1. 개요 연구목적 가. 경쟁배타원리를이용하여김치유래의유산균이황색포도상구균의생장을억제시키는효능을실험적으로증명한후피부염의치료가능성에대해알아본다. 나. 기숙사생활을하는학생들이많이먹는학교급식김치의유산균을추출하여피부염치료에실제가능성을과학적실험으로밝힌다. 다. 김치에서유산균을추

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1 1. 개요 연구목적 가. 경쟁배타원리를이용하여김치유래의유산균이황색포도상구균의생장을억제시키는효능을실험적으로증명한후피부염의치료가능성에대해알아본다. 나. 기숙사생활을하는학생들이많이먹는학교급식김치의유산균을추출하여피부염치료에실제가능성을과학적실험으로밝힌다. 다. 김치에서유산균을추출하여그효능을밝히고실생활적용방법을고안한다. 연구범위 가. 유산균경쟁배타원리실험 1) 학교급식김치에서유산균을분리하여 16s RNA분석을통해김치유래유산균이맞는지확인한다. 2) O.D. 측정을통해유산균의생장에대해알아본후경쟁배타원리를적용한 paper disc 실험을통하여김치유산균이황색포도상구균의생장을억제시키는것을관찰한다. 나. 유산균을이용한피부세포실험 1) 항산화효과를측정하기위해 Cell viability실험과 DPPH 실험을한후유산균이피부세포염에어떤영향을주는지알아본다. 2) SOD와 GSH-px, COX-2 실험을통해유산균으로인한실제세포내의항산화효소및염증을일으키는유전자발현을알아본다. 다. 유산균이첨가된로션을제작하여경쟁배타원리를이용한실생활사용가능성실험증류수, 원심분리를통해얻어낸유산균액체배지의상층액, 유산균을배양한원액을각각의로션에넣어피실험자를대상으로항균효능을실험한다. 2. 연구수행내용 이론적배경및선행연구 가. 선행연구이미실험되어진김치유래유산균인 Lactobacillus plantarum 관련기존의연구에는김치종류에따른유산균의생물학적및기능적특징을알아보는실험 [1], 김치유래유산균의항균활성및항산화활성특징을알아보는실험 [2], 김치유래유산균의질병완화효과를알아보는실험 [3], 김치유래유산균의유전학적특성에관한연구 [4] 등이있다. 김치유래유산균의항균활성및항산화활성특징을알아보는실험에서는김치에서분리한 Lactobacillus plantarum 으로식중독원인세균에대한항균활성반응을관찰하는실험이알려져있으며, 질병완화효과를알아보는실험에는김치유산균의암예방효과실험이알려져있다. 그러나 2008년규명된김치유산균인 Weissella cibaria 에관한연구는

2 아직많이부족하다. 나. 이론적배경 1) 김치유산균 [5] 가 ) 김치의발효과정동안증식하는유산균으로장까지살아가는강력한유익균이다. 나 ) 김치유산균의특징 (1) 당의농도에크게상관없으며영양환경이열악한상황에서도생식이가능하다. (2) 다양한미생물과도공존할수있다. 2) 락토페린 (Lactoferrin), 타가토스 (Tagatose) 가 ) 락토페린 : 항균성펩티드로써유해세균의철분을흡수하여생장을억제시키고, 세포막을직접뚫고들어가사멸시켜버리는살균작용을한다.[6] 나 ) 타가토스 : 과일, 우유, 치즈등에존재하는천연당류이다. 이것은장에서탄수화물이포도당으로분해하는것을감소시켜흡수를억제하고, 간에서는포도당을글리코겐으로빠르게전화시켜주어식후혈당조절에도움을준다. 이런특징으로현재당뇨환자들의혈당수치조절을위해사용되고있다.[7] 3) 피부각질세포 (HaCaT cell) 가 ) 인체유래정상피부각질세포 HaCaT는피부재생, 미백과관련된실험에서많이사용되고있다. 나 ) 실험에사용된 HaCaT 세포주 ( 부산대학교김치연구소에서제공받음 ) 로 Dulbecco s modified Eagle medium(dmem, Gibco BRL, Paisely, UK) 에 10%(v/v) fetal bovine serum(fbs, Gibco BRL) 과항생제를첨가한후 37, 5% 의배양기 (Model 3154, Forma Scientific Inc, Marietta, OH, USA) 에서배양하였다. 세포는 T75 세포배양용 flask(nunc, Ro-chester, NY, USA) 의 80% 정도자랐을때세포의탈착을위하여 PBS로가볍게세척한다음, 0.05% typsin-0.02% EDTA(Gibco BRL) 를처리한후, 37 에서 5분간방치한후세포를채집하였다. 4) 활성산소와피부염의관계 [8] Oxygen free radical 로부터파생된여러가지산소화합물을말하며필요이상의활성산소가생성될경우에인간에게해를입힌다. 자외선, 방사선및다양한화학물질등이활성산소과다생성의원인이며피부염이나노화등을일으킨다. 가 ) SOD(superoxide dismutase): 활성산소발생을억제하는효소로우리몸에서자연스럽게형성되는항산화효소를말한다. 살균기능을수행하고남은산소가몸속에서유익한세포를공격할때 SOD(superoxide dismutase) 가활성산소를과산화수소로전환시킨다. [9] 나 ) GSH-px(glutathione peroxidase): 환원형의글루타치온을이용하여독성의과산화물을알코올유도체와물로전환시킴으로써과산화물에의해세포막이나세포가파괴되는것을방지한다. [10]

다 ) COX-2: 혈관을확장시키고혈전을예방해주는 Prostaglandin 1-2을만들뿐만아니라염증을유발하는 Prostaglandin E-2을만들어내는효소다.

대부분의생물에게널리분포하며유기분자의산화에너지를인산결합에너지의형태로보존하는효소이다. [12] 연구주제의선정 가.

발병동안가장힘든점은가려움으로치료를위해서화장품이나식단조절, 한방치료등다양한방법을사용했으며그중양약치료의의존도가가장높았다.

3 다 ) COX-2: 혈관을확장시키고혈전을예방해주는 Prostaglandin 1-2을만들뿐만아니라염증을유발하는 Prostaglandin E-2을만들어내는효소다. [11] 라 ) GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase): EC 해당계의가장중요한단계중의하나를촉매하는효소다. 대부분의생물에게널리분포하며유기분자의산화에너지를인산결합에너지의형태로보존하는효소이다. [12] 연구주제의선정 가. 먼저기숙사생활을하는친구들중피부염을앓았거나, 현재앓고있는경험실태를조사하기위해 73명을대상으로설문조사를했다. 그결과피부염을가진사람은 27명으로조사자중 37% 로나타났다. 발병동안가장힘든점은가려움으로치료를위해서화장품이나식단조절, 한방치료등다양한방법을사용했으며그중양약치료의의존도가가장높았다. [ 그림 1] 피부염경험자수조사 [ 그림 2] 피부염으로가장고통스러움부분조사 설문조사결과피부염치료에대해서많은어려움을가지고있었다. 그이유는정확 하지않은발병원인과그치료효과가분명하지않아치료가어려워새로운치료방법이 필요하다는사실을알게되었다. [ 그림 3] 피부염을개선하기위해노력한점 [ 그림 4] 피부염의치료의문제점인식 나. 친환경적인김치유산균과피부염을일으키는한종류인황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 사이에서경쟁배타원리를적용해봄으로써그치료효능에

4 대해서연구를계획하게되었다. 다. 실제피부세포를이용하여항산화효소효능실험을한후유산균으로로션제작가능성을알아보고실생활에서경쟁적배타원리를이용한유산균의치료가능성에대해연구하고자한다. 연구방법 가. 김치유래유산균분리및확인 1) 유산균분리 : 김치상층액을 10단계희석법으로희석한후 배지에도말하여투명환을확인한다. 2) 유산균확인 : 그람 (Gram) 양성반응실험과카탈라아제 (Catalase) 음성반응실험을통하여유산균이맞는지확인한다. 3) 16sRNA 분석을통해유산균임을확인한다. 나. O.D. 측정유산균과황색포도상구균을시간대별로 O.D를측정하여균의생장정도를시간대별로확인한다. 다. paper disc 실험을통한경쟁배타원리실험 paper disc 실험시, 유산균과황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 을 으로맞추어조건을같게한다. LB agar배지에황색포도상구균을도말하고, 각각의 disc에유산균을접종하여나타나는투명환으로경쟁배타원리를확인한다. MRS agar 배지에유산균을도말하고, 각각의 disc에황색포도상구균을접종하여확인한다. 라. Weissella cibaria를이용한피부세포 (HaCaT cell) 실험 1) Cell viability 측정 2) DPPH test 3) 항산화효소활성 test : superoxide dismutase(sod), glutathione peroxidase(gsh-px) 의활성을측정 4) 항산화효소유전자발현정도를 PCR로확인마. Weissella cibaria 배양상층액 paper disc실험경쟁배타원리실험에서유산균으로는 Weissella cibaria를사용하였고, 실시한세포실험은 Weissella cibaria의상층액을사용하였다. 본실험에서는 Weissella cibaria균과상층액의효능을증명하기위해 paper disc 실험, 피부세포실험을진행하였다. 바. 로션을제조하고 Weissella cibaria의효능측정본연구에서사용되는유산균의효능을실생활에적용시켜보기위하여각각의로션에증류수, 원심분리를통해얻어낸유산균액체배지의상층액, 유산균을배양한원액을넣는다. 피실험자의손에각각오염물질이있다고생각되는물질을만지게한후항균효능을측정한다.

5 연구활동및과정 가. 김치유산균분리및확인 1) 유산균분리 ( )[2] 가 ) 김치를믹서기로파쇄하였다. 나 ) 김치상정액을 10단계희석법으로희석하고이를통해균수를줄여육안으로각각분리된유산균을확인한후독립된유산균을분리한다. 다 ) 김치속의유산균을확인하기위해 고체평판배지에 10단계희석한용액을도말하여투명환을관찰한다. 유산균의젖산성분과 의염기성이서로중화반응을하여투명환을나타내므로, 유산균과다른균을구분할수있다. 라 ) 투명환이가장큰유산균콜로니를백금이로떠서삼분도말하여유산균을분리해낸다. 2) 유산균확인실험 가 ) 그람 (Gram) 염색양성확인실험 ( )[2] (1) 슬라이드글라스에증류수한방울을떨어뜨린후, 유산균한콜로니를떠서넓게 도말한다. (2) 크리스탈바이올렛 (1 차염색제 ) 으로 1 분동안염색한후, 물로씻어낸다. (3) 그람요오드 ( 매염제 ) 로 1 분동안염색한후, 물로씻어낸다. (4) 알코올 95%( 탈수 ) 를 30 초동안떨어뜨린후, 물로씻어낸다. (5) 사프라닌 (2 차염색제 ) 으로 45 초동안염색한후, 물로씻어낸다. (6) 현미경으로관찰한다. (7) 염색결과그람양성균임을확인한다. 나 ) 카탈라아제 (Catalase) 실험 (~8/1)[2] (1) 배양된유산균에과산화수소수를떨어뜨린다. (2) 거품이발생하는지에따라양성, 음성반응을확인한다. 3) 16sRNA 분석 제노텍 자문내용 투명환이만들어지더라도 분석으로정확한종명확인필요 회분석의뢰 나. O.D 측정 ( ~)[2] 1) MRS broth 배지 5mL 에유산균을접종시키고 LB broth배지 5mL에황색포도상구균을접종시킨다. 2) 주어진표를따라서 4세트배양시킨다.

6 표 실험조건 실험군 실험군 실험군 배지 3) spectro photometer를컴퓨터에연결한다. 4) visible on shutter off 상태로 dark 버튼을누른다. 5) reference 용액을넣고 reference 버튼을누른다. 6) 배지 1600ul에측정하고자하는균을 400ul을넣고 absor 버튼을누른다. 7) edit-copy data를누른후엑셀에붙여넣기하여그래프로만든다. 다. 유산균의황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 에대한경쟁배타원리실험 ( ~)[2],[14] 1) 유산균과황색포도상구균을원심분리하여 로맞춘다. 자문내용 : disc에올리는유산균과황색포도상구균의농도를맞춰실험의정확도를높인다. 보다낮을시, 농축이필요하므로원심분리가필요하고 보다높을시, 증류수를이용한희석이필요하다. 2) LB agar배지와 MRS agar배지에유산균과황색포도상구균을모두키워본후적합한배지를선택한다. 자문내용 : 일반적으로 MRS agar배지에서유산균이잘자라고, LB agar배지에서황색포도상구균이잘자란다고알려져있는데실제로그러한지확인을권하였다. 3) LB agar배지에유산균과황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 을각각 0.2ml씩넣고도말한다. 4) 멸균시킨거름종이를펀치로잘라각각유산균과황색포도상구균을 1μl씩떨어뜨린다. 5) 유산균을도말한곳에는황색포도상구균을떨어뜨린거름종이를, 황색포도상구균을도말한곳에는유산균을떨어뜨린거름종이를핀셋으로 3개씩삼각형이되도록올린다. 6) 항온기에 24h 배양시켜유산균과황색포도상구균의경쟁배타원리를관찰한다. 라. 유산균을활성화시키는물질을이용한김치유산균과황색포도상구균의경쟁배타원리

7 실험 1) 락토페린 (Lactoferrin) 에대한유산균의활성과황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 에대한반응실험가 ) 유산균과황색포도상구균을원심분리하여 로맞춘다. 나 ) LB Agar배지에황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 을 0.2ml 넣고도말한다. 다 ) 멸균시킨거름종이를펀치로잘라유산균을 5μl떨어뜨린다. 라 ) 황색포도상구균을도말한평판배지에유산균을떨어뜨린거름종이를핀셋으로 2개씩올린다. 마 ) 유산균을떨어뜨린 disc에락토페린을떨어뜨린다. 바 ) 항온기에 24h 배양시켜유산균과황색포도상구균의경쟁배타원리를관찰한다. 2) 타가토스 (Tagatose) 에대한유산균의활성과황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 에대한반응실험가 ) 유산균과황색포도상구균을원심분리하여 로맞춘다. 나 ) LB Agar배지에황색포도상구균을 0.2mL넣고도말한다. 다 ) 멸균시킨거름종이를펀치로잘라유산균을 5μl떨어뜨린다. 라 ) 황색포도상구균을도말한평판배지에유산균을떨어뜨린 disc를핀셋으로 2개씩올린다. 마 ) 유산균을떨어뜨린 disc에타가토스를떨어뜨린다. 바 ) 항온기에 24h 배양시켜유산균과황색포도상구균의경쟁배타원리를관찰한다. 마. 세포실험 1) Cell viability 조사 ( ~ 가 ) Weissella cibaria 배양한후상층액을농도별 50, 100, 200으로처리한다. 나 ) 24시간배양한후 MTT assay 방법으로세포의생존률을측정하였다. 2) DPPH 실험을통한세포의생존률조사 ( ~)[14] 가 ) DPPH를 150 의농도로메탄올에녹인다. 나 ) Weissella cibaria균을 10배, 50배, 100배, 200배, 1000배희석시킨다. 다 ) DPPH 용액을희석시킨균에각각혼합하여암소에서 30분반응시킨다. 라 ) 517 nm에서흡광도를측정한다. 자문내용 DPPH 용액은항산화물질이있을때노란색으로변한다. 균원액의경우 ph가세포실험에적합하지않아희석해서사용함을자문받음. 3) 항산화효소 (SOD, GSH-px) level 확인 ( ~)[14]

8 가 ) Weissella cibaria를 24시간배양후원심분리하여상층액을얻는다. 나 ) 500 의과산화수소를처리하여 4시간방치하고, 세포배양액을제거한후 0.1 M의 PBS(pH 7.4) 로 3번세척하여세포를모아 sonication 한다음에 4, 10,000rpm 에함량을측정하고, 세포상층액을이용하여항산화효소의활성을측정하였다. (1) SOD(superoxide dismutase) 활성화 ( 가 ) SOD는 pyrogallol의자동산화율이억제되는양을측정하는 Marklund와 Marklund[15] 의방법으로측정하였다. ( 나 ) 50 mm PBS(pH 8.2) 8.7mL에세포상등액을넣은후 0.3 ml의 3mM pryogallol 용액을첨가한다. UV/VIS spectro-photometer 를이용하여 325 nm에서흡광도를측정한다. (2) GSH-px(glutathione peroxidase) 활성화측정 ( 가 ) GSH-px 활성도는 Lawrence와 Burk[16] 의방법으로측정하였다. ( 나 ) 340 nm에서 NADPH의산화로인한흡광도감소율을측정한다. 4) 항산화효소유전자발현 (SOD, GSH-px) RT-PCR(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) 분석 ( ~)[14] [ 그림 5] 항산화효소유전자발현 ( 확인 ) 가 ) HaCaT 인체피부가질세포를배양하여 LAB 상층액을 HaCaT 세포에처리한후 PBS로세척하여 trizol로이용하여 total RNA를분리하였다. 나 ) Oligo dt primer (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 를사용하면분리한 RNA 중 mrna가모두 cdna로만들어지기때문에분리된 RNA를정량한후, oligo dt primer 와 AMV reverse transcriptase를이용하여 2 μg의 RNA에서 mrna에상보적인 ss cdna로역전사시킨다.

9 다 ) 이 cdna를 template 로사용하여 SOD, GSH-px 및 COX-2유전자를 polymerase chain reaction(pcr) 방법으로특정유전자부위를증폭하였다. 이때 internal control 로 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(gapdh) 를사용하였다. 각 PCR 산물들을 2% agarose gel을이용하여전기영동한다. 라 ) ethidium bromide (EtBr, sigma, USA) 를이용하여염색한후 UV light에서확인하였다. 바. Weissella cibaria 상층액 paper disc 실험 1) Weissella cibaria 상층액을 LB배지에도말한후황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의생장을확인한다. 2) 락토페린, 타가토스를넣어 Weissella cibaria 상층액만넣었을때와비교한다. 표 상층액의황색포도상구균에대한경쟁배타원리실험 대조군 실험군 실험군 유산균 첨가물질 락토페린 타가토스 사. Weissella cibaria을이용한로션제조후항균효능확인실험 [17] 1) 2개의비커에수상층과유상층을각각계랑한다. 2) 핫플레이트 (hot plate) 를 70 까지올려준다. 3) 수상층을먼저올려 50 로가열된후에유상층을가열시킨다. 수상층의온도는빨리올라가지않으므로먼저가열을해야한다. 4) 유상층과수상층이 70 까지가열되면유상층을수상층에붓는다. 5) magnetic bar를이용하여점도가높아질때까지충분히섞는다. 6) 점도가높아진로션을찬물이담긴비커에담그고찬물에식힌다. 7) 로션의온도가 35 까지떨어지면나머지첨가물을넣고, 소독된비커 3개로나누어담는다. 8) 준비된증류수, 원심분리를통해얻어낸유산균액체배지의상층액, 유산균을배양한원액을각각의로션에넣는다. 9) 동일한조건에있던피실험자를대상으로각각의손에로션을충분히흡수시킨후각각의손가락을 LB agar 배지에찍는다. 3. 연구결과및시사점 연구결과 가. 유산균의투명환확인 1) 배지에김치유래유산균희석액을도말하여유산균주위로나타난투명환을관찰한다. 독립되어나타난콜로니주위로투명환이가장크게나타난균을본실험을위한목적균으로선별하였다. 10단계희석도말을통해희석배수가증가할수록

10 독립된콜로니를뚜렷하게확인할수있었다. [ 그림 6] 10 단계희석도말 2) 삼분도말 : 유산균순수분리를위한여러가지도말법중하나로획선이증가할수록 독립된콜로니를확인할수있었다. 고체평판배지에서투명환을관찰하 였다. [ 그림 7] MRS 삼분도말 [ 그림 8] 유산균투명환 나. 유산균확인 1) 그람 (Gram) 염색 : 그람염색후현미경으로관찰한결과유산균의특징인양성반응을 확인하였다. [ 그림 9] 유산균그람 (Gram) 염색 2) 카탈라아제 (Catalase) test: 유산균과황색포도상구균을카탈라아제실험한결과, 황색 포도상구균만거품이관찰되었다. 반면, 유산균은거품이관찰되지않았으므로음성반 응으로판정하였다. [ 그림 10] 유산균의음성반응 [ 그림 11] 황색포도상구균의양성반응

11 3) 유산균 16sRNA 분석을통한종판별 Sequences producing significant alignments: Score E (bits) Value dbj AB Weissella sp. NBRC gene for 16S rrna dbj AB Weissella cibaria gene for 16S rrna, partia dbj AB Weissella cibaria gene for 16S rrna, partia emb AJ Weissella cibaria 16S rrna gene, strain ACA 자문내용 : 김치연구소에서 16sRNA 분석을해야함을자문, 김치유래유산균이라고추출해낸유산균을 9.23일제노텍에 16sRNA 분석의뢰결과유산균이아니라는판정을받고, 이어서 10.02일에한번더의뢰, 10.11일에실험에사용하는유산균이 Weissella cibaria이라고판정되었다. 다. O.D. 측정을통한생장변화측정 [ 그림 12] Weissella cibaria [ 그림 13] Weissella cibaria + Lactoferrin [ 그림 14] Staphylococcus aureus [ 그림 15] Weissella cibaria + Staphylococcus aureus

12 Weissella cibaria 는시간이지남에따라생장이활발하게나타났다. 락토페린을넣은 경우는 Weissella cibaria 단독배양보다그생장이활발하였지만타가토스는생장촉진의 효능이분명하지않았다. [ 그림 16] Weissella cibaria + Tagatose [ 그림 17] Weissella cibaria, Staphylococcus aureus, Weissella cibaria + Staphylococcus aureus 생장량변화비교 MRS 액체배지에서황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의경우, Weissella cibaria 와같이배양하는경우에단독배양과비교하여생장률이낮게나타났고, 시간이지날수록차이가커지는경향을보여 Weissella cibaria와황색포도상구균을혼합배양하는경우생장을저해하는영향을주고있다고생각된다. 라. Weissella cibaria 과황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의경쟁배타원리실험 [ 그림 18] paper disc 실험 그람양성반응, 카탈라아제음성반응을나타낸 Weissella cibaria 를 paper disc 를 한후경쟁배타효과를비교한결과 Weissella cibaria 는황색포도상구균의생장을저해 하였다. 마. Weissella cibaria 를활성화시키는물질을이용한김치유산균과황색포도상구균의경쟁 배타원리실험

1) Weissella cibaria 의황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 에대한항균효능실험결과 표 3.

Staphylococcus aureus, paper disc: Weissella cibaria) 실험 결과 유산균 Weissella cibaria

2) 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의 Weissella cibaria 에대한항균효능실험결과 표 4.

Staphylococcus aureus) 실험 결과 유산균 Weissella cibaria Weissella cibaria 추가물질 락토페린 타가토스

13 1) Weissella cibaria 의황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 에대한항균효능실험결과 표 3. Weissella cibaria 의황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 에대한항균효능을이용한경 쟁배타원리결과 ( 배지 : Staphylococcus aureus, paper disc: Weissella cibaria) 실험 결과 유산균 Weissella cibaria Weissella cibaria Weissella cibaria 추가물질 락토페린 타가토스 Weissella cibaria균이황색포도상구균과의경쟁배타원리실험에서 inhibition zone이나타났다. 그리고유산균을활성화시키는락토페린, 타가토스를넣어유산균만넣었을때랑비교해본결과, 락토페린을넣었을때, inhibition zone이더크게나타나경쟁배타원리효능을증가시킨다. 2) 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의 Weissella cibaria 에대한항균효능실험결과 표 4. 황색포도상구균의 Weissella cibaria 에대한항균효능으로경쟁배타원리결과 ( 배지 : Weissella cibaria, paper disc : Staphylococcus aureus) 실험 결과 유산균 Weissella cibaria Weissella cibaria 추가물질 락토페린 타가토스 Weissella cibaria을도말하고황색포도상구균을접종한 disc와의경쟁배타원리실험에서 inhibition zone이나타나지않았다. 그리고락토페린, 타가토스를넣어황색포도상구균만넣었을때랑비교해본결과, 역시 inhibition zone이나타나지않았다. 결과적으로 Weissella cibaria에의해황색포도상구균의생장이저해된것을알수있다. 바. HaCaT 피부세포실험 1) Cell viability, DPPH 실험결과

Cell viability 실험결과 50배 ~100에서거의 80% 에가깝게생존하였고 DPPH 실험에서도 50배에서소거기능이높게나타나실험에사용되는최적농도는 50배희석이적당함을알게되었다.

14 [ 그림 19] Cell viability 실험결과 [ 그림 20] DPPH 실험결과 자문내용 희석배수가낮을수록 ph 값이낮아져산성을띄었고, 희석배수가높을수록 ph값이높아져염기성을띄었다. 따라서실험은 50배 ~200 배에서실시하기로결정하였다. Cell viability 실험결과 50배 ~100에서거의 80% 에가깝게생존하였고 DPPH 실험에서도 50배에서소거기능이높게나타나실험에사용되는최적농도는 50배희석이적당함을알게되었다. 2) 항산화효소 (SOD level, GSH-px) level 실험결과 [ 그림 21] SOD level 결과 [ 그림 22] GSH-px level 결과 항산화효소인 SOD(superoxide dismutase) 와 GSH-px 의농도가 Weissella cibaria 상층액 의농도가높아질수록높게나타났다. 3) 항산화효소유전자발현 PCR 실험결과

[ 그림 23] 항산화효소유전자발현결과 자문내용 : 먼저 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 의발현정도가일정하므로결과값을비교하기에적합한조건이다.

항산화효소인 SOD(superoxide dismutase) 와 GSH-px(glutathione peroxidase) 의발현정도는 50배, 200배의차이가확실하진않지만 50배일때효과가좋은것을볼수있다.

Weissella cibaria 배양상층액 paper disc 실험 표 5.

15 [ 그림 23] 항산화효소유전자발현결과 자문내용 : 먼저 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 의발현정도가일정하므로결과값을비교하기에적합한조건이다. 항산화효소인 SOD(superoxide dismutase), GSH-px(glutathione peroxidase) 의발현정도는뚜렷해야하고, 염증을유발하는효소인 COX-2의발현정도는낮아야염증억제에효능이있다고자문받았다. 항산화효소인 SOD(superoxide dismutase) 와 GSH-px(glutathione peroxidase) 의발현정도는 50배, 200배의차이가확실하진않지만 50배일때효과가좋은것을볼수있다. COX-2의발현정도는 H 2 O 2 에서발현되는것보다는 50배희석했을때낮게나타나세포염억제효능이있다는것을알게되었다. 결과적으로 50배희석액이세포염억제에가장효능이있었다. 사. Weissella cibaria 배양상층액 paper disc 실험 표 5. Weissella cibaria 상층액의황색포도상구균에대한항균효능을이용한경 쟁배타원리실험결과 실험 결과 Weissella cibaria Weissella cibaria Weissella cibaria 유산균상층액상층액상층액추가물질락토페린타가토스 Weissella cibaria 상층액이황색포도상구균과의항균효능실험에서 Weissella cibaria 균원액을이용한 paper disc 실험보다더뚜렷하고큰 inhibition zone이나타났다. 그리고상층액에서유산균을활성화시키는락토페린, 타가토스를넣어비교결과락토페린을넣은경우의 inhibition zone이가장크게나타나경쟁배타원리효능을증가

시켰음을알게되었다. 아. Weissella cibaria 을이용한로션제조및항균효능실험 그림 로션조제 그림 로션실험결과 증류수, 유산균을배양한원액, 원심분리를통해얻어낸유산균액체배지의상층액각각을접종한로션을바른결과, 증류수를접종한로션에비해 Weissella cibaria 배양상층액과원액을접종한로션의효능이뛰어남을알수있다.

김치유산균중 Weissella cibaria 는배양시작후그생장이활발해지며 MRS broth에서 Weissella cibaria는황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의생장을느리게하여경쟁배타원리가적용됨을알수있었다.

16 시켰음을알게되었다. 아. Weissella cibaria 을이용한로션제조및항균효능실험 그림 로션조제 그림 로션실험결과 증류수, 유산균을배양한원액, 원심분리를통해얻어낸유산균액체배지의상층액각각을접종한로션을바른결과, 증류수를접종한로션에비해 Weissella cibaria 배양상층액과원액을접종한로션의효능이뛰어남을알수있다. 또한균의생장정도를비교하였을때상층액을접종한로션의효능이가장뛰어났음을알수있었다. 시사점 가. 학교급식에서제공되는김치에서유산균을찾기위해 배지에배양하여육안으로투명환이발견된종에대해서 16sRNA를분석하였다. 그결과우리가찾은유산균은 Weissella cibaria이었고효능이많이알려지지않은균이라피부염에어떤효능을발휘하는지에대해연구하기로하였다. 나. 김치유산균중 Weissella cibaria 는배양시작후그생장이활발해지며 MRS broth에서 Weissella cibaria는황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의생장을느리게하여경쟁배타원리가적용됨을알수있었다. 또한 MRS agar를이용한 paper disc 실험에서 Weissella cibaria 주변에투명환이관찰되어경쟁배타원리에의해황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의생장을저해함이육안으로관찰되었다. 이를통해두종사이에경재배타원리가적용되었음을알수있다. 다. 피부세포실험에서 Weissella cibaria 배양상층액의여러가지농도중 50배에서항산화효소의활성이높았으며 COX-2 유전자발현은배양상층액 50배에서가장희미하게나타나 Weissella cibaria가피부염억제효능치료제개발에적합한농도로생각한다. 라. 피부세포실험후 Weissella cibaria 배양상층액을이용한 paper disc 실험을한결과배양상층액으로도경쟁배타원리가적용되었고, 락토페린이그효능을증가시킬수있다는것을알게되었다. 또한그효능을증진시키는추가연구가더필요하다고생각한다. 마. Weissella cibaria을활용한로션실험에서균의생장정도를측정하니생장이억제되어

17 앞으로피부염억제등실생활에활용가능성이높다고생각한다. 바. 우리는이연구를통해조상들의위대한김치유산의가치를다시한번생각하게되었으며그효능을알아보기위해서학교에서배우는원핵생물의특징, 첨단기자재, 효능을나타내기위한컴퓨터활용, 그래프해석등다양한분야를아우르는 STEAM 능력을길렀다. 사. 미생물실험에대해전혀알지못하였는데 STEAM R&E 활동으로기본적인미생물실험방법을익혔다. 특히이번실험에서김치유산균이만들어내는젖산과탄산칼슘의만남으로배지가투명해지는현상을통해투명한유리, 불투명한유리제작에활용할가능성등또다른새로운연구과제에대해서생각하는계기가되었다. 4. 홍보및사후활용 가. Weissella cibaria의연구결과를식품영양학회지에투고나. 김치유산균 Weissella cibaria를 Lactobacillus plantarum 의효능과비교하여제3회미생물탐구페스티벌에참여예정다. 2014년 MOU를맺은브루나이 Maktab Duli Pengiran Muda Al-Muhtadee Billah 에서 International Student Forum에참여예정 5. 참고문헌 [1] 고강희, 2013년, 김치종류에따른유산균의생물학적및기능적특성 (Biological and Functional Characteristics of Lactic Acid Bacteria in Different Kimchi) [2] 송유진, 2009년, 김치에서분리한세균인 Lactobacillus plantarum YK-9의식중독원인세균에대한항균활성및특성 [3] 박건영, 2000년, 김치유산균의항돌연변이및항암효과 [4] 전상록, 2009년, 유산균 Weissella cibaria의 Bacteriophage 분리및유전학적특성에관한연구 [5] 김치유산균, [6] &categoryid= [7] 8A%A4 [8] [9] begintime=0&jumpingvid=&from=section&redirect=log&widgettypecall=true [10]

18 [11] CategoryNo=41&viewDate=&currentPage=1&listtype=0 [12] [13] 컨슈머타임스 (EBS 가족건강프로젝트 ' 아토피탈출기 ' 13일방송 ) [14] 정현수, 2005년, Studies on Lactobacillus spp. and Artemisia extract inhibiting Staphylococcus aureus - 황색포도상구균을저해하는유산균및쑥추출물에관한연구논문 [15] Marklund S, Marklund G Involvement of the superoxide anion radical in the antioxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Bio-chem 47: [16] Lawrence RA, Burk RF Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient rat liver. Biochem Biophys Res Conmmun 71: [17]

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,