예를들어, Heavy chain 및 Light chain 또는 Fab 및 Fc 의분석에넓은 pore 을가진컬럼을사용할수있습니다. 매우큰분자 (150 kda) 의분석에는 AdvanceBio RP-mAb 를권장합니다. UHPLC 또는최고의분리능이필요한응용작업의경우, ZOR

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AGILENT ADVANCEBIO 역상컬럼을사용하여생체분자특성규명개선 백서 권장컬럼 : AdvanceBio RP-mAb UHPLC 용 ZORBAX RRHD 300Å Poroshell 300 ZORBAX 300Å 권장컬럼 : AdvanceBio RP-mAb UHPLC 용 ZORBAX RRHD 300Å Poroshell 300 ZORBAX 300Å

이두기법모두가수용성용리액및비변성조건을이용합니다. 그러나, 단백질의완전특성규명의일부로서, 기본아미노산서열과더불어제조단계의정제또는제제과정에발생할수있는서열에대한번역후변형 (post-translational modifications) 을확인할필요도있습니다. 이러한유형의분석을수행하기위해서는변성조건이필요하며따라서역상 HPLC 가일반적인기법으로선택됩니다.

Intact 단일클론항체및큰조각분리를위해 AdvanceBio RP-mAb 에서 Agilent Poroshell 기술의사용은확산거리감소로인해속도와분리능에큰이점을제공하므로고유한이점이있습니다. 최신결합상케미스트리의도입과함께 RP 분리는또다른선택성을제공할수있으며그중일부는단백질에높은감도를가질수있습니다.

1 AGILENT ADVANCEBIO 역상컬럼을사용하여생체분자특성규명개선 백서 권장컬럼 : AdvanceBio RP-mAb UHPLC 용 ZORBAX RRHD 300Å Poroshell 300 ZORBAX 300Å 권장컬럼 : AdvanceBio RP-mAb UHPLC 용 ZORBAX RRHD 300Å Poroshell 300 ZORBAX 300Å 펩타이드매핑을위해권장컬럼 : AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼 그림 1. Intact 단백질부터분해된단백질까지 왜역상인가? 단백질바이오의약품은매우불균일하므로유효성분 (API) 을완전히특성규명하려면많은크로마토그래피기법이필요할수있습니다. 적합한분석법에는다이머와응집체의정량을위한크기배제크로마토그래피및전하변이체의식별을위한이온교환이있습니다. 이두기법모두가수용성용리액및비변성조건을이용합니다. 그러나, 단백질의완전특성규명의일부로서, 기본아미노산서열과더불어제조단계의정제또는제제과정에발생할수있는서열에대한번역후변형 (post-translational modifications) 을확인할필요도있습니다. 이러한유형의분석을수행하기위해서는변성조건이필요하며따라서역상 HPLC 가일반적인기법으로선택됩니다. 역상 (RP) 은바이오크로마토그래피에사용되는세가지주요기법중하나이며, LC/MS 검출과의호환성때문에특히유용합니다. 그리고 Agilent ZORBAX RRHD 300Å, 1.8µm 컬럼에서확인된바와같이향상된작은입자기술때문에많은바이오의약품응용분석에서 RP 가매력적인선택입니다. Intact 단일클론항체및큰조각분리를위해 AdvanceBio RP-mAb 에서 Agilent Poroshell 기술의사용은확산거리감소로인해속도와분리능에큰이점을제공하므로고유한이점이있습니다. 최신결합상케미스트리의도입과함께 RP 분리는또다른선택성을제공할수있으며그중일부는단백질에높은감도를가질수있습니다. 예를들어, AdvanceBio RP-mAb 및 ZORBAX RRHD 300Å 1.8µm 컬럼의고유한 Diphenyl 상은다른케미스트리에서볼수없는작은미세한디테일을분리합니다. 역상크로마토그래피의이점중하나는서로다른단백질단계의분석에적용할수있는다양성입니다. 그림 1 은 intact mab 부터펩타이드 mab 조각까지 mab 의완전한특성규명을위한일부단계를보여줍니다. 특성규명은 intact 단백질로시작하여, 계속해서환원, 알킬화및분리를수행합니다. 큰 pore 의역상컬럼은첫두단계에적절하며작은 pore 의컬럼은분리된단백질의분석에가장적합합니다. 서로다른결합상, 컬럼사양및크로마토그래피조건을이용하여서로다른선택성을얻을수있습니다.

2 예를들어, Heavy chain 및 Light chain 또는 Fab 및 Fc 의분석에넓은 pore 을가진컬럼을사용할수있습니다. 매우큰분자 (150 kda) 의분석에는 AdvanceBio RP-mAb 를권장합니다. UHPLC 또는최고의분리능이필요한응용작업의경우, ZORBAX RRHD 300Å, 1.8µm 컬럼을사용하는것이더좋을수있습니다. 단백질분리의최종단계는효소분리로서작은펩타이드조각을생성합니다. 그런다음 Agilent AdvanceBio 펩타이드매핑컬럼에서처럼펩타이드매핑이 120Å 의 pore 크기를이용해수행됩니다. 이간단한개요가단백질특성규명과정의시작이라면, 모든단백질분석의시작점인시료전처리는어떨까요? 더효과적인바이오크로마토그래피를위한시료전처리 시료전처리는바이오크로마토그래피에서정확하고재현가능하며의미있는결과를얻기위한중요한단계입니다. 생물학적세포나유기체로부터분리된단백질에는자연적으로존재하는케라틴, 알부민, 혈청단백질, 핵산, 지질, 탄수화물및다당류와같은오염물질이포함되어있습니다. 게다가, 효소또는생물학적활성을유지하기위해다양한무기염, 버퍼, 환원제, 계면활성제, detergent 및방부제등도시료에추가될수있습니다. 이러한물질은질량분석법에의한검출및 / 또는정량과같이액체크로마토그래피기법의성능에영향을미치므로성공적인결과를얻기위해서는반드시제거해야합니다. 단백질은여러형태로존재하며서로다른세포위치 ( 예 : 세포막이나세포질 ) 에서발견되고다양한용해도를가지기때문에모든단백질을분리하기위한범용시료 전처리절차는없습니다. 일반적인단백질시료전처리과정에는탈염, 농축, 원심분리, 친화성, 투석, 여과및초미세여과, 침전및동결, 건조등이포함됩니다. 등전점, 분자량, 형태, 용해도및소수성과같은단백질의독특한특징으로인해이정제를설계하게되었습니다. 단백질은매우약하기때문에, 시료전처리과정에서형태및생물학적활성을변화시키는원치않는변형이생기지않도록주의를기울여야합니다. 바이오크로마토그래피시료전처리분석법은검출기, 기기및기타요소를기준으로시료의유형과필요한분리의종류에영향을받습니다. 표 1 은시료전처리분석법을선택할때주요옵션들을보여줍니다. 이러한방법은상호배타적이아니므로, 오염된시료로부터입자를제거하기위해시린지프리필터를사용하고이어서인지질을제거하고이온억제를방지하기위해 Captiva ND Lipids 플레이트나튜브를사용할수있습니다. 2

3 표 1. 바이오크로마토그래피를위한시료전처리옵션 시료시료전처리장치참고참고문헌 고농도단백질 탈염높은입자로드시료단백질분석, 생체분자, 버퍼 마이크로부피의 SPE 용해물여과 지질제거를통한용해물 (lysate) 여과 Agilent Multiple Affinity Removal System mrp-c18 Captiva 프리미엄시린지필터유리섬유 / 나일론 Captiva 프리미엄시린지필터 PES OMIX Captiva ND 플레이트또는튜브 Captiva ND Lipids 플레이트또는튜브 혈청, 플라즈마등생물학적시료로부터얻을수있는매우가치있는저농도단백질과바이오마커의식별및특성규명이가능합니다. MARS는인간의체액에서발견된최대 14개의고농도단백질과쥐의체액에서발견된 3개의고농도단백질을다양한 LC 컬럼사양및 spin 카트리지형태의제품으로재현성있게특이적으로제거할수있습니다. 애질런트의최적화된버퍼, 편리한 spin 필터및농축기와함께사용하는경우 MARS는대부분의 LC 기기 ( 컬럼 ) 및벤치탑원심분리기 (spin 카트리지 ) 와호환되는자동화된통합제거솔루션을생성합니다. MARS를이용해제거된시료는 2-D 겔전기영동, LC/MS 및기타분석기법을이용한후속분석을위한준비가된상태입니다. Agilent mrp-c18 컬럼은 MARS를이용해고농도단백질을제거한후인간혈청에대한최적화된탈염및농축효과를제공합니다. 이렇게조합된워크플로를통해바이오마커연구에서추가적인후속처리를위한높은회수율을제공할수있습니다. 추가적으로, 분자량차단 (MWCO) 기술로 spin 농축단계를생략하고 5kDa 미만의펩타이드와폴리펩타이드를안전하게회수할수있습니다. 이기술을결합하면 mrp-c18 컬럼에의해제거가능한염또는기타첨가제로인한방해없이직교분리가가능합니다. 유리섬유는입자를막을막기전에수집하는프리필터처럼작용하여, PTFE가시료로부터입자를효율적으로여과할수있습니다. PES는극히낮은단백질결합특성때문에권장됩니다. PES는소수성막이며추출가능성이매우낮습니다. PES는수용액및일부유기용액과호환됩니다. OMIX 피펫팁은 MALDI-TOF 또는 LC/MS/MS 이전에펩타이드및단백질을 femtomole 및 picomole 수준으로확실하게정제하고농축합니다. OMIX에사용된고유한 monolithic 흡착제기술은일정한유속과강한분석물질-표면상호작용을일관되게제공합니다. OMIX의높은결합능력은높은생산성을제공합니다. 10µL 팁은최대 8µg의펩타이드를결합합니다. OMIX의우수한유속및탁월한결합능력으로펩타이드를확실하게회수하고, 다중분취, 다중팁및증발단계에서펩타이드손실을최소화합니다. 고처리량의자동 in-well 단백질침전을위해고안된사용이간편한여과장치. 고유한흘림방지 (ND) 막으로구성된 Captiva ND 플레이트에서메탄올이나아세토니트릴을이용한용매우선단백질침전이가능합니다. Captiva 의고유한듀얼필터디자인은시료손실및필터막힘을방지하면서균일화하고빠른유속을제공합니다. 플라즈마의 LC/MS 바이오분석을위해특별히설계된 Captiva ND Lipids 는 Captiva ND 의사용이쉽고우수한유속속성과고유한화학적필터를결합한것입니다. 이플레이트는침전된플라즈마시료로인한이온억제인지질, 단백질및계면활성제간섭을효율적으로제거합니다. Agilent HPLC 컬럼선택가이드 응용자료 EN 응용자료 EN 응용자료 EN 응용자료 EN 응용자료 EN 응용자료 EN 3

4 의약품발굴 (Drug discovery) 의약품발굴응용분야에서는질량분석법 (MS) 을다양하게사용할수있도록최고수준의감도와분리능이요구되며역상분리가이상적입니다. MS 의높은감도는 mabs 및기타재조합단백질의특성규명과복합펩타이드분해물의식별에유용합니다. MS 는펩타이드식별및번역후변형 (post translational modifications) 에대한정보를제공합니다. 의약품발굴성공을위한팁 분리에적합한 pore 크기선택실리카의 pore 크기는바이오크로마토그래피를위한역상컬럼의매우중요한파라미터입니다. 5,000Da 미만의분자량을가진분자의경우 90 ~ 150Å의작은 pore 크기를가진컬럼이일반적으로선택됩니다 ( 바이오응용분야의경우 60Å pore 크기의 컬럼을사용하지마십시오 ). 200 ~ 300Å 의 pore 크기는일반적으로저분자량단백질 (5 ~ 150kDa) 에사용됩니다. 단일클론항체는약 150kDa 이므로, 1000 ~ 4000Å 같이 300Å, 450Å 및그이상 pore 크기의컬럼은 RP 분리에적합합니다. 가장큰실리카 pore 크기는 450Å 입니다. 폴리머 PLRP-S 는매우높은분자량의단백질과백신용으로 1000 및 4000Å 의 pore 크기에이용할수있습니다. 분자량이약 5,800Da 인인슐린과같은작은단백질은작은 pore 크기로분석할수있지만더큰 pore 크기를검토해야합니다. 적절한 pore 크기를선택하면효율을극대화할수있습니다. Pore 크기와분자량이너무작으면 pore 사이에확산이제한됩니다. 높은효율은적절한 pore 크기에서얻어집니다. 효율을극대화하기위해, 최적의 pore 크기에작은입자크기를선택해야합니다. AdvanceBio 펩타이드매핑컬럼에서쓰이는 120Å 와같이작은 pore 크기를가진컬럼이대개펩타이드에최적으로고려됩니다. 폴리펩타이드, 단백질조각및 intact 단백질의경우 300Å 이상의 pore 이더적합합니다. 그림 4 는 300Å pore 크기를가진컬럼에대비하여 <100Å pore 크기를가진컬럼에서얻은결과를비교할때인슐린의분리효율이두배이상임을보여줍니다. 피크모양도 pore 크기가가장작은컬럼 (ZORBAX SB-C18) 과가장큰컬럼 (ZORBAX 300SB-C18) 사이에크게개선되었습니다. 이두개의컬럼은 pore 크기만다르며, 결합유형및컬럼의입자크기는동일합니다. 이는 pore 크기의영향을비교적으로더정확하게보여주며, 인슐린의가장효율적인분리를위해서는 80Å 이상의 pore 크기가필요함을나타냅니다. 그림 4. Agilent ZORBAX mm, 5µm LC 컬럼에서인슐린분리의크로마토그램, 분리효율에대한 pore 크기의영향을보여줍니다. 4

5 분리능개선을위해작은입자크기를가진컬럼선택 작은입자는더뾰족한피크와더높은분리능을가능하게합니다. 더빠른유속에가파른기울기를적용하여 intact mab 를분석한그림 5 에서 1.8µm ZORBAX 300SB-C8 컬럼은더높은분리능, 개선된피크모양그리고거의두배의감도를제공합니다. 감도개선을위해좁은내경의컬럼선택더좁은 ID 컬럼은더뾰족한밴드를얻을수있으며, 컬럼외적인영향을제어할경우, 더높은감도와 MS와의호환성을얻을수있습니다. MS, UHPLC 또는둘모두를이용하는분석가들은최적의결과를위해 2.1mm ID 컬럼을선호합니다. 분리개선을위한이온쌍시약조절단백질및펩타이드분석을위한 RPLC에사용된이동상은이온쌍시약으로작용하는첨가제가들어있습니다. 이러한성분은하전된그룹과이온쌍을형성하여분자의소수성을증가시킵니다. 결과적으로, 소수성고정상과분자간의상호작용이가능하며따라서분리도가능합니다. 트리플루오로아세트산 (TFA), 포름산 (FA) 및아세트산 (AcOH) 과같이더일반적인첨가제는매우낮은 ph를생성할수있으며, 단백질언폴딩및변성을촉진할수있습니다. 따라서분자가더뾰족하고더대칭적인피크로용출됩니다. 단백질및펩타이드의분리에가장널리사용되는이온쌍시약은 TFA이지만, ESI LC/MS를사용할경우 TFA는분석법의신호와극미량감도를감소시킵니다. 이로인해분석법의활용도가제한되며, 작은피크를식별하기더어렵게만들수있습니다. TFA를적게사용하면신호를개선하는데도움이될수있지만 ESI LC/MS 분석에는 TFA 대신 FA와 AcOH를사용할수도있습니다. 분석조건컬럼 : Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, mm, 1.8µm(p/n ) Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, mm, 3.5µm(p/n ) 용리액 : A: H 2 O:IPA(98:2) + 0.1% TFA(v/v) B: IPA:ACN:H 2 O(70:20:10) + 0.1% TFA(v/v) 주입량 : 1µL(2mg/mL) 유속 : 1mL/ 분이동상변화도 : 다중분할및선형용출시간 ( 분 ) % B 온도 : 80 C 검출기 : UV, 225nm 시스템 : 자동주입기, Binary 펌프, 항온컬럼격실및다이오드어레이검출기를가진 Agilent 1290 Infinity LC 시스템 그림 5. Intact mab 의분리, 1.8µm(A) 및 3.5µm(B) Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, mm LC 컬럼의비교. 1.8µm 컬럼에서얻은크로마토그램은향상된피크모양 (A), 분리능및감도를보여줍니다. 5

6 당사는 LC/MS 분석을위한기존 ACN/TFA 전용시스템의대안으로더높은신호세기를제공하기위해다양한이온쌍첨가제와유기이동상 B 의여러조합을평가했습니다. 이온쌍시약의농도는 0.5% ~ 5% 사이로조정되었으며, B 이동상에는 ACN, 1- 프로판올및이소프로판올또는그조합이포함되었습니다. 그림 6 은이연구에서얻은최적의분리결과를보여줍니다. 정의된기울기조건에서, 5 분이내에각분리를완료할수있는빠른분석을위해 Light 와 2 개의 Heavy chain 변이체의분리가완전히최적화되었습니다. 위그림의분리는 0.05% 의 TFA 에 0.5% AcOH 를추가하여최적화되었습니다. 아래그림은 0.05% 의 TFA 와 0.05% FA 가추가된일반적인물 /ACN 기울기로부터분리되었습니다. 이분리에서, 2 개의 Heavy chain 변이체는위의그림과동일하지않은선택성을보여주며, HC1 및 HC2 의머무름위치가바뀌었습니다. 그림 6 의경우동일한기울기와이동상조성을사용하지만 FA 를사용하지않으면 HC1 및 HC2 사이에충분한분리능을제공하지못함을확인했습니다. 각분리에대해 FA 또는 AcOH 에 TFA 양을줄인조건은 mab 의초고속분석에매우적합하며, LC/MS 분석을위한대체프로필을제시합니다. mau 조건, 그림 6A 용리액 : A: H 2 O + 0.5% AcOH:0.05% TFA(v/v) B: n- 프로판올 :ACN:H 2 0(80:10:10) + 0.5% AcOH:0.05% TFA(v/v) 이동상변화도 : 시간 ( 분 ) % B 조건, 그림 6B 용리액 : A: H 2 O % FA:0.05% TFA(v/v) B: n-프로판올 :ACN:H 2 0(80:10:10) % FA:0.05% TFA(v/v) 이동상변화도 : 시간 ( 분 ) % B 그림 6. Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, mm 컬럼을사용하여환원및알킬화항체의초고속 LC/MS 특성규명을위한 MS- 친화적인이동상조성. 위그림 (A) 의분리에서, MS 신호세기를높이기위해아세트산이용리액에추가되었습니다. 아래그림 (B) 은더일반적으로사용되는물 : 아세토니트릴이동상으로실시되었지만, 신호억제를줄이기위해 TFA 의양을줄이고포름산을추가했습니다. 6

7 넓은 pore 의표면다공성입자에기초한컬럼사용 큰분자는작은분자보다훨씬더느리게확산되므로, 단백질이 pore 을충분히들어오고나갈수있도록단백질분리를위한일반적인유속은더낮습니다. 따라서단백질이동에대해더짧은확산경로를가진컬럼이훨씬더적합합니다. Agilent AdvanceBio RP-mAb 컬럼은표면다공성입자구조때문에이렇게짧은확산거리를제공하며, 더높은유속에서추가적인밴드효과없이더가파른기울기로사용할수있습니다. 그림 7 은 Poroshell 기술을사용하여빠른고분리능 mab 조각분석을완료할수있는방법과입자의다공성이분리품질에영향을미치는방법에대한적절한예입니다. 또는, 더짧은컬럼길이에서 sub-2µm 입자는우수한분리능을제공하면서짧은실행시간동안에높은감도와적은밴드넓어짐을얻기위해매력적인선택입니다. 그림 7. Agilent AdvanceBio RP-mAb 컬럼은추가적인밴드효과없이짧은확산거리와가파른기울기제공 Agilent Rapid Resolution High Definition(RRHD) sub-2µm 컬럼은매우짧은실행시간동안에단백질의빠른분리를수행하기위해최적화되었습니다. Intact 단일클론항체를사용하여, 다양한컬럼유속에서분리속도와 mab 분리에대한이어지는분리능효과를평가하기위해체계적인기울기최적화가수행되었습니다. 7

8 그런다음빠른 mab 프로파일링을위한분리효율을강조해서보여주기위해두개의기울기가선택되었습니다. 특별히, 그림 8( 위크로마토그램 ) 의기울기는 7 분의빠른실행시간동안에 intact mab 와어깨피크의초고분리능을강조해서나타내기위해최적화되었으며, 높은감도와약간낮은분리능으로 2.0 분이내에초고속분리를강조해서보여주기위해그림 8 아래크로마토그램의기울기가선택되었습니다. 두분리는우수한결과를제공하며바이오의약품프로파일링을위해바람직한 mab 분리의여러요소를강조해서보여줍니다. 표 2. 분리능또는속도를위해최적화된기울기 최적화된분리능을위한기울기 A 고속분석을위한기울기 B 시간 ( 분 ) %B 시간 ( 분 ) %B 분석조건컬럼 : Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 1.8µm, mm(p/n ) 용리액 : A: H 2 O:IPA(98:2) + 0.1% TFA(v/v) B: IPA:ACN:H 2 O(70:20:10) + 0.1% TFA(v/v) 주입량 : 1µL(2mg/mL) 유속 : 0.5 또는 1mL/ 분이동상변화도 : 다중분할및선형용출온도 : 80 C 검출기 : UV, 225nm 시스템 : 자동주입기, Binary 펌프, 항온컬럼격실및다이오드어레이검출기를가진 Agilent 1290 Infinity LC 시스템 그림 8. Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 1.8µm 컬럼에서 intact mab 의최적화된기울기분리를보여주는두개의크로마토그래피비교. 위크로마토그램은더긴실행시간에느린유속으로획득한초고분리능을보여주는반면, 아래크로마토그램은확대보기를통해, mab 스크리닝에유용한매우빠른분석시간 ( 표 2 참조 ) 에충분한분리능을통해향상된감도를보여줍니다. 8

9 전체시퀀스를커버리지가능한컬럼및분석법의조건확보 펩타이드맵의완전한분리를위해, 컬럼은몇가지주요한속성을가져야합니다. 펩타이드의분자량에대한최적의 pore 크기 120Å 이이상적입니다. 펩타이드매핑조각을분리하기에적절한선택성을가진상을이용합니다. 이를통해 MS 로식별할수있습니다. 엔드캡핑되는조밀한 C18- 결합상은소수성, 친수성및염기성펩타이드에우수한머무름과선택성을제공합니다. 고분리능으로빠른분리를수행할수있는컬럼이여야합니다. Agilent AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼은펩타이드매핑을위한분리를개선하고향상된분리능, 높은감도및에리스로포이에틴 (rhepo) 매핑및향상된글리코펩타이드마이닝과같은고효율펩타이드프로파일링에필요한높은선택성을제공하기위해특별히설계되었습니다. 게다가, 2.7µm 표면다공성입자를통해높은유속에서 mm 의더긴컬럼을사용할수있으므로, sub-2µm 컬럼에비해매우작은역압 (backpressure) 에서 rhepo 의더높은분리성능을제공합니다. 그림 9 는최적화된 EPO 펩타이드맵의예입니다. 분리는전체기울기프로필에걸쳐우수한분리능, 선택성및피크모양을보여주므로, ESI-MS 분석에매우적합하며 100% 의시퀀스커버리지를제공합니다 ( 그림 10). 분석조건 컬럼 : AdvanceBio Peptide Mapping, mm, 2.7µm(p/n ) 시료 : 분해된재조합인간화 EPO 시료농도 : 2.0mg/mL 용리액 : A: 물 (0.1% FA) B: ACN(0.08% FA), 0 ~ 28분, 3 ~ 45% B; 28 ~ 33분, 45 ~ 60% B; 33 ~ 34분, 60 ~ 95% B 주입량 : 5µL 유속 : 0.4mL/ 분 온도 : 55 C 검출기 : UV, 220nm 그림 mm Agilent 2.7µm AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼을이용한역상 rhepo 펩타이드맵 그림 mm AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼및 ESI-MS 를이용해달성한 100% rhepo 시퀀스커버리지. 데이터는 Agilent Masshunter 정성 MS 분석소프트웨어에서 Molecular Feature Extractor(MFE) 를이용해생성되었습니다. 9

10 의약품개발 (Drug development) 단백질의정제및특성규명은의약품개발에매우중요하며, 일상적으로다양한분석기법이사용됩니다. 특성규명에서얻는많은정보와더불어개발단계중재현성및컬럼수명이더중하게되었습니다. mabs 의소수성구조의 Heterogeneity 때문에, 역상분리는의약품의제조, 제제및보관중순도와안정성을모니터링하기위한하나의옵션이되고있습니다. Agilent ZORBAX RRHD 컬럼은더작은 1.8µm 의입자, 재현성있는성능및선택성옵션을가지므로, 역상분석중에 mab 불순물의특성규명에빠른분석시간과함께확실한분리성능을보여줍니다. LC/UV 는 mabs 및펩타이드매핑을위해우수한선택입니다. 의약품개발성공을위한팁 컬럼온도를높여서피크모양성능을개선하고, 머무름을감소시키고, 감도를개선시킬수있습니다. 용매점도, 단백질확산계수및이동상극성도는온도에크게좌우됩니다. 컬럼온도의조절은소수성펩타이드및단백질분리에중요한변수입니다. 그림 11에나오는단일클론항체 (mab) 분리는온도가증가할때피크모양과머무름에대한온도의영향을보여주는좋은예입니다. 낮은온도에서 mab와 mab 조각은좋지않은피크모양을보여주므로충분한프로필을제공하기 위해높은비율의유기이동상으로용출시키기도합니다. 또는동일한크로마토그래피조건이지만높은 온도에서는분리는짧은용출시간동안우수한피크모양을제공하며, 감도와분리능을향상시킵니다. 그림 11. Agilent AdvanceBio RP-mAb 컬럼에서 intact 단일클론항체분리의온도의존성능. 위 ) 컬럼온도증가에따라피크모양이개선되고머무름시간이단축됩니다. 아래 ) 높은컬럼온도에서조각피크가더효과적으로분리되므로 mab 프로파일링이개선됩니다. 10

11 최적의분석을위한기울기조정 그림 12 의크로마토그래피비교는환원되고알킬화된단일클론항체에대해두가지최적화된고속분리를보여줍니다. ZORBAX RRHD 300-Diphenyl, mm 컬럼과크로마토그래피조건에서는환원된 mab Light chain 과 2 개의 Heavy chain 변이체에대한적절한분리가가능했습니다. 위쪽의크로마토그램은좁은밴드와높은분리능으로분석한 Heavy chain 의분리결과를자세히보여줍니다. 이에비해, 아래그림에나타난분리는 Heavy chain 의적절한분리가가능하도록최적화되었지만피크너비는약간증가합니다. 이분리에서, 2 개의 Heavy chain 은거의바탕선까지분리되었습니다. 반대로, 두분리사이에서디페닐상에서는기울기만약간바꾸면서두개의 Heavy chain 분리능을향상시킬수있었습니다. 분석조건 컬럼 : Agilent ZORBAX RRHD 300-Diphenyl, mm, 1.8µm(p/n ) 시료 : 환원된단일클론항체 (IgG1) BioCreative IgG1 시료농도 : 1.0mg/mL 용리액 : A: 0.1% TFA가함유된물 B: 80% n-프로필알코올, 10% ACN, 9.9% 물및 0.1% TFA 주입량 : 2µL 유속 : 0.5mL/ 분 이동상변화도 : 첫번째조건 : 0분 1% B, 2분 20% B, 5분 70% B 두번째조건 : 0분 1% B, 2분 20% B, 5분 50% B 온도 : 74 C 검출기 : UV, 280nm 그림 12. Agilent ZORBAX RRHD 300-Diphenyl, 2.1mm 100mm LC 컬럼을이용해서로다른최적화된기울기조건에서달성한환원된단일클론항체에대한두개의초고속분리의비교. 상단그림은짧은머무름시간으로좁은피크너비를제공하는분리결과를나타내고있습니다. 하단그림은두개의 Heavy chain 피크에서효율성은낮지만높은분리능으로분리된결과를나타내고있습니다. 11

12 체계적인기울기분석법에따라, 최적의분리능을가진고속분리가가능하도록각 mab 에대한기울기를연구하였습니다. 그림 13 의위그림에표시된분리는 CDH 미디어에서발현된애질런트표준항체에최적화되었으며표 3 에나오는기울기조건인기울기 A 를사용했습니다. 분리는 4 분이내에완료되었으며매우좁은밴드너비를가진 intact 피크에대해우수한분리능을보여줍니다. 이에비해, 아래크로마토그램은 CHO 세포주에서발현된인간화 mab 에최적화되었으며표 3B 의기울기조건인기울기 B 를사용했습니다. 이분리에서기울기는 mab 기본피크로부터프론트숄더를분리한완만한기울기커브로최적화되었습니다. 그림 13 의두분리는높은효율로 mab 특성규명을실행하기위해고처리량이가능하도록개발되었습니다. 각분리는반복주입시퀀스가가능하도록빠르게 90% 이소프로판올로세척하고신속한재평형화로마무리하였습니다. 표 3. 최적의선택성을위해최적화된기울기 Agilent 표준 IgG1 을위한기울기 A BioCreative IgG1 을위한기울기 B 시간 ( 분 ) %B 시간 ( 분 ) %B 분석조건 컬럼 : Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C3, mm, 1.8µm(p/n ) 시료 : CDH 미디어 (Agilent) 에서얻은표준 IgG1, CHO(BioCreative) 에서얻은 IgG1 시료농도 : 1.0mg/mL 용리액 : A: 0.1% TFA가함유된물 B: 70% 이소프로필알코올, 20% ACN, 10% 물및 0.1% TFA 주입량 : 2µL 유속 : 1.0mL/ 분 이동상변화도 : 표 3 참조 온도 : 75 C 검출기 : UV, 280nm 그림 13. Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C mm LC 컬럼에서두개의단일클론항체에최적화된 UHPLC 분리. 이분리는 1.0mL/ 분및 75 C 에서수행되었습니다. 위그림은 CHO 미디어에서발현된 mab 에최적화되었으며, 아래크로마토그램은 CHO 세포주에서발현된인간화 mab 에최적화되었습니다. 각분리는분석실행후 2 분의빠른재평형화를진행했습니다. 12

13 최적의단백질분리를위한서로다른선택성비교한편, 선택성은 mabs의단백질분리를개선하기위한추가적인방법이며, 바이오의약품분석을가능하게할전망이높습니다. 그림 14 는 Poroshell 300 컬럼의높은분리능과연계한선택성차이가분리를개선하는데도움을줄수있음을보여줍니다. 수명이긴컬럼이동상선택일반적으로역상분석에사용되는이동상은트리플루오로아세트산 (TFA) 또는포름산 (FA) 이들어있는산성상입니다. 이러한이동상은대부분의 HPLC 컬럼에가장긴수명을제공합니다. 컬럼을선택할때는최적의피크모양을제공하는성능뿐아니라사용되는조건에따라수명의관점에서성능을고려해야합니다. 일반적인펩타이드매핑응용작업의경우 0.1% TFA 및포름산을사용할수있습니다. 조밀하게결합된상을가진 AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼은탁월한피크모양을제공하며이러한조건들에서매우효과적인성능을볼수있습니다. 고농도의 TFA 또는기타 Modifier 를사용하여실험할경우, 낮은 ph 환경에서안정성을유지하도록개발된 StableBond 기술을고려하십시오. 기억해야할참고사항 : 때때로아세트산이트리플루오르산이나포름산대신사용됩니다. 높은온도에서아세트산은컬럼수명에영향을미칩니다. 분석조건 컬럼 : Agilent Poroshell 300, mm, 5µm(p/n ) 시료 : 분해된인슐린 용리액 : A: 물 + 0.1% TFA B: ACN % TFA 유속 : 1.75mL/ 분 이동상변화도 : 5% B는 0.3분유지, 5 ~ 65% B, 2.7분 온도 : 45 C 그림 14. Agilent Poroshell 300 의결합상을변경하면중요한피크쌍의분리능을높여분석정확도가개선됩니다. 13

14 ZORBAX RRHD 300SB-C3 컬럼의수명은반복주입시퀀스동안낮은 ph 조건에서평가되었습니다. 컬럼충진베드안정성, 상안정화및주입구 frit 성능은모두반복 mab 분석동안에고온과고압에서지속적작동을위해중요한요소입니다. 이성능을평가하기위해리보뉴클레아제 A, 시토크롬 C 및리소자임을 1,000 회반복주입했습니다. 이분리의크로마토그래피보기는그림 15 에나와있습니다. 그림 16 은수명플롯입니다. 분석조건 컬럼 : Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C3, mm(p/n ) 용리액 : 이동상 A: H % TFA(v/v) 이동상 B: ACN + 0.1% TFA(v/v) 주입량 : 2µL 유속 : 1.25mL/ 분 이동상변화도 : % 용매 B 시간 ( 분 ) 온도 : 75 C 압력 : 900bar 시스템 : 자동주입기, Binary 펌프, 항온컬럼격실및다이오드어레이검출기를가진 Agilent 1290 Infinity LC 시스템 그림 15. Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C3, mm LC 컬럼을이용하여수명안정성모니터링을위해리보뉴클레아제 A, 시토크롬 C 및리소자임의고속분리 그림 16. Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C3, mm LC 컬럼의수명플롯. 그래프는 1,000 회의주입과정에서매 100 회실행간격동안플롯된리보뉴클레아제 A, 시토크롬 C 및리소자임의연속적인단백질피크너비기록을보여줍니다. 14

15 품질관리 QC 방법은신뢰성과완건성에중점을두어야합니다. 추가적으로, 분석속도가훨씬더중요해지고있습니다. 우수한 QC 를위한팁 컬럼재현성평가 ZORBAX RRHD 300Å 컬럼은제조단계에서일관된성능을보장하는오랜 QC의전통에뿌리를두고우수한배치간재현성을보여줍니다. 그림 17 및표 4는 ZORBAX RRHD 300SB-C18 컬럼의재현성을검사하기위해 200회연속주입의결과를보여줍니다. 피크모양의무결성, 비대칭성, 머무름시간및효율성은컬럼을세척하지않고도주입후동일하게유지되었습니다. 표 4. Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C18 1.8µm LC 컬럼의재현성을증명하기위해인슐린의 200 회주입 Heavy chain 피크 1 Heavy chain 피크 2 주입횟수 RT( 분 ) 피크너비대칭성 RT( 분 ) 피크너비대칭성 분석조건컬럼 : Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C3, mm, 1.8µm 시료 : 환원된단일클론항체 (IgG1) (1.0mg/mL)- Agilent BL05 IgG1 주입량 : 2µL 이동상 A: 0.1% TFA가함유된물이동상 B: 80% n-프로필알코올, 10% ACN, 9.9% 물및 0.1% TFA 이동상변화도 : 0분 1% B, 2분 20% B, 5분 50% B, 7분 50% B, 8.0분 90% B, 8.3분 1% B, 2분유지온도 : 75 C 유속 : 0.4mL/ 분검출기 : UV, 280nm 그림 17. Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C18 1.8µm LC 컬럼의재현성은 200 회주입에서도볼수있읍니다. 15

16 유속과짧은컬럼으로분석속도개선 짧은컬럼길이에서빠른분리를위해유속도조정할수있습니다. 피크비대칭성과효율은변하지않고유지되며, 빠른분리가가능한 sub-2µm 입자의특징입니다. 그림 18 및표 5 는재조합인간에리스로포이에틴 (erythropoietin) 의분석에서유속의영향을나타내며그림 19 와표 6 은인슐린분리에관한내용입니다. 표 6. 인슐린분리에서머무름시간, 비대칭성및피크너비에대한유속의영향 유속 (ml) 압력 (bar) 머무름 시간 ( 분 ) 비대칭성 플레이트수 ~ , ~ , ~ , ~ ,060 표 5. repo 단백질분리에서머무름시간, 비대칭성및피크너비에대한유속의영향 유속 (ml) 압력 (bar) 머무름시간 ( 분 ) 비대칭성 피크너비 그림 18. Agilent ZORBAX RRHD 300 SB-C18, mm, 1.8µm LC 컬럼에서인슐린단백질을분리하기위해다양한유속의사용 분석조건컬럼 : 시료 : 시료농도 : 용리액 : Agilent ZORBAX 300SB-C18, mm, 1.8µm (p/n ) 인슐린, 돼지이자에서얻은산화인슐린사슬 A 및사슬 B(Sigma-Aldrich Corp.) 1mg/mL A: 0.1% TFA가함유된증류수 B: 80% ACN 및 0.01% TFA가함유된증류수 주입량 : 3µL 유속 : 표 6 참조 이동상변화도 : 5 ~ 100% B, 0 ~ 4분 압력 : ~ 650bar 검출기 : UV, 280nm 시스템 : Agilent 1290 Infinity LC 시스템 그림 19. Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C18, mm, 1.8µm LC 컬럼에서 repo 단백질을분리하기위해다양한유속의사용 16

AdvanceBio RP-mAb 단일클론항체특성규명의고유한문제를해결하는데중점을둔유일한역상컬럼모든 AdvanceBio RP-mAb 컬럼에내장된독점적인 Agilent Poroshell 기술은다음과같은이점을제공합니다. 정확도개선 : 넓은 pore(450å) 을가진표면다공성입자 (3.

17 AdvanceBio RP-mAb 단일클론항체특성규명의고유한문제를해결하는데중점을둔유일한역상컬럼모든 AdvanceBio RP-mAb 컬럼에내장된독점적인 Agilent Poroshell 기술은다음과같은이점을제공합니다. 정확도개선 : 넓은 pore(450å) 을가진표면다공성입자 (3.5µm) 가모든 LC 기기와의호환성을유지하면서 mab 분리를개선 속도 : 동일한크기의완전다공성입자로충진된컬럼에비교하여짧은분석시간 비용절감 : 견고한 Poroshell 충진베드와 2µm 주입구 frit 이주입구막힘을방지하여컬럼수명을연장 유연한분석법개발 : 다양한케미스트리 SB-C8, C4 및 diphenyl Agilent AdvanceBio RP-mAb 컬럼 결합상 Pore 크기 온도한계 ph 범위 엔드캡핑 C4 450Å 90 C 1.0 ~ 8.0 예 SB-C8 450Å 90 C 1.0 ~ 8.0 아니요 Diphenyl 450Å 90 C 1.0 ~ 8.0 예 ZORBAX Rapid Resolution High Definition(RRHD) 300Å, 1.8µm 1.8µm 입자의컬럼은기존 300Å 3.5µm 컬럼에비교할때향상된피크모양, 높은분리능과함께높은감도를보여주는 UHPLC 성능을제공합니다. 성능의재현성이매우높으며 ZORBAX 의제조품질관리를 증명합니다. 이러한컬럼은안정성을위해 1200bar 프리미엄 UHPLC 에서특별히사용되었으므로, 유속을확실하게높일수있습니다. ZORBAX RRHD 300Å, 1.8µm 컬럼은정밀한선택성과성능프로필을위해고유한 diphenyl 을비롯해다양한상에서이용가능합니다. 그래서, StableBond 코팅은우수한낮은 ph 안정성과열유연성을가지며, 300SB-C18 컬럼은 90 C 에서안정적이므로, 온도증가에유연성을제공하여분리를개선하며 ZORBAX StableBond C8 와같은특수결합상은더빠른실행시간으로고분리능의 mab 분리가가능합니다. Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Definiton(RRHD) 300Å 컬럼 결합상 입자크기 Pore 크기 온도한계 ph 범위 엔드캡핑 압력한계 (bar) 300SC-C18 1.8µm 300Å 90 C 1.0 ~ 8.0 아니요 1200(18,000psi) 300SB-C8 1.8µm 300Å 80 C 1.0 ~ 8.0 아니요 1200(18,000psi) 300SB-C3 1.8µm 300Å 80 C 1.0 ~ 8.0 아니요 1200(18,000psi) 300Diphenyl 1.8µm 300Å 80 C 1.0 ~ 8.0 예 1200(18,000psi) 17

Poroshell 300 이컬럼의특별한입자기술은큰 intact 단백질의역상분석을개선합니다. Poroshell 300 은 300Å 의 pore 크기를가지는반면에, 더큰 pore 크기를가진컬럼처럼작동하며, 더많은고분자량 (50kDa, mabs 의경우 150kDa) 을가진생체분자를처리할수있습니다.

18 Poroshell 300 이컬럼의특별한입자기술은큰 intact 단백질의역상분석을개선합니다. Poroshell 300 은 300Å 의 pore 크기를가지는반면에, 더큰 pore 크기를가진컬럼처럼작동하며, 더많은고분자량 (50kDa, mabs 의경우 150kDa) 을가진생체분자를처리할수있습니다. Poroshell 300 frit 은작은입자를가진컬럼에비해잘막히지않습니다. Poroshell 300 의표면다공성입자는역압 (backpressure) 이거의증가하지않고도높은유속과빠른분석시간을제공하면서, 우수한분리능을 얻을수있습니다. Poroshell 300 은거의더큰 pore 의컬럼처럼동작하므로표면다공성입자때문에상당한속도상의이점으로큰 intact 단백질을처리할때특별한장점이있습니다. Agilent Poroshell 300 컬럼사양 결합상 입자크기 Pore 크기온도한계 ph 범위 엔드캡핑 압력한계 300SB, C18, C8, C3 5µm 300Å 90 C 1.0 ~ 8.0 아니요 400bar(6,000psi) 300Extend C18 5µm 300Å ph 8 위에서 40 C, ph 8 아래에서 50 C 2.0 ~ 11.0 예 400(6,000psi) AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼 AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼은다양한분자량범위를가진펩타이드조각을식별하기에이상적인 120Å pore 크기를가집니다. 이컬럼은 펩타이드매핑의성능과재현성을확인하기위해까다로운펩타이드혼합물로테스트했습니다. 애질런트고유의표면다공성입자기술을이용해높은유속과전체펩타이드시퀀스의우수한분리능을제공할수있습니다. Agilent AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼 결합상 입자크기 Pore 크기온도한계 ph 범위 엔드캡핑 압력한계 2.7µm EC-C18 표면다공성 120Å 60 C 2.0 ~ 8.0 Double 600bar(9,000psi) 18

19 주문정보 Agilent AdvanceBio RP-mAb 컬럼, 3.5µm 설명 크기 (mm) 부품번호 설명 크기 (mm) 부품번호 C SB-C C SB-C C SB-C C Diphenyl C Diphenyl C Diphenyl C Diphenyl SB-C Diphenyl SB-C Diphenyl SB-C Diphenyl SB-C Agilent Poroshell 300, 5µm 설명 크기 (mm) 300SB-C18 300SB-C8 300SB-C3 300Extend-C18 USP L1 USP L7 USP L1 캐필러리 MicroBore Narrow Bore 가드카트리지, 4/pk 가드하드웨어키트 MicroBore 가드, 3/pk Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Definition(RRHD) 300Å 컬럼, 1.8µm 설명 크기 (mm) 300SB-C18 300SB-C8 300SB-C3 300-Diphenyl 300-HILIC USP L1 USP L7 USP L11 Narrow Bore Narrow Bore Agilent AdvanceBio Peptide Mapping 컬럼, 2.7µm 설명 부품번호 mm mm mm mm mm mm 간편가드 mm 간편가드 mm 간편가드

Agilent AdvanceBio 컬럼 Agilent 는 AdvanceBio 바이오컬럼제품군을이용해바이오크로마토그래피의정확도와생산성향상을위해노력하고있습니다. AdvanceBio 컬럼에는재현성있는결과를보장하여, UHPLC 성능과 바이오크로마토그래피테스트를개선하기위한고유한혁신기술이내재되어있습니다.

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20 Agilent AdvanceBio 컬럼 Agilent 는 AdvanceBio 바이오컬럼제품군을이용해바이오크로마토그래피의정확도와생산성향상을위해노력하고있습니다. AdvanceBio 컬럼에는재현성있는결과를보장하여, UHPLC 성능과 바이오크로마토그래피테스트를개선하기위한고유한혁신기술이내재되어있습니다. AdvanceBio 컬럼은바이오의약품과학자들이모든특성규명으로부터더많은정보를얻을수있도록설계되었습니다. 성공적인결과를얻는방법 다양한바이오컬럼및작은분자용컬럼을통해애질런트는응용분야에적절한컬럼을선택할수있도록 LC 컬럼및시료전처리 NAVIGATOR 를소개해드렸습니다. NAVIGATOR 는 4 개의간단한검색옵션을제공합니다. 부품번호를기준검색, LC 컬럼과시료전처리제품을교차참조하여최적의애질런트교체품을찾습니다 컬럼기준검색 ( 분석법에기초한권장사항이용 ) 화합물드롭다운목록기준검색 USP 분석법기준검색. 게다가, 이도구는크로마토그래피최적화를위한컬럼지원, 시료전처리제품권장사항및기술지원리소스와기타도구에대한빠른액세스를제공 자세한내용을확인하거나컬럼을구매하려면 advancebio 를방문하시기바랍니다. 이정보는사전공지없이변경될수있습니다. Agilent Technologies, Inc., 년 11월 13일한국에서발행 KO 서울시용산구한남대로 98, 일신빌딩 4층우 )04418 한국애질런트테크놀로지스 ( 주 ) 생명과학 / 화학분석사업부고객지원센터

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본연구는 mabs 와 ADC 의 LC/MS 분석을증명하기위해폴리머역상컬럼 (Agilent PLRP-S) 을사용했습니다. PLRP-S 컬럼은폴리스티렌및디비닐벤젠으로만든단단하고큰다공성구형입자로채워집니다. 이러한입자들은전체 ph 범위에서물리화학적으로안정적입니다. 이입자들은본 mabs 및 ADC 의 LC/MS 분리를위한 PLRP-S 폴리머역상컬럼 Intact mabs, 조각 mabs 및 ADC 의분석 응용자료 생물약제및생물의약품 저자 Suresh Babu C.V. Agilent Technologies, Inc. 개요 이응용자료는단일클론항체 (mabs) 및항체약물결합체 (ADC) 와같은대형생체분자의특성규명을위한폴리머기반역상컬럼의응용기술을기술하고있습니다.