Hsiao, Te-Wei Chu, Andrew Kennedy, Adam Bivens, Anne Blackwell 개요 이응용자료는발효배지내아미노산의 LC/MS 분석을위한솔루션을제시합니다. 아미노산의극성은역상액체크로마토그래피로의분석을어렵게만들며, 때문에종종머무름시간의향상을위해유도체화방법이사용됩니다. 그러나, 친수성상호작용크로마토그래피 (HILIC) 를이용하면기존의역상작업과비슷한워크플로를제공하면서도유도체화없이복잡한아미노산혼합물을머무르게하며분리할수있습니다. HILIC 와질량분석의조합은유도체화하지않은아미노산분석을위한간단하면서도강력한솔루션입니다.

2 소개 바이오리액터와발효기내에서발견되는넓은범위의극성화합물을모니터링하는것은친수성상호작용크로마토그래피 (HILIC) 에서실제적으로적용하기까다로운작업입니다. 높은 ph 조건과음이온모드의 LC/MS 검출을활용해아미노산, 공급원료, 폐기물을하나의분석을통해모니터링할수있습니다. 애질런트 AdvanceBio MS Spent Media 케미스트리의높은 ph 안정성은혼합물분리에이상적입니다. 까다로운배지에도불구하고주입간우수한재현성이나타났습니다. 중공섬유및회전용기리액터테스트에서는글루코스와아미노산소모및배양된세포의젖산분비가나타났습니다. 실험 시약및화학물질모든시약은 HPLC 등급이상입니다. Ultra LC/MS 등급아세토니트릴은 J.T. Baker(Center Valley, PA, USA) 에서구입했으며, 물은 EMD Millipore Milli-Q Integral System (Darmstadt, Germany) 을이용해얻었습니다. 시약등급 Formic acid(fa, p/n G5-85) 는애질런트테크놀로지스의제품입니다. Ammonium formate, ammonium acetate, ammonium hydroxide, amino acid standard는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 에서구입한제품입니다. DMEM 배지는 Thermo Scientific(Waltham, MA, USA) 에서구입했습니다. 아미노산은사용할때까지 7 C에서보관합니다. 장비및재료 애질런트 InfinityLab 피팅 컬럼전면 : 애질런트 Quick Connect(p/n ) 컬럼후면 : 애질런트 Quick Turn(p/n 57-59) Agilent Vial, screw top, amber, write-on spot, certified, ml, /pk. (p/n 58-7) Agilent bonded screw cap, PTFE/red silicone septa(p/n 59-7) Agilent vial insert, 5µL, deactivated glass with polymer feet(p/n ) Eppendorf pipettes and repeater 초원심분리기 (VWR, Radnor, PA, USA) 볼텍서및멀티튜브볼텍서 (VWR, Radnor, PA, USA) HDPE 용매병 (VWR, Radnor, PA, USA) 회전용기바이오리액터 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 중공섬유바이오리액터 (FiberCell Systems, New Market, MD, USA) 기기 Agilent 9 Infinity II binary 펌프 (G7A) Agilent 9 Infinity II Vialsampler(G79B) Agilent 9 Infinity II Multicolumn Thermostat(G7B) Ultra-low dispersion kit for Agilent 9 Infinity LC Series(57-589) Agilent 55 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) 질량분석기 애질런트 Jet Stream 이온화소스 소프트웨어애질런트 MassHunter 워크스테이션소프트웨어 B.8. 시료전처리세포배양시료는 5% ACN을이용해 :로희석된후, x g 에서 분간원심분리하였습니다. 상등액을얻어서더이상의시료전처리없이주입되었습니다. 이동상물로 mm ammonium acetate 저장액을만든후, ammonium hydroxide를이용해 ph 9로조절하였습니다. 이동상 A는저장액을물과 9:로희석해만들어졌습니다. 이동상 B는저장액을 ACN과 9:로희석해만들어졌습니다. 두이동상의최종농도는모두 mm ammonium acetate입니다. 이동상을오랫동안유리재질의용기에노출시키면이온유입으로인해 MS 검출이억제및방해되는것으로알려져있습니다. 유리에보관된이동상은주기적으로교체하거나, HDPE 용기로옮겨야합니다.

3 기기조건 컬럼 이동상 A 이동상 B HPLC 조건 Agilent AdvanceBio MS Spent Media,. 5mm (p/n ) % (mm ammonium acetate in water at ph = 9)/ 9 % water % (mm ammonium acetate in water at ph = 9)/ 9 % acetonitrile Time (min) %B 9 9 이동상변화도 유속.5mL/min 컬럼온도 C 주입부피 µl 총분석시간 5min MS 조건 이온화모드 ESI Negative 가스온도 C 가스유속 L/min Nebulizer psi Sheath 가스온도 C Sheath 가스유속 L/min 캐필러리전압,V 노즐전압 V Fragmentor 전압 5V Skimmer 전압 5V Oct RF Vpp 75V 수집파라미터 데이터는 GHz의확장된동적범위에서수집 MS 질량범위는 5,m/z 바이오리액터조건 파라미터 바이오리액터유형 세포주 배양배지 온도 C 값 회전형용기바이오리액터중공섬유바이오리액터 중국햄스터난소 (CHO) 세포 DMEM 성장배지 표. 세포배양배지의조성 (DMEM 성장배지 ) 성분 농도 (mg/l) Glycine. L-Arginine hydrochloride 8. L-Cystine HCl. L-Glutamine 58. L-Histidine hydrochloride-h O. L-Isoleucine 5. L-Leucine 5. L-Lysine hydrochloride. L-Methionine. L-Phenylalanine. L-Serine. L-Threonine 95. L-Tryptophan. L-Tyrosine disodium salt dihydrate. L-Valine 9. Choline chloride. D-Calcium pantothenate. Folic acid. Niacinamide. Pyridoxine hydrochloride. Riboflavin. Thiamine hydrochloride. i-inositol 7. Calcium chloride (CaCl )( 무수물 ). Ferric nitrate (Fe(NO ) *9H O). Magnesium sulfate (MgSO )( 무수물 ) 97.7 Potassium chloride (KCl). Sodium bicarbonate (NaHCO ),7. Sodium chloride (NaCl),. Sodium phosphate monobasic (NaH PO *H O) 5. D-Glucose (Dextrose),5. Phenol red 5. Sodium pyruvate.

4 결과 Phenylalanine (.7)...8 Leucine/isoleucine (.87) 5 Tryptophan (.8) Methionine (8.) Tyrosine (8.) Valine (.77) 5 Glycine (7.7) Threonine (8.5) Glutamine (5.8) Serine (.5) Histidine (5.) Arginine (7.) Lysine 5 (5.98).5..5 st Run nd Run rd Run 그림. 재현성테스트 Phenylalanine (.7)...8 Leucine/isoleucine (.87) 5... Tryptophan (.8) Methionine (8.)...8 Tyrosine (8.) Valine (.77) Glycine (7.7) Threonine Glutamine Serine Histidine (8.5) (5.8) 5 (.5) (5.) Arginine (7.) Lysine (5.98).5..5 대조군 ( 성장배지 ) 중공섬유바이오리액터 (일후수집 ) 회전형용기배양 (주후수집 ) 그림. 세포배양배지분석, 아미노산소모가나타남. 중공섬유바이오리액터내에서성장배지에 mm 의글루타민보충, 이로인해대조군성장배지와영양다소비된회전형용기바이오리액터에비해글루타민농도가높게나타남 α-d-glucose/β-d-glucose (79.5) 7 Lactate (89.) 대조군 ( 성장배지 ) 중공섬유바이오리액터 (일후수집 ) 회전형용기배양 (주후수집 ) 그림. 세포배양배지분석, 글루코스소모및젖산분비가나타남

5 표. 각분석성분의세포배양배지머무름시간및우세이온 모니터링대상분석성분 머무름시간 ( 분 ) Precursor ion(m/z) Phenylalanine.55.7 Lactate Leucine Tryptophan.98.8 Isoleucine.5.87 Methionine.5 8. D-glucose (alpha) Tyrosine.9 8. D-glucose (beta) Valine Glycine Threonine Glutamine.7 5. Serine.7. Histidine Arginine.5 7. Lysine 결론 소모배지내아미노산은음이온모드의 HILIC-MS 로성공적으로분석되었습니다. 보통분석이까다로운류신 / 이소류신동중체는. 의분리능으로베이스라인까지분리되었습니다. 아미노산은쌍성이온으로서음이온및양이온모드에서모두바로이온화되나, 높은 ph 음이온모드에서는세포배지, 공급원료, 세포폐기물을동시에모니터링할수있습니다. 5

6 이정보는사전고지없이변경될수있습니다. Agilent Technologies, Inc. 8 8 년 월 9 일한국에서인쇄 KO 서울시용산구한남대로 98, 일신빌딩 층우 )8 한국애질런트테크놀로지스 ( 주 ) 생명과학 / 화학분석사업부고객지원센터

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