화장품 미생물 허용 기준 및 시험법

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숙 배
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1 화장품미생물허용기준및시험법 1. 허용기준 o 눈화장용제품, 어린이용제품 : - 총호기성생균 ( 세균, 진균 ) 수 : 500 CFU/g(mL) 이하 - 대장균 (Escherichia coli), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 은제품 0.1g(ml) 에서검출되어서는안된다. 2. 시험대상제품 o 눈화장용제품류 : 아이라이너, 아이섀도, 마스카라, 아이메이크업리무버 o 어린이용제품류 : 어린이용샴푸, 어린이용로션및크림, 어린이용오일 ( 수분이함유되지않은제품의경우는제외한다.) 3. 미생물시험법 이시험법은화장품중의총호기성생균 ( 세균, 진균 ) 수를측정하고, 특정세균인대장균, 녹농균및황색포도상구균의유무를시험하는방법이다. 본시험법외에아래의시험법을적용할수도있다. o CTFA, Microbiology guidelines o Colipa, Guidelines on microbial Quality Management o 일본화장품공업연합회, 화장품미생물한도시험법 o 적절한방법으로검증된자동화장비를이용한시험법 3.1. 검체의전처리제품은무작위로선별하여그내용물의일부분을검체로한다. 검체조작은무균조건하에서실시하여야하며, 검체의특성에따라다음의각방법으로검체를희석, 용해, 부유또는현탁시킨다 수분산검체검체 1g(mL) 에희석액 9mL 을넣어 10 배로희석하고필요시추가로희석한다. 수분산검체란희석액에균일한성상으로분산가능한제형의검체를말하며, 가용화제형, O/W 유화제형등을포함한다 비수분산검체검체 1g(mL) 에폴리소르베이트 80 을 1mL 을넣어균질화시키고희석액 8mL 을넣어 10 배로희석하고필요시추가로희석한다. 균질화되지않을경우 5 mm 유리구슬 5~7 개 (3mm 유리구슬 10~15 개 ) 를넣어균질화시킨다. 비수분산검체란희석액에균일한성상으로용이하게분산되지않는제형의검체를말하며, W/O 유화제형, 분체제품등을포함한다 총호기성생균수시험법 1

2 총호기성생균수시험법은화장품중총호기성생균 ( 세균, 진균 ) 수를측정하는시험법이다. 총호기성생균수는검출된세균수와진균수의합으로한다 한천평판희석법 검액의조제레틴액체배지 (Modified letheen broth) 또는다른적당한항균작용이나타나지않는배지를사용하여 1) 항에따라검액을조제한다 배지 희석액하기의희석액을사용하는것을원칙으로하며 방부제중화능시험 을통해검증된다른희석액도사용가능하다. - 변형레틴액체배지 (Modified letheen broth) - 레틴액체배지 (letheen broth) - 카세인소화대두레시친폴리소르베이트 20 액체배지 (Casein Peptone Lecithin Polysorbate broth) - 디 - 이중화액체배지 (D-E Neutralizing broth) - 변형카세인대두소화액체배지 (Modified Tryptic soy broth) 검출용한천배지하기의검출용한천배지를사용하는것을원칙으로하며 방부제중화능시험 을통해검증된다른검출용한천배지도사용가능하다. - 변형레틴한천배지 (Modified letheen agar) - 레틴한천배지 (letheen agar) - 변형카세인대두소화한천배지 (Modified Tryptic soy agar) - 사브로우드덱스트로즈한천배지 (Sabouraud Dextrose agar) - 포테이토덱스트로즈한천배지 (Potato dextrose agar) 조작 세균수시험직경 8.5~10cm 페트리접시내에미리굳힌검출용한천배지표면에전처리된검액최소 0.1mL 씩을도말한다. 또는검액 1mL 씩을같은크기의페트리접시에넣고그위에멸균후 45 이하로식힌 10~20mL 의검출용한천배지를넣어잘혼합하고, 30~35 에서 48 시간배양한다. 이때 30~300 개의균집락을형성한평판을취한다음, 희석배율을곱하여이를세균수로한다 진균수시험세균수시험에따라시험을실시하되배지는검출용한천배지를사용하여배양온도 22~28 에서 3~5 일간배양한다. 이때 100 개이하의균집락을형성한평판을취한다음, 희석배율을곱하여이를진균수로한다 방부제중화능시험필요에따라다음의시험을실시한다. 표 1 의시험균주로완충식염펩톤수 (ph 7.0) 를사용하여시험균액을만든다. 검체를 10 배희석한희석액과검체를포함하지않는희석액에 1mL 당 100~300 개의생균이함유되도록시험균액을접종한다. 각각을시험군과대조군으로하여총호기성 2

3 생균수시험을실시하며시험군과대조군의균수를비교하여 50% 이상의차이가나타나서는안된다. 표 1. 방부제중화능시험용균주및배양조건 시험균주 Staphylococcus aureus KCTC 3881 (ATCC 6538) Pseudomonas aeruginosa KCTC 2513(ATCC 9027) Escherichia coli KCTC 2571(ATCC 8739) Candida albicans KCTC 17205(ATCC 10231) 배양 호기배양 30~35 에서 시간배양 호기배양 30~35 에서 48 시간배양 3.3 특정세균시험법총호기성생균수시험에서세균이검출되지않으면특정세균음성으로판정하고, 검출된경우특정세균시험을실시한다. 특정세균시험은다음의일반적인특정세균검출방법외에미생물동정용기기나키트를사용할수도있다 대장균시험법대장균은그람음성간균으로운동성을갖는장내세균이며, 유당을발효하여가스를생성하는통성혐기성세균을말한다. 시험방법은다음과같다 검액의조제및조작검출된세균의집락을백금이등으로취하여맥콘키한천배지위에도말하고 30~35 에서 18~24 시간배양한다. 주위에적색의침강선띠를갖는적갈색의그람음성균의집락이검출되지않으면대장균음성으로판정한다. 위의특정을나타내는집락이검출되는경우에는에오신메칠렌블루한천배지에서각각의집락을도말하고 30~35 에서 18~24 시간배양한다. 에오신메칠렌블루한천배지에서금속광택을나타내는집락또는투과광선하에서흑청색을나타내는집락이발견되면백금이등으로취하여발효시험관이든유당액체배지에넣어 44.3~44.7 의항온수조중에서 22~26 시간배양한다. 가스발생이나타나는경우에는대장균양성으로판정한다 배지 - 유당액체배지 - 맥콘키한천배지 - 에오신메칠렌블루한천배지 (EMB 한천배지 ) 녹농균시험녹농균은그람음성, 단모성또는쌍모성편모를가진무아포성간균이며운동성이있는호기성세균으로시험방법은다음과같다 검액의조제및조작검출된세균의집락을백금이등으로취하여세트리마이드한천배지나플루오레세인검출용녹농균한천배지 F 또는피오시아닌검출용녹농균한천배지 P 에도말하여 35~37 에서 72 시간배양한다. 그람음성간균으로세트리마이드한천배지에서연녹색이나청녹색집락이나타나거나, 플루오레세인검출용녹농균한천배지 F 의 3

4 집락을자외선하에서관찰하여황색을나타내거나, 피오시아닌검출용녹농균한천배지 P 의집락을자외선하에서관찰하여청색을나타나면옥시다제시험과이동성시험을실시한다. 집락을염화 N, N- 디메칠 p- 페닐렌디아민이묻은여지에옮겨 5~10 초이내에자색으로변색하면옥시다제양성이므로, 집락을이동성시험용배지에천자하여 24 시간배양한후이동성을관찰한다. 옥시다제시험과이동성시험에서양성이면카제인소화대두액체배지의 42 에서성장여부를실시하여성장하면녹농균양성으로판정한다 배지 - 카제인대두소화액체배지 - 플루오레세인검출용녹농균한천배지 F(Pseudomonas agar F for detection of fluorescein) - 피오시아닌검출용녹농균한천배지 P (Pseudomonas agar P for detection of pyocyanin) - 세트리마이드한천배지 - 이동성시험용배지 (motility test medium) 황색포도상구균시험황색포도상구균은그람양성무아포비운동성구균이불규칙하게포도송이모양으로배열되어있는호기성또는통성혐기성균으로서혈장응집반응이양성인균을말하며시험방법은다음과같다 검액의조제및조작증균배양된배양액을바드파커한천배지나 V-J 한천배지 (Vogel Johnson agar) 에도말하여 35~37 에서 24 시간배양한다. 그람양성구균으로 Bard Parker 한천배지에서균의집락이광택을띠는검정색이고집락주위에 2~5mm 의투명대가형성되거나, V-J 한천배지에서균의집락이검정색이고집락주위에황색투명대가형성되면응고효소시험을실시한다. 백금이등으로의심이되는집락을취하여포유류유래의 0.5mL 의혈장을포함하는시험관에접종하고대조군과함께 37 에서배양한다. 3 시간후에응고유무를 1 차확인하고그후 24 시간까지응고유무를확인한다. 응고가관찰되면황색포도상구균양성으로판정한다 배지 - V-J 한천배지 (Vogel-Johnson agar) - 바드파커한천배지 (Baird Parker agar) 4. 경과조치 4

5 o 본시험법은 2004 년 5 월부터시행하기로한다. o 다만본규약의시행에어려움이있는중소기업은별도의유예기간을설정할수있도록건의한다. o 본시험법의대상제품을제외한기타제품의경우는총호기성생균 ( 세균, 진균 ) 수가 1,000 CFU/g(mL) 이하가되어야한다 부록 : 희석액및배지 5

6 1. 완충식염펩톤수 인산이수소칼륨 3.56g 인산일수소나트륨 7.23g 염화나트륨 4.30g 펩톤 ( 육즙또는카페인 ) 1.0g 이상을달아로녹여 1L 로하고멸균후의 ph 가 7.0 이되도록조정하고 분간고압멸균한다. 2. 변형레틴액체배지 (Modified letheen broth) 치오톤펩톤 10.0g 프로테오즈펩톤 10.0g 카제인판크레아틴소화물 2.0g 육엑스 5.0g 효모엑스 5.0g 폴리소르베이트 g 레시틴 0.7g 아황산수소나트륨 0.1g 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 7.2±0.2가되도록조정하고 3. 레틴액체배지 (letheen broth) 프로테오즈펩톤 10.0g 육엑스 5.0g 폴리소르베이트 g 레시틴 0.7g 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 7.2±0.2가되도록조정하고 4. 카세인소화대두레시친폴리소르베이트 20 액체배지 (Casein-Peptone Lecithin Polysorbate broth)

7 카세인판크레아틴소화물 20.0g 대두레시친 5.0g 폴리소르베이트 ml 960mL 이상을달아에녹여 1L 로하고멸균후의 ph 가 7.0±0.2 가되도록조정하고 121 에서 15 분간고압멸균한다. 5. 디-이중화액체배지 (Dey-Engley Neutralizing broth) 포도당 10.0g 레시친 7.0g 치오황산나트륨 6.0g 카세인판크레아틴소화물 5.0g 폴리소르베이트 g 효모엑스 2.5g 아황산수소나트륨 2.5g 치오글리콜산나트륨 1.0g 제 1 인산칼륨 0.1g 브롬크레졸퍼플 0.02g 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 7.6±0.2가되도록조정하고 6. 변형카제인대두소화액체배지카제인판크레아틴소화물 17.0g 대두파파인소화물 3.0g 인산일수소칼륨 2.5g 포도당일수화물 2.5g 폴리소르베이트 g 레시틴 1.0g 1000ml 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 7.3±0.2가되도록조정하고 7. 변형레틴한천배지 (Modified letheen agar) 치오톤펩톤 10.0g 7

8 카제인판크레아틱소화물 10.0g 효모엑스 2.0g 육엑스 3.0g 포도당 1.0g 폴리소르베이트 g 레시틴 1.0g 아황산수소나트륨 0.1g 한천 20.0g 이상을달아에녹여 1L 로하고멸균후의 ph 가 7.2±0.2 가되도록조정하고 121 에서 15 분간고압멸균한다. 8. 레틴한천배지 (Modified letheen agar) 카제인판크레아틱소화물 5.0g 육엑스 3.0g 포도당 1.0g 폴리소르베이트 g 레시틴 1.0g 1000m L 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 7.2±0.2가되도록조정하고 9. 변형카제인대두소화한천배지 (Modified Tryptic soy agar) 카제인판크레아틴소화물 17.0g 대두파파인소화물 3.0g 인산일수소칼륨 2.5g 포도당일수화물 2.5g 폴리소르베이트 g 레시틴 1.0g 1000ml 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 7.3±0.2가되도록조정하고 10. 사브로우드덱스트로즈한천배지 (Sabouraud Dextrose agar) 네오펩톤 10.0g 8

9 포도당 40.0g 1000ml 이상을달아에녹여 1L 로하고멸균후의 ph 가 5.6±0.2 가되도록조정하고 121 에서 15 분간고압멸균한다. 11. 포테이토덱스트로즈한천배지 (Potato dextrose agar) 감자침출물 200.0g 포도당 20.0g 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 5.6±0.2가되도록조정하고 12. 글루코즈펩톤한천배지 (Glucose Peptone agar) 포도당 20.0g 효모엑스 2.0g 펩톤 5.0g 황산마그네슘 0.5g 인산이수소칼륨 1.0g 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 5.6~5.8이되도록조정하고 13. 유당액체배지 육엑스 3.0g 젤라틴판크레아틴소화물 5.0g 유당 5.0g 이상을달아에녹여 1L로하고 121 에서 15~20분간고압증기멸균한다. 멸균후의 ph가 6.9~7.1이되도록하고가능한한빨리식힌다. 14. 맥콘키한천배지젤라틴판크레아틴소화물 17.0g 9

10 카제인판크레아틴소화물 1.5g 프로테오즈펩톤 1.5g 유당 10.0g 담즙산염혼합물 1.5g 한천 13.5g 뉴트럴렛 0.03g 크리스탈바이올렛 1.0mg 이상을달아 1L 에녹여 1 분간끓인다음 121 에서 15~20 분간고압증기멸균한다. 멸균후의 ph 가 6.9~7.3 이되도록한다. 15. 에오신메칠렌블루한천배지 (EMB한천배지) 젤라틴판크레아틴소화물 10.0g 인산일수소칼륨 2.0g 유당 10.0g 에오신 0.4g 메칠렌블루 0.065g 이상을달아 1L에녹여 121 에서 15~20분간고압증기멸균한다. 멸균후의 ph가 6.9~7.3이되도록한다. 16. 카제인대두소화액체배지카제인판크레아틴소화물 17.0g 대두파파인소화물 3.0g 인산일수소칼륨 2.5g 포도당일수화물 2.5g 이상을달아에녹여 1L로하고멸균후의 ph가 7.3±0.2가되도록조정하고 17. 플루오레세인검출용녹농균한천배지 F(Pseudomonas agar F for detection of fluorescein) 10

11 카제인제펩톤 10.0g 육제펩톤 10.0g 인산일수소칼륨 1.5g 황산마그네슘 1.5g 글리세린 10.0mL 이상을달아에녹이고글리세린을넣어 1L 로한다. 121 에서 15 분간고압증기멸균하고 ph 가 7.2±0.2 가되도록조정한다. 18. 피오시아닌검출용녹농균한천배지 P(Pseudomonas agar P for detection of pyocyanin) 젤라틴판크레아틴소화물 20.0g 염화마그네슘 1.4g 황산칼륨 10.0g 글리세린 10.0mL 이상을달아에녹이고글리세린을넣어 1L로한다. 121 에서 15분간고압증기멸균하고 ph가 7.2±0.2가되도록조정한다. 19. 세트리마이드한천배지 (Cetrimide agar) 젤라틴의판크레아틴소화물 20.0g 염화마그네슘 1.4g 황산칼슘 10.0g 세틸트리메틸암모니움브로마이드 0.3g 한천 13.6g 이상을달아에녹이고글리세린을넣어 1L로한다. 121 에서 15분간고압증기멸균하고 ph가 7.2±0.2가되도록조정한다. 20. 이동성시험용배지 (motility test medium) 카제인의판크레아틴소화물 10.0g 한천 5.0g 이상을달아에녹여 1L로한다. 121 에서 15분간고압증기멸균하고 ph가 7.2 ±0.2가되도록조정한다. 21. V-J 한천배지 (Vogel-Johnson agar) 카제인판크레아틴소화물 10.0g 11

12 효모엑스 5.0g 만니톨 10.0g 인산수소칼륨 5.0g 염화리튬 5.0g 글리신 10.0g 페놀레드 25.0mg 이상을달아 1 분동안가열하여자주흔들어준다. 121 에서 15 분간고압멸균하고 45~50 로냉각시킨다. 멸균후 ph 가 7.2±0.2 가되도록조정하고멸균한 1%(w/v) 텔루린산칼륨 20 ml 를넣는다. 22. 바드파커한천배지 (Baird Parker agar) 글리신 12.0g 카제인의판크레아틴소화물 10.0g 피룰산나트륨 10.0g 육엑스 5.0g 염화리튬 5.0g 효모엑스 1.0g 한천 20.0g 950mL 이상을달아에녹여, 잘흔들면서 1분간끓인다. 121 멸균기에서 15분간멸균후 45 내지 50 까지식힌후멸균된텔룰린산칼륨용액 10 ml과 50 ml의난황에멀전을첨가한다. 12

Cosmetic Microbiology Mini Catalog 2019~2020

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