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1 배지및시약 배지 1. A7 고형배지 1) 기본배지 Ureaplasma agar medium 33 g D. W. 830 ml 2) 완전배지 Horse serum ( 비가열 ) 200 ml 25% Yeast extract 100 ml 10% Urea 5 ml 2% L-cysteine 5 ml 1% Phenol red 2 ml 100만 penicillin 1 ml CVA enrichment 5 ml 상품화된기본배지를증류수 830 ml에넣고가온하여잘녹인후 2N NCl로 ph 5.5~ 6.0되게조정한다음 121 에서 15분간고압멸균한다. 냉각시킨후완전배지를무균적으로첨가하여적당한용기에분주하여사용한다. 2. AE Sporulation Medium, Modified (for C. perfringens) Polypeptone Yeast extract 10.0 g 10.0 g 배지및시약 459

2 Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Ammonium acetate MgSO 4 7H 2 O D.W g g 1 l 각배지및시약성분을녹여서, 2M Sodium carbonate을이용하여 ph 7.5±0.1되게조정한다 mm크기의나사마개가달린시험관에 15 ml씩분주하여, 121 에서 15분간고압멸균한다. 여과멸균한 10% raffinose 0.6 ml와 0.66M sodium carbonate와 0.32% Cobalt chloride (CoCl 2 6H2O) 을각각 0.2 ml씩떨어뜨린다. 시험관한개내지두개의시험관 ph을확인하여최종 ph가 7.8± 0.1이되어야한다. 배지를사용하기직전에 10분동안중탕하여열을가한후식힌다음여과멸균한 1.5% sodium ascorbate ( 당일날만든것 ) 을 0.2 ml을각시험관에첨가하여사용한다. 3. Baird-Parker agar Base Tryptone 10 g Beef extract Yeast extract 1 g Glycine 12 g Sodium pyruvate 10 g Lithium chloride 20 g D.W. 950 ml 혼합상품화된 base와증류수를정량하여잘혼합한후가온하여녹인다음 ph 7.0±0.2로조정한다. 121 에서 15분고압멸균한후 40~50 로식혀 EY Tellurite Enrichment 50 ml을첨가하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 460 감염병실험실진단제 1 부세균질환

3 4. BCYEα Base Yeast extract 11. Charcoal activated 1. ACES buffer 6.0 g α-ketoglutarate Monopotassium 1.0 g 17.0 g 혼합상품화된 Legionella agar base와증류수를매뉴얼에따라정량하고가온하여잘녹인후 (ph 7.2), 121 에서 15분간고압멸균한다. 45 로식혀 Legionella supplement [L-cysteine (0.4 g/l) HCl, Ferric pyrophosphate (0.2/l)] 를각각여과멸균하고첨가하여페트리디쉬에분주하여사용한다. BCYEα-Cys - 배지는 BCYEα 배지시 Legionella supplement중 L-cysteine (0.4 g/l) 을첨가하지않고하여사용한다. 5. Bicarbonate 한천배지 Heart Infusion agar D.W. 4.0 g 90 ml 상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합하여열을가해녹인다음 121 에서 15분고압멸균한다. 실온에서 50 로식힌다음 sodium bicarbonate (7% solution) 를 10 ml을넣고혼합한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 배지및시약 461

4 6. Bismuth Sulfate Beef extract Peptone 10 g Dextrose Disodium phosphate 4 g Ferrous sulfate 0.3 g Bismuth sulfate indicator 8 g 20 g Brilliant green 0.02 ( 최종 ph 7.7± 0.2) 상품화된혼합배지를매뉴얼에따라정량하고증류수에넣어잘혼합하여가열한다 (1~2분이상끊이거나멸균해서는안된다 ). 페트리디쉬에붓기전에침전이생길수있으므로잘섞어가며분주한다. 7. Blaser-Wang Selective Medium 1) Columbia Base Special peptone Starch Sodium chloride D.W. ( 최종 ph 7.3±0.2) ml 2) Blood Base No.2 Proteose peptone Liver digest Yeast extract Sodium chloride g 462 감염병실험실진단제 1 부세균질환

5 D. W. 500 ml ( 최종 ph 7.4±0.2) 3) Campylobacter Selective Supplement (Blaser-Wang) Vancomycin Trimethoprim Cephalothin Amphotericin B Polymyxin B g 1,250 I.U. Columbia Base (19./500 ml ) 또는 Blood Base No.2 (20.0 g/500 ml ) 을매뉴얼에따라정량하고잘혼합한후가온하여녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한후 50 정도되게식혀멸균된증류수 2 ml에녹인 Campylobacter Selective Supplement를첨가한다. 여기에 5~10% 탈섬유한면양혈액또는 5~7% lysed 말혈액을첨가하여거품이생기지않게잘혼합하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 8. Blood agar Blood agar base Beef heart infusion Tryptose Sodium chloride 500 g 10 g 혼합상품화된 base를매뉴얼에따라정량하여증류수 950 ml에넣고혼합하여열을가해잘녹인후 121 에서 15분간멸균한다음 45~50 로식혀탈섬유소시킨면양혈액 50 ml을무균적으로넣어기포가안생기게잘혼합한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 배지및시약 463

6 9. Bolton Selective Enrichment Broth 1) Bolton broth base Meat peptone Lactalbumin hydrolysate 2. Yeast Extract 2. Sodium chloride 2. Haemin 0.00 α ketoglutaric acid 0. Sodium pyruvate 0.2 Sodium metabisulphite 0.2 Sodium carbonate 0.3 g D. W. 500 ml 2) Modified Bolton Selective Supplement (500 ml용, 1 vial) Cefoperazone Vancomycin Trimethoprim Cycloheximide 10.0 mg 20.0 mg 10 mg 25.0 mg 증류수 500 ml에 Bolton Broth 13.8 g 정량하여열을가해녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한후 50 로식혀 25 ml의 lysed 말혈액과 Bolton Broth Selective Supplement를무균적으로첨가한다. Bolton Broth Selective Supplement를녹이기위해, 5 ml의에탄올 / 증류수 (50/50) 를첨가한것을 1병넣는다. 용해시키기위해천천히혼합하여잘섞은다음멸균된나사마개가있는용기에분주한다. 10. Bordet-Gengou agar Potato Insusion 12 Sodium chloride g 464 감염병실험실진단제 1 부세균질환

7 혼합상품화된배지를정량하고증류수에넣어잘혼합한다음가온하여녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한후 50 로식혀면양혈액을최종농도가 10%~15% 되게첨가하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 11. Brain Heart Infusion agar 배지 (BHI) Pancreatic digest of casein 16.0 g 13. Brain heart, solids from infusion 8.0 g Peptic digest of animal tissue Sodium chloride Glucose 2.0 g Na 2 HPO 4 2. D.W. 1 l ( 최종 ph 7.4±0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한후가온하여녹인다. 121 에서 15분간고압멸균하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 12. Brilliant green agar 배지 Proteose peptone 10 g Yeast extract 3 g Lactose 10 g Saccharose 10 g Sodium chloride 20 g Brilliant green Phenol red 0.0 D. W 1 l ( 최종 ph 6.9 ± 0.2) 배지및시약 465

8 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한후가온하여녹인다. 121 에서 15분간고압멸균하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 13. Butzler Selective Medium 1) Columbia Base Special peptone 12. Starch 0. Sodium chloride 2. D. W. 500 ml ( 최종 ph 7.3±0.2) 2) Modified Campylobacter Selective Supplement (Butzler) Novobiocin Cephazolin sodium Cycloheximide Bacitracin Colistin sulphate ,500 I.U. 5,000 I.U. 혼합상품화된 Columbia Blood Base 19.을정량하여증류수 500 ml에넣어잘혼합한다음가온하여녹이고 121 에서 15분간고압멸균한후 50~55 로식힌다. 탈섬유시킨말혈액을 5~7% 되게첨가하고여기에에탄올 / 증류수 (50/50) 혼합물 3 ml로녹인 (Supplement는반복해서병을뒤집으면서녹이며, 용액에거품이생기는것을피한다 ). Supplement를첨가하여잘혼합하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 466 감염병실험실진단제 1 부세균질환

9 14. Carbohydrate fermentation broth purple broth base Proteose peptone No.3 10 g Beef extract 1 g NaCl Bromo cresol purple 0.01 D.W. 1 l ( 최종 ph 6.8±0.2) 혼합상품화된배지를매뉴얼에따라정량하고증류수에넣어잘혼합한후가온하여녹인다음 100 ml씩적당한용기에분주하여 121 에서 15분고압멸균한다. 각용기에첨가할탄수화물을표기하고 glucose, lactose, sucrose, mannitol 등은최종농도가 1% 되게, 그외 dulcitol, salicin, xylose, maltose, rhamnose와같은당은최종농도가 0.5% 되게첨가하여잘녹인후 4부시험관에 2 ml씩분주하여 121 에서 10분간멸균하여사용한다. lactose, sucrose, cellobiose 등과같은이탄당은 0.45 μm막여과지로여과멸균하여 purple broth base에첨가하여사용한다. 15. Cary and Blair Transport Medium Sodium thioglycollate Disodium phosphate Sodium chloride g 각배지및시약들을 991 ml증류수에순서대로첨가하고한천을 을넣은다음배지가투명해질때가지가열한다. 50 정도로식한다음 calcium chloride 1% 용액을 9 ml첨가하여 ph 8.4 로조정하고멸균된나사마개시험관에 7 ml씩분주한다. 이를 15분간증기탕시킨다음식혀서마개를꼭막는다. 면봉은미리끊인 Sorenson s 배지및시약 467

10 buffer (ph 8.1) 에담근다음짜서유리용기에넣어 121 에서 15분간멸균하고실온에서건조하지않게보관한다. 16. Casamino Acid Yeast Extract (CAYE 배지 ) Casamino acid 20 g Yeast extract 6 g NaCl 2. K 2 HPO g Salt solution 1 ml (MgSO 4 5w/v%, MnCl 2 0.5w/v%, FeCl 3 0.5w/v%, Dissolve into 0.5 mmol/lsulfuric acid) ph 8.5 혼합상품화된배지를매뉴얼에따라정량하여증류수에넣고잘혼합한후가온하여녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한다음적당한용기에분주하여사용한다. 17. CAT Selective Medium 1) Campylobacter Blood-Free Base Nutrient Broth No Bacteriological charcoal 2.0 g Casein hydrolysate 1. Sodium desoxycholate 0. Ferrous sulphate 0.12 Sodium pyruvate g D. W. 500 ml ( 최종 ph 7.4±0.2) 2) Cefoperzone, Amphotericin B, Teicoplanin Supplement (CAT) Cefoperzone Amphotericin B Teicoplanin 4.0 g 2.0 g 468 감염병실험실진단제 1 부세균질환

11 Blood-Free Campylobacter Base 22.7을정량하여증류수 500 ml에넣어잘혼합한후가온하여녹여 121 에서 15분간고압멸균한다. 멸균된배지는 50 까지식힌후여기에 4 ml의멸균된증류수로녹인 CAT supplement 1병을첨가한다. 잘혼합하고최종적으로만들어진 CAT 배지를멸균된페트리디쉬에분주한다. 이배지는어두운곳에서보관하고비닐로감싸거나밀폐된용기에보관하는것이바람직하다. 18. CCDA Selective Medium 1) Campylobacter Blood-Free Base (22.7/500 ml D.W.) CM0739B Nutrient Broth No Bacteriological charcoal 2.0 g Casein hydrolysate 1. Sodium desoxycholate 0. Ferrous sulphate 0.12 Sodium pyruvate g D. W. 500 ml ( 최종 ph 7.4±0.2) 2) CCDA Selective Supplement (1 vial/agar) Blood-Free Campylobacter 를위한향상된선택성첨가제 Cefoperazone 16 mg Amphotericin B 5 mg Campylobacter Blood-Free Selective Base 22.7을정량하여증류수 500 ml에넣어잘혼합한후가온하여녹여 121 에서 15분간고압멸균한다. 멸균된배지는 50 까지식힌후여기에 2 ml의멸균된증류수로녹인 CCDA Selective Supplement 1병을첨가하여잘섞고멸균된페트리디쉬에분주하여사용한다. 배지및시약 469

12 19. CDC anaerobe blood agar 1) base Casein peptone Soy peptone Yeast extract NaCl 1 1 2) 첨가제 Hemin Vitamine K Sheep blood g 50 ml 혼합상품화된 base를정량하여 950 ml증류수에넣어혼합하고가온하여녹인다음 ph를 7.2로조정하고 121 에서 15분간고압멸균한다. 50 로식힌후각각의첨가제를넣어잘혼합하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 20. CH 배지 Heart Infusion agar Chloral hydrate D.W. 40 g 2. 1 l 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣로잘혼합한후가온하여녹인다음 121 에서 15분간고압멸균하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 470 감염병실험실진단제 1 부세균질환

13 21. Cysteine heart agar bood (CHAB) Cystine Heart 5.1 g D. W. 82 ml 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어혼합한후가온하여녹인후 121 에서 15분간고압멸균한다. 50 로식힌다음탈섬유소된양혈액 18 ml (9%) 을넣고잘혼합한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 22. Chanock 고체배지 1) 기본배지 Glucose 배지 PPLO agar w/o CV 21 g Glucose D. W. 700 ml ph 7.3 Arginine 배지 PPLO agar w/o CV 21 g Arginine 2 g D. W. 700 ml ph ) 완전배지 Horse serum ( 비가열 ) 200 ml 25% Yeast extract (fresh) 100 ml 2.5% Thallium acetate 10 ml 100만단위 Penicillin G 1 ml 1% phenol red 2 ml 배지및시약 471

14 각기본배지를매뉴얼에따라정량하여증류수 700 ml에넣고혼합하고가온하여잘녹인다음 glucose 배지는 ph 7.3, arginine 배지는 ph 5.6~7.0으로조정하여 121 에서 15분간고압멸균한다. 멸균된기본배지를 50 로식힌다음완전배지의각성분들을무균적으로첨가한다음페트리디쉬에분주하여사용한다. 23. Chanock 액체배지 기본배지는 Chanock 고체중 PPLO broth w/o 21 g을사용하는것만제외하고는동일하며, 완전배지를위한첨가성분도고체배지와동일하다. Chanock 고체배지법과동일하며, 배지분주시액체배지임으로시험관에분주하여사용한다. 24. Charcoal Horse blood agar (Regan-Lowe agar) Lab-Lemco poweder Peptone Starch Charcoal NaCl Nicotinic acid 10.0 g 10.0 g 10.0 g 4.0 g g 12 g 혼합상품화된배지를정량하여 900 ml증류수에넣고잘혼합하고가온하여녹인다음 121 에서 15분간고압멸균한다. 50 정도로식힌다음탈섬유소한말혈액 100 ml ( 최종농도 10%) 을첨가하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 472 감염병실험실진단제 1 부세균질환

15 25. Cystine tryptic agar Tryptose 20 g Cystine 0. Sodium chloride Sodium sulfate Phenol Red g 각각의 glucose, sucrose, maltose, lactose 10 g을 100 ml증류수에용해한후 0.22 μm로멸균여과하여 10% 당보존용액을한다. 혼합상품화된 Cystine tryptic agar (CTA) 29.을증류수 900 ml에첨가하여완전히용해하여 121 에서 15분동안멸균한후 50 로식힌다. 무균적으로 10% glucose 용액 100 ml을 CTA 배지 900 ml에첨가한후잘혼합하여나사마개시험관에 7 ml씩분주하여 4 에보관한다. 26. chocolate agar GC medium base Pancreatic digest of casein Selected meat peptone Corn starch Dipotassium phosphate Monopotassium phosphate Sodium chloride ( 최종 ph 7.2 ± 0.2) g 4 g 1 g 1 GC medium base 36 g을증류수 950 ml에녹여 121 에서 15분간멸균한후 90~ 100 일때바로꺼내어양혈액이 5% 가되도록무균적으로가한후잘섞어준다. 50 로식힌다음 IsoVital X (BBL) 10 ml을넣고잘혼합한다음페트리다쉬에 20 ml씩 배지및시약 473

16 분주하여사용한다. 27. Chlamydia pneumoniae 배양배지 MEM 500 ml 200 mm L-glutamine solution 5 ml 7.5% Sodium bicarbonate 8 ml FBS 50 ml Cycloheximde 1 μg / ml 혼합상품화된 MEM 배지 500 ml에각배지및시약성분을무균적으로정량하여넣고잘혼합하여사용한다. 28. Chopped meat dextrose medium Ground beef (free of fat) 1N NaOH D.W 500 g 25 ml 1 l Ground beef를정량하여증류수에넣고저으면서끓인뒤상온으로식혀표면의기름을제거하고여과한다. 전체부피가 1 l가되도록증류수를맞추고 Peptone 30 g, yeast extract, K 2 HPO 4, 0.025% Resazurin 용액 4 ml, Dextrose 을정량하여놓고끓인다. 식힌후 0. L-cysteine을첨가하고 HCl을넣어 ph 7.0으로조정한다음 97% 질소, 3% 수소가있는상태에서 7 ml씩나사마개시험관에분주하되 meat가전체의 1/5 부피가되도록넣어준다. 121 에서 15분간멸균한다. 474 감염병실험실진단제 1 부세균질환

17 29. CIN agar 1) base Special pepton Yeast extract Mannitol Sodium pyruvate Sodium chloride Magnesium sulphate Sodium desoxycholate Neutral red Crystal violet D.W 20 g 2 g 20 g 2 g 1 g 0.01 g g g 1 l 2) Supplement Cefsulodin Irgasan Novobiocin 7.5 mg 2.0 mg 1.25 mg 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한다음가온하여완전히녹인다. ph 7.4±0.2로조정한다음 121 에서 15 분간멸균하고 50 정도로식혀 2 병의 supplement를무균적으로첨가하여넣고잘섞어준후페트리디쉬에분주하여사용한다. 30. Columbia blood agar Pantone Bitone Tryptic digest of beef heart Corn starch Sodium chloride 10 g 10 g 3 g 1 g 1 배지및시약 475

18 혼합상품화된배지 44 g을증류수 950 ml을정량하여넣고열을가해잘녹인후 121 에서 15 분간고압멸균한다. 멸균된 base를 45~50 로식혀탈섬유소시킨면양혈액 50 ml를무균적으로넣고기포가안생기게잘혼합한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 31. Columbia CNA blood agar Pantone Bitone Tryptic digest of beef heart Corn starch Sodium chloride Colistin sulfate Nalidixic acid 10 g 10 g 3 g 1 g 10 mg 10 mg 1 혼합상품화된배지 44 g을증류수 950 ml을정량하여넣고열을가해잘녹인후 121 에서 15 분간고압멸균한다. 멸균된 base를 45~50 로식혀탈섬유소시킨면양혈액 50 ml를무균적으로넣고기포가안생기게잘혼합한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 32. Cooked meat medium (CMM) Beef heart Proteose peptone Dextrose NaCl 454 g 20 g 2 g 1 l 476 감염병실험실진단제 1 부세균질환

19 혼합상품배지 12.을찬증류수 100 ml에부유시킨다. 혼합시킨후알갱이가충분히젖도록 15분정도놓아둔다. 혹은배지 1.2을 ml시험관에넣고찬증류수 10 ml을넣고혼합하여모든알갱이가젖도록놓아둔다. 121, 15분간고압멸균한다 ( 최종 ph는 7.2 ± 0.2). 사용하기바로전에고압멸균된배지를물중탕하여, 흔들지않고, 식혀서사용한다. 33. Cooked Meat Medium (Modified) 1) Cooked meat medium ( 혼합상품배지가있음 ) Beef heart Proteose peptone Dextrose NaCl 454 g 20 g 2 g 2) 희석액 ( 상품배지가없음 ) Trypyone Sodium thioglycollate Soluble starch Dextrose Neutral red(1% aqueous) D.W. 10 g 1 g 1 g 2 g 5 ml 1 l 혼합상품화된 Cooked meat medium 1 g과희석액 15 ml를시험관 ml에넣고고기알갱이가물에젖도록방치한다음 121 에서 15분간고압멸균하여사용한다. 배지및시약 477

20 34. Corn meal-tween 80 agar Corn meal 50 g Tween 80 3 ml Corn meal를정량하여 500 ml증류수에넣어잘혼합하고가온하여녹인다음 1% Tween 80을첨가하여총량이 1 l 되도록증류수로채운다. 여기에한천을첨가하고완전히녹인후 121 에서 15분간고압멸균하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 35. Decarboxylase 시험배지 (Moeller method) Decarboxylase base Peptone Beef extract Brom cresol purple Cresol red Glucose Phridoxal D.W ( 최종 ph 6.8±0.2) 0.01 g l 혼합상품화된 base를매뉴얼에따라정량하여증류수에넣어잘혼합한다음열을가해완전히녹인후 base를각각 250 ml씩적당한용기에분주하여 4등분한다. 각용기에 lysin, arginine, ornithine 및음성대조용이라고표시하고각해당되는시약을 1% 되게첨가한다. 즉, L-lysine dihydrochloride, L-arginine monohydrochloride, L-ornithine dihydrochloride를첨가하고음성대조에는아미노산을첨가하지않는다. 첨가된시약을가온하여녹인후나사마개시험관에 3~4 ml씩분주하고여기에 paraffin oil 1 ml을첨가하여 121 에서 10분간고압멸균하여사용한다. 478 감염병실험실진단제 1 부세균질환

21 미생물은 L-form의아미노산에만활성을나타내므로만일 DL-form인아미노산을사용할경우에는 2% 의농도를첨가해야한다. Arginine과 lysine이첨가된배지는 ph를조정하지않아도되지만 Ornithine 이첨가된배지는멸균하기전에 ph를 6.0으로조정한다. Ornithine배지에서는소량의섬유성침전물이생기는수도있는데사용에는지장이없다. 36. Desoxycholate agar Peptone 10 g Lactose 10 g Sodium despxycholate 1 g Sodium chloride Dipotassium phosphate 2 g Ferric citrate 1 g Sodium citrate 1 g 1 Neutral red 0.03 g D. W 1 l ( 최종 ph 7.3 ± 0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합한후성분들이완전히녹을수있도록가온하여 1분간끓인다음페트리디쉬에분주하여사용한다 ( 이배지는고압멸균을해서는안되며다시녹여사용할수없다 ). 37. Desoxycholate Citrate agar Pork, Infusion 330 g Proteose peptone 10 g Lactose 10 g Citrate 20 g 배지및시약 479

22 Ferric ammonium citrate 2 g Sodium Desoxycholate 13. Neutral red 0.02 g ( 최종 ph 7.5 ± 0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합한후성분들이완전히녹을수있도록가온하여 1분간끓인다음페트리디쉬에분주하여사용한다 ( 이배지는고압멸균을해서는안되며다시녹여사용할수없다 ). 38. DNase medium Pancreatic digest of casein 1 Papaic digest of soybean meal Sodium chloride Desoxyribonucleic acid 2.0 g 1 D.W. 1 l 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여녹인후 ph를 7.3±0.2로조정한다. 121 에서 15분동안고압멸균하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 39. DPBS DPBS 분말 상품화된 DPBS 분말을매뉴얼에따라정량하여증류수에넣고 1 시간정도교반후 480 감염병실험실진단제 1 부세균질환

23 염산을이용하여 ph 7.4 로조정하고 0.22 μm막여과지로여과멸균하여사용한다. 40. Dulbecco s modification of Eagle s MEM (DMEM) DMEM 분말 sodium bicarbonate (NaHCO3) D.W. 3.7 g 1 l 상품화된 DMEM powder와 sodium bicarbonate를매뉴얼에따라정량하여증류수에넣고 2~3시간정도교반한다. 염산으로 ph 7.4로조정하고막여과지 (0.22 μm ) 로여과멸균하여사용한다. 41. Duncan-Strong (DS) Sporulation Medium, Modified (for C. perfringens) Proteose peptone Yeast extract Sodium thioglycollate Na 2 HPO 4 Raffinose D.W. 1 4 g 1 g 10 g 4 g 1 l 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한다. 가온하여녹인다음 121 에서 15분간고압멸균하고 50 정도로식혀멸균한 0.66 M sodium carbonate을사용하여 ph를 7.8±0.1로조정하여적당한용기에분주하여사용한다. 배지및시약 481

24 42. EMJH medium Base Sod. Phosphate dibasic Potassium phosphate monobasic Sod. chloride Ammonium chloride Thiamine ( 최종 ph : 7.5) 1.0 g 0.3 g 1.0 g 혼합상품화된 base 2.3 g을정량하여증류수 900 ml에넣고가온하여완전히녹인후 121 에서 15분간고압멸균한다. 50 정도로식힌후 Leptospira Enrichment EMJH 100 ml을첨가하여잘섞어멸균된마개시험관에분주하여사용한다. 43. Enterococcosel agar Pancreatic digest of casein 17.0 g Peptic digest of animal tissue 3.0 g Yeast extract Oxgall, dehydrated 10.0 g Sodium chloride Sodium citrate 1.0 g Esculin 1.0 g Ferric ammonium (HI) citrate 0. Sodium Azide ( 최종 ph 7.1±0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한후가온하여녹인다음 121 에서 15분간고압멸균하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 482 감염병실험실진단제 1 부세균질환

25 44. FBS 함유 DMEM 배지 E. chaffeensis 증식을위한 DH-82 세포배양배지 FBS 5~10 ml (5~10% FBS) 100 mm L-glutamine 1 ml상품화되어있는 DMEM 배지에 FBS 와 L-glutamine을첨가하여 100 ml로조정하고막여과지 (0.22 μm ) 로여과멸균하여사용한다 45. FBS 함유 RPMI 1640 배지 A. phagocytophilum 증식을위한 HL-60 세포배양배지 FBS 5~10 ml (5~10%) 100 mm L-glutamine 1 ml 상품화되어있는 RPMI 1640 배지에 FBS 와 L-glutamine을첨가하여 100 ml로조정하고 0.2 μm크기의막여과지로여과멸균하여사용한다. 46. Fletcher s 배지 base Peptone 0.3 g Beef extract 0.2 g Sod. chloride D.W. 920 ml 배지및시약 483

26 혼합상품화된 base를정량하여증류수 920 ml에넣고잘혼합하여가온하여완전히녹인다. 121 에서 15분동안멸균한다음 50 정도로식혀멸균된토끼혈청을 8~ 10% 되게첨가하여잘섞은후무균적으로시험관에분주한다. 56 수조에서 1시간정도방치하고그다음날다시 1시간정도둔후에꺼내어사용한다. 47. GN broth Tryptone 20 g Dextrose 1 g D-mannitol 2 g Sodium citrate Sodium desoxycholate 0. K 2 HPO 4 4 g KH 2 PO 4 1. Sodium chloride ( 최종 ph 7.0 ± 0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여녹인다. 적당한용기에분주하고 121 에서 15분간고압멸균하여사용한다. 48. GVPC 배지 Legionella agar base 혼합상품화된 base를매뉴얼에따라정량하여증류수에넣고잘혼합하여가온하여녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한후 45 로식혀 Legionella supplement [Lcysteine (0.4 g/l) HCl, Ferric pyrophosphate (0.2/l)] 를각각여과멸균하여첨가하 484 감염병실험실진단제 1 부세균질환

27 고 glycine (3 g/l), vancomycin (5 mg /l), polymyxin (79,200 U/l), cyclohexamide (80 mg /l) 를첨가하여잘혼합한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 49. Hektoen Enteric Medium proteose peptone 12 g Yeast extract 3 g Lactose 12 g Sucrose 12 g Salicin 2 g Bile salt 20 g Sodium chloride Sodium thiosulfate Ferric ammonium citrate 1. Brom thymol blue 0.06 Acid fuchsin 0.1 g 14 g D. W 1 l ( 최종 ph 7.5 ± 0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합하여가열하여완전히녹인다음페트리디쉬에분주하여사용한다. 이배지는고압멸균하지않는다. 50. Hoyle medium Hoyle medium base D. W 1 l 혼합상품화되어있는 base 40 g을증류수에넣고가온하여완전히녹인후 121 C에서 15분동안고압멸균한다. 55 C로식힌후 50 ml의 Laked horse blood (SR0048) 와 10 ml의 3.5% Potassium Tellurite 용액 (SR0030) 을넣고혼합한후분주한다. 배지및시약 485

28 Hoyle medium은 Neill s medium을변형시킨배지로 mitis types에성장억제효과가없으며모든 type의 C. diphtheriae 들이매우신속하게성장할수있도록하여배양후 18시간이내에진단이가능하도록한다. 51. Indole Test 배지 Peptone Sodium chloride D.W 20 g 1 l 증류수에배지를정량하여넣고가온하여잘녹인다음 4부시험관에 2 ml씩분주하여 121 에서 15분간고압멸균한다. 2% peptone대신에, 1% tryptose 또는 1.5% casitone, 1.5% trypticase 등을 peptone원료로사용할수있다. 52. Karmail Selective Medium 1) Campylobacter Base Columbia Base 18.0 g Activated charcoal 2.0 g Haematin g D. W. 500 ml (ph 7.4±0.2) 2) Campylobacter Selective Supplement Sodium pyruvate Cefoperazone Vancomycin Cycloheximide 50 g 16 g 10 g 50 g 486 감염병실험실진단제 1 부세균질환

29 500 ml의증류수에 Campylobacter agar base 21.을넣고가열하여녹인후, 121 에서 15분간고압멸균한다. 50 정도식힌배지에멸균된증류수 2 ml에녹인 supplement 1병을첨가하여잘혼합한후멸균된페트리디쉬에분주하여사용한다. 53. Kligler s Iron (KIA) Beef extract yeast extract peptone Proteose peptone Lactose Glucose Ferrous sulfate Sodium chloride Sodium thiosulfate Phenol red D.W 3 g 3 g 1 10 g 1 g 0.2 g 0.3 g g 1 l 혼합상품화된배지를표시된매뉴얼에따라배지를증류수에넣어잘혼합하고가온하여완전히녹인다. 4부시험관에약 3 ml씩분주하여 121 에서 15분간고압멸균한후밑둥을깊게 ( 밑둥 : 2.5 cm, 사면 : 4 cm ) 하여사면배지를만든다. 54. Lactose-Gelatin배지 (for C. perfrignens) Tryptose 1 Yeast extract 10 g Lactose 10 g Phenol red (1% solution in 95% ethanol) 5.0 ml Gelatin 120 g D. W 1 l 배지및시약 487

30 400 ml의증류수에 tryptose와 yeast extract, lactose를넣은후가열하여녹인다. 한편 600 ml의증류수에 gelatin을잘섞어넣은후, 교반기를이용하여 50~60 의열을가하여잘녹인다음두가지용액을섞어 ph가 7.3~7.7이되도록조정한다. 여기에 1% phenol red를첨가하여 mm규격의마개시험관에 10 ml씩분주한후, 121 에서 15분간고압멸균하여사용한다. 한지 8시간이상된배지는, 사용하기 2~3시간전에 50~70 로재가열하여사용하여야한다. 55. LPM Glycine anhydride 10.0 g Sodium chloride LiCl Pancreatic digest of casein Proteose peptone No.3 Beef extract 3.0 g Phenylethyl alcohol 2. Moxalactam Solution 2.0 ml 1 ( 최종 ph 7.3±0.2) Moxalactam 용액 Moxalactam 0.1 g D. W. 10 ml Moxalactam 0.1 g 을 10 ml증류수에용해하여여과지로여과멸균한다. 혼합상품화된배지를정량하여증류수 998 ml에넣어잘혼합한다음가온하여완전히녹인다. 121 에서 12분간고압멸균한후 45~50 로식혀여과멸균한 Moxalactam 2 ml을무균적으로첨가하여잘혼합한다음페트리디쉬또는시험관에분주하여사용한다. 488 감염병실험실진단제 1 부세균질환

31 56. Leeds Acinetobacter Medium (LAM) Bacterological agar No g Acid casein hydrolysate 1 Neutralized soy peptone Sodium Chloride D-Fructose Sucrose D-Mannitol L-Phenylalanine 1 g Ferric Ammonium Citrate 0.4 g Phenol Red 0.02 g ( 최종 ph 7.0 ± 0.2) 각배지및시약성분을정량하여 1 l의증류수에넣어잘혼합하고가온하여완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한다음 45~55 로식혀 vancomycin 10 mg /l, cefsulodin 15mg /l, cephradine 50 mg /l을첨가하여잘혼합시킨후페트리디쉬에분주한다. 신선한배지는오렌지색을나타내며 4±2 에서 2주간사용이가능하다. 57. Lowenstein-Jensen 배지 1) Mineral salt solution Potassium dihydrogen phosphate anhydrous (KH 2 PO 4 ) 2.4 g Magnesium sulfate (MgSO 4 7H 2 O) 0.24 g Magnesium citrate 0.6 g Asparagine 3.6 g Glycerol(reagent grade) 12 ml D. W. 600 ml 각시약을정량하여증류수 600 ml에넣고잘혼합하여녹인다음 121 에서 30분간고압멸균후냉장고보관시장기간사용가능하다. 배지및시약 489

32 2) Malachite green solution, 2% Malachite green dye 2.0 g D. W. 100 ml 침전물이생기거나색상변화가있으면버리고다시만들어쓴다. 3) 전란액 (Homogenized whole eggs) 각한시약 mineral salt 용액 600 ml, Malachite green 용액 20 ml, 전란액 ( 계란약 20~25개에해당 ) 1,000 ml를적당한용기에넣어잘혼합한후나사마개시험관또는 McCartney 병등에 6~8 ml씩분주한후, 응고기에서사면으로 80~85 에서약 45분간응고시켜서사용한다. 58. Lysine Iron Peptone Yeast extract 1 g Dextrose 10 g L-lysine 10 g Ferric ammonium citrate 0. Sodium thiosulfate 0.04 g Brom cresol purple 0.02 g 1 D. W 1 l 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여완전히녹인다. 4부시험관에 4 ml씩분주하여 121 에서 12분간고압멸균한다. 밑면은깊고, 사면은짧은사면배지를만든다. 490 감염병실험실진단제 1 부세균질환

33 59. MacConkey Peptone 17 g Proteose peptone 3 g Lactose 10 g Bile Salts, No Sodium Chloride 13. Neural Red 0.03 g Crystal Violet g ( 최종 ph 7.1 ± 0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한다음페트리디쉬에분주하여사용한다. 60. Mannitol Salt Sodium chloride D-Mannitol 10.0 g Pancreatic digest of casein Peptic digest of animal tissue Beef extract 1.0 g Phenol Red 0.02 (ph7.4±0.2 at 25 ) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한다음페트리디쉬에분주하여사용한다. 배지및시약 491

34 61. Minimal-Salts (MSA) 1) Salt solution NH 4 Cl 20 g NH 4 NO 3 4 g Na 2 SO 4 8 g K 2 HPO 4 12 g KH 2 PO 4 4 g MgSO 4 7H 2 O 0.4 g 2) base NO g 각시약및배지를정량하여증류수에잘녹인다음 Salt 용액 250 ml을 agar base 750 ml와혼합한다. 20% glucose 10 ml와최종농도가 1% 가되도록 sodium acetate 를첨가하여 121 에서 15분간고압멸균하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 62. Modified Thayer-Martin (MTM) GC base Proteose peptone No. 3 Corn starch Potassium phosphate, dibasic Potassium phosphate monobasic Sodium chloride 1 1 g 4 g 1 g 10 g 재조혼합상품화된 base 7.2 g을증류수 100 ml에넣어녹인후 ph 7.2±0.2로조정한다음가열하여완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한다음 45~50 로식히고 492 감염병실험실진단제 1 부세균질환

35 2% hemoglobin 용액 100 ml과 IsoVitale X 2 ml을넣고잘혼합한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 63. Motility Test Medium Tryptone 10 g Sodium Chloride 혼합상품화된배지를정량하고증류수에넣어잘혼합하과가온하여완전히녹인다음 ph 7.2±0.2로조정한다. 4부시험관에 3 ml씩분주하여 121 에서 15분동안고압멸균하여사용한다. 64. Motility-Nitrate 배지 (for C. perfrignens) Beef extract 3 g pepton KNO 3 1 g Na 2 HPO g Glactose Glycerin (reagent grade) 5 ml 각각의시약및배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여녹인다음 ph 7.3±0.1로조정한다. 이용액을 16 x 150 mm시험관에 11 ml씩배지를분주하고 121 에서 15분동안고압멸균하여사용한다. 4시간이후에사용할경우에는끊는물에 중탕하여사용하거나, 고온을이용하여한번녹인다음식혀서사용한다. 배지및시약 493

36 65. Mueller Hinton 배지 (MH) Beaf infusion Casamino acid Starch D.W. 300 g l 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여완전히녹인후 121 에서 15분간고압멸균한다음페트리디쉬에분주하여사용한다. 66. Niger seed (Birdseed agar) Guizotia abyssinicia seed 분말 50 g Dextrose 1 g KH 2 PO 4 1 g Creatinine 1 g 1 Seed 분말은정량하여증류수에넣고 30분간끓인후찌꺼기를여과한후식혀서나머지배지및시약성분을넣고가온하여녹인후 121 에서 15분동안고압멸균한다음페트리디쉬에분주하여사용한다. 494 감염병실험실진단제 1 부세균질환

37 67. Nitrate broth Beef extract 3 g Peptone Potassium nitrate 1 g 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여녹인다. 5.5부시험관에여과관을넣고 5 ml씩분주하여 121 에서 15분간고압멸균하여사용한다. 68. Nutrient agar Beef extract 3.0 g Peptone 1 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합한다음가온하여완전히녹인다. ph 6.8±0.2로조정하고 121 에서 15분동안고압멸균하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 69. O/F basal medium Base Tryptone 2 g Sodium Chloride K 2 HPO g Bromo thymol blue 0.08 g 2 g 배지및시약 495

38 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고혼합한후가온하여성분을완전히녹인다. ph 6.8±0.2로조정한다음 121 에서 15분동안고압멸균한다. 여기에 0.45 μl로여과멸균한포도당용액을최종농도가 1% 되게첨가후멸균된 4부시험관에분주하여사용한다. 분주한시험관 1/2은파라핀오일 1 ml정도를첨가하고나머지시험관에는파라핀오일을첨가하지않는다. 70. Ogawa 배지 1) Mineral salt 용액 Potassium dihydrogen phosphate anhydrous (KH 2 PO 4 ) 2.4 g Sodium glutamate 3.0 g D. W. 300 ml 2) 2% Malachite green 용액 Malachite green dye 2.0 g D. W. 100 ml 3) 전란액 (Homogenized whole eggs) 각한시약 mineral salt 용액 300 ml, Malachite green 용액 18 ml, 전란액 ( 계란약 12~16개에해당 ) 600 ml를적당한용기에넣어잘혼합한후나사마개시험관또는 McCartney 병등에 6~8 ml씩분주한후, 응고기에서사면으로 80~85 에서약 45분간응고시켜서사용한다. 응고후배지의 ph는 6.8이다. 496 감염병실험실진단제 1 부세균질환

39 71. P Peptone 10.0 g NaCl Yesat extract Glucose 1.0 g 1 ( 최종 ph 7.5±0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한다음가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분동안고압멸균한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 72. PALCAM (Polymycin-acriflavin-lithium chloride-ceftazidime esculin-mannitol) 1) base Tryptic digest beef harar 2.7 g Pancreatic digest of casein 8.9 g Peptone 4.4 g LiCl 1 Mannitol 10.0 g Sodium chloride 4.4 g Yease extract 4.4 g Starch 0.9 g Esculin 1.0 g Ferric ammonium citrate 0. Glucose 0. Phenol Red 0.08 g Acryflavine HCl 5.0 mg Polymixin B 0.01 g PALCAM selective supplement 10.0 ml 15.3 g ( 최종 ph 7.2±0.2) 배지및시약 497

40 2) PALCAM antibiotic supplement Ceftazidime 40.0 mg D. W. 10 ml 혼합상품화된 base를정량하여증류수 990 ml에넣고잘혼합한다음가온하여완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한다음 50 로식혀 supplement 10 ml를무균적으로배지에혼합하여페트리디쉬나시험관에분주하여사용한다. 73. PEA 배지 Heart Infusion agar 40 g 2-phenylethanol 3 ml D. W. 1 ml 각배지및시약성분을정량하여증류수에넣고잘혼합한다음가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분동안고압멸균한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 74. Penicillin-G 한천배지 Tryptose agar 4.1 g D.W. 100 ml 혼합상품화된 Tryptose agar 배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한다음가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분동안고압멸균한후 50 로식힌다음 penicillin-g를 10 U/ ml로첨가하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 498 감염병실험실진단제 1 부세균질환

41 75. Phenethyl Alcohol blood Base Pancreatic digest of casein NaCl Papaic digest of soybean meal β-phenethyl alcohol ( 최종 ph 7.3±0.2) 혼합상품화된 base를정량하여증류수 950 ml에넣고잘혼합한다음가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분동안고압멸균한후 50 로식혀탈섬유시킨면양혈액 50 ml를첨가하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 76. Polymyxin B-Lysozyme-EDTA-Thallous Acetate (PLET) 한천배지 Heart Infusion agar 40 g EDTA 0.3 g Thallous acetate 0.04 g 각배지및시약성분을정량하여증류수에넣고혼합한다음가온하여들을완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한후 50 로식혀 polymyxin B는 30,000 U/l, lysozyme은 300,000 U/l 농도되게첨가하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 배지및시약 499

42 77. Phenylalanine malonate Broth 배지 Yeast extract 1 g Sodium malonate 3 g DL-Phenylalanine 2 g Ammonium sulfate 2 g Dipotassium phosphate 0.6 g Monopotassium phosphate 0.4 g Sodium chloride 2 g Brom thymol blue 0.02 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한후녹인다. 4부시험관에 2 ml씩분주하여 115 에서 10분간고압멸균한다. 78. Preston Broth 1) Nutrient Broth No.2 Lab-Lemco powder Peptone Sodium chloride 2. D. W. 500 ml ph 7.5 ± 0.2 2) Modified Preston Selective Supplement (500ml 용, 1vial) Polymyxin B Trimethoprim Rifampicin Cycloheximide 2,500 I.U 5 mg 5 mg 50 mg 500 감염병실험실진단제 1 부세균질환

43 3) Campylobacter Growth Supplement (500 ml용, 1 vial) Sodium pyruvate Sodium metabisulphite Ferrous sulphate ) Lysed Horse Blood Nutrient broth No.2 12.을정량하여 475 ml증류수에녹이고 121 에서 15분간고압멸균한다. 50 정도로식혀 Lysed horse blood 25 ml와 Preston selective supplement 아세톤 / 물 (50:50) 을 2 ml첨가하여녹인것과 Campylobacter growth supplement 2 ml의멸균된물에녹인것각 1병씩을첨가한후골고루잘혼합한다. 멸균된나사마개가있는작은병에 5 ml씩분주한다. 한배지는 4 에서 7일간보관할수있다. 79. Preston Selective Medium 1) Campylobacter Base Lab-Lemco powder Peptone Sodium chloride g D. W. 500 ml (ph 7.5±0.2) 2) Campylobacter Selective Supplement (preston) Polynyxin B Rifampicin Trimethoprim Cycloheximide 2,500 I.U. 50 g 3) Laked Horse Blood 배지및시약 501

44 Campylobacter agar Base 18.을증류수 475 ml에잘혼합하고가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한후 50 정도식혀 Laked Horse Blood 25 ml과아세톤 / 증류수 (50:50) 2 ml로녹인 Preston Campylobacter Selective Supplement를첨가하여잘혼합하고멸균된페트리접시에분주하여사용한다. 80. Pyrazinamidase 시험용배지 Dubos broth base Casitone 0. Asparagine 2 g Tween g Monopotassium phosphate 1 g Disodium phosphate (anhyd.) 2. Ferric Ammonium citrate 50 mg Magnesium sulfate 10 mg Calcium chloride 0.5 mg Zinc sulfate 0.1 mg Copper sulfate 0.1 mg 혼합상품화된 base 6.을정량하여증류수에넣어잘혼합한다. 여기에 0.1 g의 pyrazinamide, 2.0 g의 sodium pyruvate, 1의 agar를넣고가온하여완전히배지 성분을녹인다. 16x125 mm나사마개시험관에 5 ml씩분주하고 121 에서 15분간고압 멸균한다. 직립상태에서굳힌다음사용하며, 냉장보관시수개월간사용가능하다. 81. Sabouraud dextrose agar (SDA) Dextrose 40 g Neopeptone 10 g 감염병실험실진단제 1 부세균질환

45 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한다음가온하여녹인다. 121 에서 10분간고압멸균하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 82. Schleifer-Krämer (SK ) 1) Glycerol sodium pyruvate Pancreatic digest of casein Beef extract Yeast extract Potassium isothicoyanate LiCl Na 2 HPO 4 2H 2 O NaH 2 PO 4 H 2 O NaN 3 solution D.W. ( 최종 ph7.2±0.2) 10.0 g 10.0 g 10.0 g 3.0 g g 0.9 g 0.6 g 10.0 ml 13.0 g 1 l 2) NaN 3 용액 NaN D. W. 10 ml NaN 3 를정량하여증류수 10 ml에넣어잘혼합한후 0.22 μm여과지로여과멸균한다. 혼합상품화된배지를정량하여 990 ml증류수에넣어잘혼합하고가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균하고 45~50 로식혀여과멸균한 NaN 3 용액 10 ml를무균적으로첨가하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 배지및시약 503

46 83. Selenite Broth Tryptone 또는 Polypeptone Lactose 4 g Sodium phosphate 10 g Sodium selenite 4 g ( 최종 ph 7.0) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어혼합하고가온하여을완전히녹인다. 멸균된 5.5부시험관에 10 ml씩 (5 cm정도깊이 ) 분주하여사용한다. 이배지는고압멸균하지않고수증기에 30분간쏘여사용하며, 즉시사용할경우는그대로사용가능하다. 84. Shigella broth Tryptone 20 g K 2 HPO 4 2 g KH 2 PO 4 2 g Sodium chloride Glucose 1 g Tween ml Novobiocin 용액 Novobiocin 0.50 g D. W. 100 ml Novobiocin 을정량하여증류수 100 ml에넣어잘혼합한후여과멸균한다. 혼합상품화된배지를정량하여증류수 ml넣어잘혼합하고가온하여완전히녹인다. ph 7.0±0.2로조정한후 121 에서 15분동안고압멸균한다음 45~50 로식혀여과멸균한 novobiocin 용액 ml를무균적으로첨가하고혼합하여적당한 504 감염병실험실진단제 1 부세균질환

47 나사마개시험관에분주하여사용한다. 85. Shigella-Salmonella (SS ) Beef extract Proteose Peptone Lactose 10 g Bile salts No Sodium citrate 8. Ferric citrate 1 g Sodium Thiosulfate Brilliant green 0.33 mg Neutral red 0.02 D. W 1 l 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한다. 가열하여이완전히녹인다음 55~60 로식혀페트리디쉬에분주하여사용하며, 고압멸균하지않는다. 86. Skirrow Selective Medium 1) Columbia Base Special peptone 12. Starch 0. Sodium chloride 2. D. W. 500 ml (ph 7.3±0.2) 배지및시약 505

48 2) Blood Base No. 2 Proteose peptone 7. Liver digest 1.2 Yeast extract 2. Sodium chloride g D. W. 500 ml (ph 7.4±0.2) 3) Campylobacter Selective Supplement (Skirrow) Vancomycin Trimethoprim Polymyxin 5.0 mg 2.5 mg 12,500 I.U. 4) Laked Horse Blood Base로는혼합상품화된 Columbia base 나또는 Blood base No 2를사용한다. 매뉴얼에따라 agar base를정량하고증류수에넣어잘혼합한다음가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균하여 50~55 로식히고 5~7% 되게 Laked horse blood를첨가하고여기에 Campylobacter Selective Supplement ( 멸균된증류수 2 ml에녹인것 ) 도첨가한다. 거품이나지않도록천천히혼합하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 87. Simmon s Citrate agar Sodium chloride Magnesium sulfate Dipotassium phosphate Sodium citrate Brom thymol blue D.W 0.2 g 1 g 2 g g 1 l 506 감염병실험실진단제 1 부세균질환

49 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣고잘혼합한다음가온하여녹인다. 4부시험관에 3 ml씩분주하여 121 에서 15분간고압멸균하여사면배지를만든다 ( 밑둥 2.5 cm, 사면 4 cm ). 88. Staphylococcus Medium Peptone 6.0 g Pancreatic digest of casein 4.0 g Yesat extract 3.0 g Beef extract 1. Glucose 1.0 g 1 ( 최종 ph 6.6±0.2) 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 89. Stuart s 배지 Asparagine g Ammonium chloride 0.2 Magnesium chloride 6H 2 O g Sod. chloride g Disodium phosphate g Phenol red 0.01 g D.W. 995 ml Sterile rabbit serum 8~10% Glycerine 5.0 ml ( 최종 ph ; ) 배지및시약 507

50 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가온하여녹인후 121 에서 15분간고압멸균한다. 50 로식힌후가토혈청을 8~10% 되게첨가하고혼합하여멸균된적당한용기에분주하여사용한다. 필요시에는이배지에 1% 한천을첨가하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 90. Sucrose phosphate Glutamate (SPG) Sucrose 7 KH 2 PO g Na 2 HPO g L-Glutamic acid 0.72 g Bovine serum 50.0 ml Antibiotic inhibitor 10.0 ml ( 최종 ph7.4~7.6) Antibiotic inhibitor Vancomycin 0.1 g Streptomycin g Nystatin 25,000 U D. W. 10 ml 각항균제를멸균된증류수에넣어잘혼합하여녹인후여과멸균한다. Bovine serum과항균제를제외한각배지및시약성분을정량하여증류수 940 ml에넣어잘혼합후가온하여녹인다. 121 에서 15분간고압멸균하여 45~50 로식힌후무균적으로 bovine serum 50 ml과여과멸균한항균제 10ml를첨가하고혼합하여무균적으로멸균된나사마개시험관에분주하여사용한다. 508 감염병실험실진단제 1 부세균질환

51 91. Syncase broth Casamino acid 10 g Sucrose Na 2 HPO 4 K 2 HPO 4 NH 4 Cl 1.18 g Na 2 SO g MgCl 2 6H 2 O g MnCl 2 4H 2 O g FeCl 3 6H 2 O 0.00 각배지및시약을정량하여증류수에넣어잘혼합한다음가온하여녹인다. ph를 7.2로조정하고나사마개시험관에 5 ml씩분주하여 121 에서 15분간멸균하여사용한다. 92. Tetrathionate Broth 1) Basal medium Polypeptone 또는 Proteose peptone Bile salt Calcium carbonate Sodium thiosulfate 1 g 10 g 30 g 2) Iodine 용액 Iodine 6 g Potassium iodide D. W. 20 ml 배지및시약 509

52 혼합상품화된 Basal medium 4.6 g을정량하여증류수 100 ml에넣어잘혼합한다음가열하여완전히녹인다. 60 로식혀 2 ml의 iodine 용액을첨가하고 brilliant green 을 Kauffman s Combined Enrichment Medium에표시된매뉴얼대로첨가한다 (basal medium 100 ml당 1:1,000용액 1 ml ). 이들을멸균된나사마개시험관에 10~12 ml씩분주하여한날에사용한다 ( 배지를저장해서사용할경우는 iodine 을첨가하지않고사용직전에첨가하여사용한다 ). Proteus가과다하게자라는것을막기위하여 sulfathiazol (100 ml배지당 0.12) 을첨가할수도있다. 93. Thioglycollate Bile Broth pancreatic digest of casein 1 Glucose 5. Yeast extract NaCl L-Cystine 0. Sodium thioglycollate 0. Bile solution 50.0 ml D. W. 1l ( 최종 ph 7.1±0.2) Bile 용액 Oxgall 40.0 g Sodium deoxycholate 2.0 g D. W. 100 ml Bile 용액은증류수 100 ml에 oxgall과 sodium deoxycholate를정량하여넣고잘혼합한다음여과멸균한다. 혼합상품화된배지를정량하여증류에넣어잘혼합한다음가열하여완전히녹인다. 5.5부시험관에 10 ml씩분주하여 121 에서 15분간고압멸균한후 45~50 로 510 감염병실험실진단제 1 부세균질환

53 식혀무균적으로 bile 용액을각시험관에 0.5 ml씩첨가하여사용한다. 94. Thioglycollate Medium (Fluid) L-Cystine 0. (granulated) 0.7 NaCl 2. Dextrose Yeast extract Tryptone 1 Sodium thioglycollate or 0. thioglycollic acid Resazurin, sodium 용액 (1:1,000), 1 ml 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합한후가온하여완전히녹인다. 5.5부시험관에 15 ml씩분주하고 121 에서 15분간고압멸균하여사용한다. 95. Thiosulfate Citrate Bile salt Sucrose agar (TCBS agar) 배지 Yeast extract Peptone 10 g Sodium citrate 10 g Sodium thiosulfate 10 g OX gall Sodium cholate 3 g Sucrose 20 g Sodium chloride 10 g Ferrous citrate 1 g Brom thymol blue 0.04 g Thymol blue 0.04 g 1 배지및시약 511

54 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣로잘혼합한후가온하여을완전히녹인다음 50 정도로식혀페트리디쉬에부어사용한다. 최적 ph는 8.6이며고압멸균을하지말고후 48시간이내에사용하도록한다. 96. Tinsdale medium 1) Tinsdale agar base Proteose peptone 20.0 g Yeast extract Sodium chloride L-cystine 0.24 g 1 2) Tinsdale Supplement Serum equiv. 20.0ml Potassium tellurite 0.069g Sodium thiosulphate 0.085g 15 ml의멸균된증류수에무균적으로넣어녹여사용하며, base 200 ml당한개의바이알을넣는다. base 9 g을 200 ml증류수에넣고잘혼합한후가열하여완전히녹인다. 50 로식힌다음 Tinsdale Supplement 15 ml을넣어혼합하고페트리디쉬에분주하여사용한다. 이배지는고압멸균하지않는다. 512 감염병실험실진단제 1 부세균질환

55 97. TM 배지 G.C agar base Hemoglobin 분말 Isovitale X enrichment VCN inhibitor 36 g ml (D.W) 10 g ml (D.W) 10 ml 10 ml 1 두개의 1 l 플라스크에증류수 250 ml씩을넣고각각에 Hemoglobin 을가하고진탕하여용해한후가열하여완전히용해한다. 멸균된거즈 (3 4겹) 를놓고 hemoglobin 용액을여과하여 121 에서 15분간고압멸균한다음 45~50 로식힌다. 2 1l 플라스크에 36 g의 GC agar를정량하고 500 ml증류수에넣어혼합한후가열하여완전히녹인다음 121 에서 15분간고압멸균한다. 50 항온수조내에서배지를식힌다. 3 GC 배지가든플라스크에멸균된 hemoglobin용액첨가하여혼합하고 ( 이때거품이생기지않도록주의 ), 10 ml의 Isovitale X, 10 ml의 VCN을무균적으로첨가하여천천히혼합한후페트리디쉬에분주하여사용한다. 98. Todd-Hewitt broth Heart, Infusion 500 g Neopeptone 20 g Dextrose 2 g Sodium chloride 2 g Disodium phosphate 0.4 g Sodium carbonate 2. Yeast extract 0.5% 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어혼합하고가온하여잘녹인다. 5.5부시험관에 5 ml씩분주한다음 121 에서 15분간고압멸균하여사용한다. 배지및시약 513

56 99. Todd Hewitt broth+yeast extract 배지 (THY) Todd Hewitt broth 30 g Yeast extract 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어혼합하고가온하여잘녹인다. 5.5부시험관에 5 ml씩분주한다음 121 에서 15분간고압멸균하여사용한다 Trimethoprim-Sulfamethoxazole-Polymyxin B sulfate 한천배지 (TMSPA) Columbia blood agar base 44 g Trimethoprim 3.2 mg Sulfamethoxazole 16 mg Polymyxin B sulfate 30,000 unit 혼합상품화된 Columbia agar base를정량하고증류수 950 ml에넣어혼합한다음가온하여완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한다음 50 로식혀탈섬유시킨면양혈액 50 ml (5%) 과 3.2 mg의 Trimethoprim, 16 mg의 Sulfamethoxazole, 30,000 unit Polymyxin B sulfate를첨가하여페트리디쉬에분주하여사용한다. 514 감염병실험실진단제 1 부세균질환

57 101. Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast Extract Broth (TPGY) Trypticase 50 g Peptone Yeast extract 20 g Dextrose 4 g Sodium thioglycollate 1 g 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합한후가열하여녹인다. 나사마개시험관에 15 ml씩분주하여 121 에서 10분동안고압멸균한후식혀냉장보관하였다가필요시꺼내어사용한다 Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast Extract Broth with Trypsin (TPGYT) TPGY 배지에트립신 (1:250) 1.을멸균증류수에넣어용해시킨후 0.45 μm필터로여과멸균하여사용직전에첨가한다. 15 ml배지에트립신 1 ml을넣는다 Urease Test Medium 1) Urea base Basal ingredients peptone 1 g Sodium chloride Glucose 1 g Monobasic potassium phosphate 2 g Phenol red g Urea 20.0 g ( 최종 ph 6.8) 배지및시약 515

58 900 ml의증류수에 agar 1을잘혼합하고가열하여녹인다음 121 에서 15분간멸균한후 50~55 로식힌다. 한편, 혼합상품화되어있는 urea agar base를표시된매뉴얼대로정량하여증류수 100 ml넣어잘혼합한후 0.45 μm막여과지를사용하여여과멸균한다. 앞서고압멸균하여식힌 agar와여과멸균한 urea agar base를잘혼합하여 4부시험관에 3 ml씩무균적으로분주한다. 밑면이깊은사면배지를만드는것이좋으며필요에따라액체배지를만들어사용할수도있다 UVM modified Listeria enrichment broth Sodium chloride Sodium phosphate dibasic Pancreatic digest of casein Proteose peptone No. 3 Beef extract Yeast extract Potassium phosphate dibasic Esculin Nalidixic acid Acriflavine HCl ( 최종 ph7.2±0.2) 20.0 g 9.6 g g 20.0 mg 12.0 mg 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합하고가열하여완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균한다음페트리디쉬에분주하여사용한다 VBC medium GC medium base 36 g D. W. 950 ml 516 감염병실험실진단제 1 부세균질환

59 혼합상품화된 GC medium base를정량하여증류수에넣어잘혼합한후가온하여을완전히녹인다. 121 에서 15분간고압멸균하여배지의온도가약 95 일때탈섬유소시킨면양혈액 50 ml를첨가한후플라스크를천천히돌려서거품이나지않도록주의하면서내용물을잘섞는다. 혈액이익어서응괴가생길정도로된것이헤모필루스균배양에적합하다. 배지를약 50 로식힌후 IsoVitale X 를 1% 되게첨가하고ml당 vancomycin 5 μg, bacitracin 300 μg, clindamycin 1 μg되게각각첨가하여절섞은후무균적으로페트리디쉬에분주하여사용한다 XLD agar Yeast extract 3.0 g L-lysine Xylose 3.7 Lactose 7. Saccharose 7. Sodium desoxycholate 2. Ferric ammonium citarate 0.8 g Sodium thiosulfate 6.8 g NaCl 1 Phenol red 0.08 g 혼합상품화된배지를정량하여증류수에넣어잘혼합한다음가온하여녹인후 ph 를 7.4±0.2로조정한다. 고압멸균하지않으며배지가 50 정도로식으면페트리디쉬에분주하여사용한다. 배지및시약 517

60 시약 1. Bile solubility (10% Sodium deoxycholate) Sodium deoxycholate D.W. 1.0 g 10.0 ml 시약을정량하여증류수에넣어잘녹인다음 ph 7.0으로조정한다. 멸균된갈색병에넣어냉장보관한후필요시꺼내어사용한다. 2. 1% Formalin 용액 Formalin ( 중성포름알데히드, 대략 37%) 100 ml D. W. 900 ml 대변검체의보존을위해사용 3. 3% Acid alcohol 70% alcohol 970 ml HCl (conc) 30 ml 70% alcohol 에 Hcl 을조금씩가하여녹여갈색병에보관한다. 4. Carbonate buffer (0.05M ph 9.6) 시약성분 0.2M Na 2 CO ml 0.2M NaHCO ml D. W. 200 ml 518 감염병실험실진단제 1 부세균질환

61 각시약과증류수를정량하여혼합한다음 121 에서 15 분간고압멸균하여사용한다. 5. 3% Catalase H 2 O 2 D.W. 0.3 ml 10 ml 멸균된나사마개시험관에증류수와 30% H 2 O 2를넣어잘혼합한다음냉장보관하고, 필요시꺼내어사용한다. 6. Gel-Phosphate Buffer 시약성분 Gelatin 2 g Na 2 HPO 4 4 g 각시약을정량하여증류수에넣어혼합한다음가열하여녹인후 ph를 6.2로조정한다. 121 에서 20분동안고압멸균한다. 7. Heat labile catalase 시험용시약 (68, ph 7.0) 0.067M phosphate 완충용액 (ph 7.0) 1) 용액 1 Disodium phosphate (Na 2 HPO 4 anhydrous) 9.47 g 2) 용액 2 Monopotassium phosphate (KH 2 PO 4 ) 9.07 g 배지및시약 519

62 ph 7인완충용액은용액 1, 61.1 ml과용액 2, 38.9ml를잘혼합하고 ph를 7.0으로조정한다. Complete catalase 시약 (Tween-peroxide mixture) 30% Hydrogen peroxide 10% Tween 80 10ml Tween 80을정량하여증류수 90 ml에넣어잘혼합한후적당한용기에넣어 121 에서 15분간고압멸균한다. 냉장보관하였다가시험직전에 Hydrogen peroxide 와혼합하여사용한다. 8. Kovac s 시약 (Indole 시험용 ) 시약성분 Pure amyl 또는 Isoamyl alcohol Para-di-methyl-aminobenzaldehyde Concentrated pure hydrochloric acid 150 ml 10 g 50 ml Aldehyde를알코올에녹인다음천천히산을첨가하여잘혼합한다. Kovac s 시약은소량씩만들어사용하며냉장고에보관한다. 건조된 aldehyde는색이연해야한다. 9. Niacin 시험시약 1) 4% aniline 용액 Aniline 4 ml과 95% 에타놀 96 ml을섞는다. 갈색병에넣어냉암소에서냉장보관한다 (aniline의색상이변한것은사용금한다 ). 520 감염병실험실진단제 1 부세균질환

63 2) 10% Cyanogen bromide 용액 Cyanogen bromide 을증류수 50 ml에넣어실온에서용해시킨뒤, 갈색병에넣어냉장보관한다. Cyanogen bromide는독성이심하므로와취급에매우조심하여야하며, 휘발성이있으므로보관에따라역가가감소된다. 10. MR-VP 시험시약 시약성분 1) MR Methyl-red Ethyl alcohol (95~96%) 0.1 g 300 ml 2) VP Potassium hydroxide Creatine D.W 40 g 0.3 g 100 ml 1) MR 알코올에 methyl-red를넣어잘혼합하여녹인다음증류수를가한후 500 ml가되게한다. 2) VP Potassium hydroxide를정량하여증류수에넣어잘혼합하여녹이고 Creatine을첨가한다. 사용직전만드는것이좋으며, -20 에서 2-3 주까지보존이가능하다. 배지및시약 521

64 11. Nitrite 시험시약 1) 용액 1; Sulfanilic acid 시약 Sulfanilic acid 1 g 5 N acetic acid 125 ml 5 N acetic acid는 glacial acetic acid ml를증류수 ml에첨가하여한다. 2) 용액 2; N-(1-naphthyl)ethylenediamine 시약 dihydrochloride N acetic acid 200 ml 5 N acetic acid는 glacial acetic acid ml를증류수 ml에첨가하여한다. 한각시약은갈색병에넣어냉장보관한다. 12. Oxidase 시험시약 Tetramethyl-P-phenylenediamine-dihydrochloride 1 g 또는 Dimethyl-P-phenylendiamine-oxalate D. W. 100 ml 시약을정량하여증류수에넣고마그네틱바를이용하여완전히용해시킨후갈색병에넣어냉장보관한다. 하여즉시사용하는것이바람직하며, 1주일이상된것은버린다 % PBSM 0.1 M PBS 100 ml Non-fat dry skim milk 0. 완전히용해시킨후즉시사용하는것이바람직하다 522 감염병실험실진단제 1 부세균질환

65 % phenol red 시약성분 Phenolsulfothalein 0.1 g 0.01N sodium hydorxide (NaOH) 22 ml D.W 200 ml 유발에 phenolsulfothalein 분말을 0.1 g 정량하여넣고여기에 0.01N NaOH 22 ml을가해유봉으로잘간다. 이것을 200 ml들이실린더에넣고다시적당량의증류수로유발을헹구어실린더에넣은다음 200 ml이되도록증류수로채운다 SP (0.2M Sucrose M Phosphate) 시약성분 sucrose g K 2 HPO g KH 2 PO g D. W. 1l 각각의시약을따로소량의증류수에녹인다음최종 1,000 ml로맞춘다. 121 에서 15분간고압멸균하여항생제를첨가하여사용한다. 항생제 - Gentamicin (10 μg / ml ) - Vancomycin (100 μg / ml ) - Nystatin (25 units/ ml ) 0.5~2 ml씩소분하여저장하면사용하기편리하다. 단기간보관시에는 4 에, 장기간보관시에는 -20 에보관한다. 배지및시약 523

66 16. 4SP (0.4M Sucrose M Phosphate) 시약성분 sucrose g Na 2 HPO g 각시약성분을정량하여소량의중류수에넣고잘녹인후증류수 1,000 ml로맞춘다. 1N HCl로 ph를 7.0~7.1로조정한후 121 에서 15분간고압멸균하여사용한다 % trypsin Trypsin 1: 250 Phosphate buffer (ph 8.2) 1 g 20 ml 플라스크에 phosphate buffer 20 ml를정량하여넣고여기에 trypsin (1: 250) 1 g을가해 30분동안실온에서방치한다 ( 이따금씩자주흔들어준다 ). 1500rpm에서 15분간원심하여비용해성물질을제거한다음상청액을취해서 0.45 μm막여과지로여과멸균하여 0.5 ml씩소분하여 4 냉장고에보관하였다가필요시꺼내여사용한다. 18. TBE 완충액 (5 stock) 시약성분 Tris base 54 g Boric acid mm EDTA 20 ml 각시약을정량하여증류수 800 ml에넣어녹인다음 ph 8.0로조정하여최종양이 1l가되도록한다. 사용할때에는 10배희석하여 0.5 TBE를만들어사용한다. 524 감염병실험실진단제 1 부세균질환

67 염색약 1. Counter 염색약 0.1 M PBS 100 ml Evan s blue 5 μg Evan s blue 5 μg을정량하여 PBS 에넣어잘녹인후갈색병에넣어보관한다. 2. Giemsa 염색약 시약성분 1) 보관용원액 Giemsa stain powder Methanol (absolute) Glycerine 0.6 g 50 ml 50 ml 김자염색분말을유발에갈고무게를정량한다음글리세린을첨가하여염색분말을완전히간다. 완전히갈은염색분말액을플라스크에넣고 55 에서 2시간항온시킨다 ( 이때 30분마다한번씩흔들어준다 ). 사용한유발에붙은염색분말은일정량의알코올을취해잘씻어낸후동일한플라스크에부어항온시킨다. 항온이끝난후나머지알코올을첨가하고잘혼합하여 2주일간방치한다 ( 가끔씩흔들어준다 ). 3. Gimenez 염색약시약성분 1) carbol basic fuchsin 보관용원액 10% basic fuchsin 100 ml Basic fuchsin 10 g 95% Ethyl alcohol 100 ml 배지및시약 525

68 4% Phenol 250 ml Phenol 10 ml D. W. 250 ml 10% basic fuchcin 100 ml, 4% phenol 250 ml을정량하여증류수 650 ml에넣어잘혼합한후 37 에서 48시간동안반응시킨다. 2) 보관용완충용액 0.2M NaH 2 PO 4 NaH 2 PO g D. W. 100 ml 0.2M NaH 2 PO 4 Na 2 HPO g D. W. 100 ml 3) Carbol basic fuchsin 실험용염색약 4 ml Carbol basic fuchsin 보관용염색약, 10 ml 0.1M sodium phosphte 완충용액 (ph 7.45), 3.5 ml 0.2M NaH 2 PO 4, 14.5 ml 0.2M Na 2 HPO 4, 49 ml증류수를정량하여잘혼합한후여과하여사용한다 ( 실험용용액은 48시간내사용해야한다 ). 4. Iodine 염색약 Iodine crystal Potassium iodide Methanol (absolute) 50.0 ml D. W ml Iodine과 potassium iodide를정량하여유발로갈아잘녹인다음소량의증류수를가해완전히녹을때까지간다. 충분히녹인용액을적당한용량의갈색병에넣고메탄올과나머지증류수를정량하여잘혼합한다음여과하여사용한다. 526 감염병실험실진단제 1 부세균질환

69 5. Lugol s 요오드 (5% 보관용액 ) Iodine crystal Potassium iodide 10.0 g D. W ml Iodine과 potassium iodide를정량하여유발로갈아잘녹인다음소량의증류수를가해완전히녹을때까지간다. 충분히녹인용액을적당한용량의갈색병에넣고나머지증류수를정량하여잘혼합한다음여과하여사용한다. 6. Lugol s 요오드 ( 습식표본제작을위한 1% 용액 ) Lugol s 요오드 (5% 보관용액 ) 식염수용액, 등장액 5 ml 20 ml 5% Lugol s 보관용액 5 ml을식염수 20 ml에희석하여사용한다. Lugol s 요오드보존용액은대변의습식표본제작에매우적합하다. 즉기생충은덩어리속에숨어보이지않을수있기때문에 Lugol s 보관용액으로희석시켜야한다. 7. Malachite green 염색약 시약성분 3% malachite green 수용액 l6 ml glycerin 500 mg 6% phenol 500 mg 각시약을정량하여혼합한다음잘녹여서사용한다. 배지및시약 527

70 8. Methylene blue 염색약 1) 보존용액 Methylen blue 14 g 95% 알코올 100 ml 2) 실험용액 보존용액 20 ml 증류수 180 ml 보존용액 20 ml을정량하여증류수에넣어잘혼합하여사용한다. 9. Mounting 용액시약성분 0.1 M PBS 10 ml p-phenylenediamine 100 mg Glycerol 90 ml 각시약을정량하여충분하게용해시킨다음적당한용기에소분하여 -20 에서냉동보관한다. 10. Wayson 염색약 1) 염색약 1 Basic fuchsin Methylene blue Ethanol(95%) 0.2 g ml Basic fuchsin 과 methylene blue 를정량하여에탄올에넣어잘혼합하여용해한 528 감염병실험실진단제 1 부세균질환

71 후 Whatman No.1 여과지로여과한다. 2) 염색약 2 Phenol (aqueous) 5.0 ml D. W ml 각염색약 1 과 2 를혼합하고갈색병에담아실온에보관하여사용한다 (5 년간유효 ). 11. Ziehl-Neelsen 염색약 1) 염색약 Fuchsin액 ( 용액 1) Basic fuchsin 3.0 g 95% ethanol 100 ml Basic fuchsin을정량하여 ethanol에넣어잘혼합하여용해시킨다. Phenol 액 ( 용액 2) Phenol crystals D. W. 100 ml phenol crystal을정량하여증류수에넣고가온하여녹인다. 사용염색약은용액 1:10 ml과용액 2:90 ml을혼합한다음갈색병에넣어실온에보관한다. 6~12 개월간사용이가능하며, 사용시여과하여사용한다. 2) 탈색액 (3% hydrochloric acid) Hydrochloric acid (Conc.) 3 ml 95% Ethanol 97 ml 배지및시약 529

72 Hydrochloric acid를정량하고 ethanol을조심스럽게가하여잘혼합한다. 실온에서 6~12개월간사용가능하다. 3) 대비염색액 Methylene blue chloride 0.3 g D. W. 100 ml Methylene blue를정량하여증류수에넣어잘혼합하여녹인다음갈색병에보관하면 6~12개월간사용가능하다. 530 감염병실험실진단제 1 부세균질환