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서라 신
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1 Korean J. Microbiol. Biotechnol. Vol. 39, No. 3, (2011) 유산발효에의한발효한약의기능분석 강동희 김현수 * 계명대학교자연과학대학미생물학과 Received : February 1, 2011 / Revised : June 15, 2011 / Accepted : June 16, 2011 Functionality Analysis of Korean Medicine Fermented by Lactobacillus Strains. Kang, Dong Hee and Hyun-Soo Kim*. Department of Microbiology, College of Natural Science, Keimyung University, Daegu , Korea Through the process of fermentation with Lactobacillus strains this study has evaluated the functionality of the traditional Korean medicine Bangpungtongsungsan after the addition of four other medicinal ingredients. In order to facilitate the growth of the Lactobacillus strains brown sugar was added to the herbal substances used. For both DPPH radical scavenging activities and SOD-like activities the medicinal mixture, when fermented through heterogeneous co-cultures, scored higher (at 77% and 42%, respectively) than when not fermented (at 31.7% and 36.3%, respectively). The co-cultured Korean medicine inhibited the growth of Bacillus subtilis PCI 219, Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004, Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC 1916 and Propionibacterium acnes KCTC The inhibiting effects on β-hexosaminidase released from RBL-2H3 cells caused by the mixture, with and without fermentation, was seen to be similar (57% and 60%, respectively). Key words: Lactic acid bacteria, Bangpungtongsungsan, fermented Korean medicine, Korean medicine, antibacterial and antioxidant effect 서 동물의장관내에는건강유지에기여하는세균류와유해하게작용하는세균류가서로길항관계를유지하고있다. 건강유지에기여하는세균류는숙주의면역능력을자극하거나감염을방어하고노화방지등에관여하며, 유해작용을하는세균류는장내부패를일으키거나독소, 발암물질등을생성하여숙주의노화촉진및발암등에관여한다 [5]. 건강한성인의장내균총은 Bacteroides 60%, Bifidobacterium 속과 Lactobacillus 속 40%, Escherichia coli 와 Streptococcus 속 1%, 그리고 Clostridium 속 1% 로구성되어있다 [3]. 이들균주들은각종스트레스, 해로운환경, 적절하지못한영양상태, 항생제남용등으로사멸하고해로운미생물들이그자리를대체하는현상을유발시키고있다 [13]. Lactobacillus 및 Bifidobacterium 과같은유산균은당류를발효하여유산을생성하며, 체내유익균의성장을촉진하는생균활성제 (probiotics) 로서체내콜레스테롤흡수저해, 면역조절, 영양소의흡수및이용률을높이는등다양한질병예방효과와생리조절작용을하는것으로알려져있다 [7]. 또한장내세균총중유익한균의생육을촉진시킬수있는식품소재의 론 *Corresponding author Tel: , Fax: hskim@kmu.ac.kr 탐색에대한연구가활발하게이루어지고있다. 천연식물의단독또는몇가지조합처리로 Bifidobacterium bifidum 에성장을촉진한다는보고가있으며 [10], 돌나물과오미자추출물에서 Clostridium perfringens 와 E. coli 의생육이억제되었다는보고가있다 [3]. 과학과의학이발전되고사회적환경이개선됨에따라평균수명이크게높아져고령화인구가증가되고있으며, 전염성질환보다뇌졸중, 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 알레르기성질환등만성질환의발병률이높아지고있다. 이러한추세로건강에대한관심이크게높아지고있으며, 노화및만성적인질환을일으키는원인을억제하기위해천연물및생약으로부터유래하는기능성물질에대한연구가다양하게보고되고있다 [6, 11, 14, 23]. 천연물질및생약은인체내에서식균작용을활성화하고, 항체의생성을촉진시키며, 체내생화학적수치들을정상화하는등질병에대한방어력을증가시켜만성질환을예방하고치료할수있도록하며, 면역반응을강화시키거나저하된면역기능을정상화시킴으로써치료에사용되기도한다 [17]. 한약은자연에서채취한그대로이용하는것은사용하기불편하거나부작용등이있어독성및약성의완화, 효능의변화등을목적으로수치 ( 修治 ) 라는간단한공정을거쳐사용하여왔다. 수치는천연상태로부터가공처리하여물리ㆍ화학적및생물학적활성변화를유도하는한방의전통적인제약기술로서오늘날까지전래되어이용되고있다 [12]. 전래한약

2 260 KANG AND KIM 의형태는탕제, 환제, 산제 ( 가루약 ), 고제 ( 연고 ) 였으나한약및한약재에미생물을배양하여얻은부산물도새로운제형으로추가되었다. 발효한약은약효성분의체내흡수율과생체이용률을모두극대화시켜약리적기능성뿐만아니라한약의제형개량과포제방법을향상시키고, 이를통해한약의새로운수요를창출하고고부가가치의한약제품을개발할수있어최근한의학계에서관심을받고있다 [8]. 한약의발효방법은전통한약재를미생물이잘이용할수있도록찌거나삶은후미생물을접종하여고체및액체배양을하는것이다. 한약의발효를위하여사용되는미생물은유산균이나 Bacillus sp. 및버섯균사체등이있다. 이중에서유산균이가장많이사용되며, 한약에서유산균의생육특성을확인하는연구가보고되고있다 [1, 18, 22]. 발효한약의기능성에대한연구는주로항산화, 항암및알레르기억제효과를확인하여이루어지고있다. 버섯균사체로복령과후박을발효하였을때항산화효과가다소떨어졌으나인체간암세포주에서항암활성이뚜렷하게나타났다는보고 [24] 와용안육을청국균으로발효하였을때전자공여능이높고자궁경부암세포및간암세포에대한항암활성이높아졌다는보고 [25] 가있다. 또한씀바귀추출물을유산균으로발효하였을때씀바귀추출물보다알레르기억제효과가개선되었다는보고 [21] 가있으며, 발효녹용이녹용보다면역증강작용이우수하다는보고 [9] 도있다. 본연구에서는전통한약의발효에의한신기능개발을규명하기위한일환으로, 중풍, 고혈압, 동맥경화, 염증성피부질환에사용되고있으며, 지질저하효과, 진통, 소염, 항균효과, 알레르기억제및면역효과, 간기능효과등다양한질환들에서연구되어있는방풍통성산 [16, 26] 을선정한후 Lactobacillus 균주를단일및복합배양하여생육특성을확인하고 in vitro 에서발효및미발효시한약의항산화능, 항균활성, 알레르기억제효과등기능을검토하였다. 재료및방법 한약 ( 방풍통성산 ) 발효에사용한한약은피부장벽의회복및항염증작용으로피부손상을완화시킨다는최근연구결과 [26] 를토대로방풍통성산을선정하였으며, 4 가지약재를가감하여실 Table 1. Composition of Bangpungtongsungsan.. Korean Scientific name medicine name Dose (g) 활석 Talcum 6.37 감초 Glycyrrhizae radix 4.5 석고 Gypsum fibrosum 2.62 황금 Scutellariae radix 2.62 길경 Platycodi radix 2.62 방풍 Ledebouriellae radix 1.68 천궁 Cnidii rhizoma 1.68 당귀 Angelicae gigantis radix 1.68 적작약 Paeoniae radix rubra 1.68 대황 Rheiradix etrhezoma 1.68 마황 Ephedrae herba 1.68 박하 Forsythiae fructus 1.68 연교 Natrii sulfas 1.68 망초 Schizonepetae herba 1.68 형개 Atractylodis macrocephalae rhizoma 1.31 백출 Gardeniae fructus 1.31 치자 Gardeniae fructus 1.31 생강 Zingiveris rhizoma recens 5 험에사용하였다. 한약은대구시내한의원에의뢰하여구입하였으며, 임상적복용에적합한한약재추출법에준하여조제되었다. 한약재의배합은한의학적배합방법에따라 Table 1 에서보는바와같이한첩당첨가되는각각의한약재중량을정하여수행하였다. 배합한한약재는 40 첩분량을한약추출기에첨가하여 100 o C 이하에서 2 시간동안가열을한후추출하였으며, 추출된한약은 100 mesh 체를이용해여과하여한약재를제거하였다. 유산균의배양을위해한약은 ph 조정, 침전물제거를위한원심분리, 여과를통한멸균과고압증기멸균을각각실시하여배양전처리조건을검토하였다. 유산균의복합배양본연구에사용한발효미생물은 GRAS 미생물로서유산균을공시균주로사용하였으며, Table 2 에서보는바와같이한국생명공학연구원유전자원센터유전자은행 (KCTC) 에서분양을받아 lactobacilli MRS 배지 (Difco Co.) 에계대배양한후균체를 20% glycerol 이포함된저장액에넣어 -70 o C Table 2. Lactobacillus strains used for the co-culture. Strains Sources Stock solution (CFU/mL)* Lactobacillus brevis KCTC 3498 Human feces 10 8 Lactobacillus casei KCTC 3109 Cheese 10 8 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus KCTC 3635 Bulgarian yogurt 10 8 Lactobacillus fermentum KCTC 3112 Fermented beets 10 8 Lactobacillus helveticus KCTC 3545 Emmental (Swiss) cheese 10 8 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3108 Pickled cabbage 10 8 *10 µl of inoculum of each stock solution per 40 ml KM.

3 FUNCTIONALITY ANALYSIS OF KOREAN MEDICINE FERMENTED BY LACTOBACILLUS STRAINS 261 에보관하였으며, 실험에사용하기전계대배양을실시하였다. 유산균의복합배양에사용한한약은 4 o C, 4,000 g 에서 10 분간원심분리하여침전물을제거한후 ph 를 6.3 으로조정하여 121 o C, 15 분간멸균하였으며, 유산균의생육을증대시키기위해당밀이함유된 brown sugar 를각각 1%(w/v) 와 5%(w/v) 로첨가하였다. 복합배양시유산균은각각 10 8 CFU/mL 의 stock 액을제조한후한약 40 ml(50 ml tube, Corning Co.) 에각각의 stock 액 10 µl 를혼합하여접종하였으며, 유산균이혼합접종된한약은 37 o C 에서정치배양하였다. 항산화활성측정 전자공여능 : 전자공여능은 Blois 의방법 [2](Blois 1985) 을변형하여실시하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 는실험시작전메탄올에녹인후 0.3 mm 이되도록하여사용하였다. DPPH 용액과희석된시료를 1:1 로혼합하여 30 분간실온에서반응시킨후 517 nm 에서흡광도를측정하였다. 음성대조구는시료대신메탄올을첨가하여측정하였으며, 양성대조구는기존의항산화제로알려진 BHA(butylated hydroxyanisole) 로측정하였다. 전자공여능은시료첨가구와음성대조구의흡광도를구하여다음과같이백분율로나타내었다. C ( S DDPH Scavenging (%) 1 S 2 ) = C C: methanol + DPPH 의흡광도 ; S 1 : 시료 + DPPH 의흡광도 ; S 2 : 시료 + methanol 의흡광도 SOD 유사활성 : SOD(superoxide dismutase) 유사활성은 Marklund 의방법에따라활성산소종을과산화수소 (H 2 O 2 ) 로전환시키는반응을촉매하는 pyrogallol 의생성량을측정하여나타내었다 [19]. 각시료용액 0.2 ml 에 Tris-HCl 의완충용액 (50 mm Tris, 10 mm EDTA, ph 8.5) 2.6 ml 와 7.2 mm pyrogallol 0.2 ml(sigma Co.) 를가하여 25 o C 에서 10 분간반응시킨후 1.0 N HCl 0.1 ml 를가하여반응을정지시키고반응액중산화된 pyrogallol 의양을 420 nm 에서측정하였다. SOD 유사활성은시료용액의실험구와대조구의흡광도감소율로나타내었다. SOD-like activity(%) = 시료를첨가한반응군의흡광도 대조군의흡광도 항균활성측정 : 한약및발효한약의항균활성은 agar diffusion법으로측정하였다. 검정균주는 Gram 양성균인 Bacillus subtilis PCI 219, Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC 1916과 Propionibacterium acnes KCTC 3314, Gram 음성균인 Escherichia coli KCTC 1682, Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004와 Salmonella typhimurium KCTC 2504를사용하였다. 또한효모는 Candida albicans KCTC 7675, Cryptococcus neoformans KCCM 50564을사용하였으며, 곰팡이는 Aspergillus niger KCTC 6910을사용하였다. E. coli KCTC 1682와 S. typhimurium KCTC 2504는 LB배지 (peptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 5 g/l, ph 6.8) 에접종하고, B. subtilis PCI 219, S. aureus subsp. aureus KCTC 1916과 P. aeruginosa KCTC 2004 는 Nutrient 배지 (Difco Co.) 에접종하여 37 o C, 170 rpm에서 24시간계대배양하였다. P. acnes KCTC 3314는 Reinforced Clostridial배지 (tryptose 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 3 g, dextrose 5 g, sodium chloride 5 g, soluble starch 1 g, cysteine hydrochloride 0.5 g, sodium acetate 3 g/l, ph 7.6) 에접종후 37 o C, 72시간정치하여계대배양하였다. C. albicans KCTC 7675와 C. neoformans KCCM 50564는 YM배지 (yeast extract 3 g, malt extract 3 g, dextrose 10 g, peptone 5 g/l, ph 7.6) 에접종하여 28 o C, 150 rpm에서 48시간계대배양하였다. 계대배양한시험균주는 4 o C에서보관하여사용하였다. A. niger KCTC 6910은 PDA배지 (Difco Co.) 에계대배양하여포자현탁액을제조한후 -20 o C에서보관하여사용하였다. 항균활성은한약과발효한약을 4 o C, 1000 g에서 10분간원심분리후상등액 20 µl를 paper disc (φ = 6 mm, Whatman Co.) 에첨가하여건조시키고검정균주가든평판배지위에얹어 B. subtilis PCI 219, S. aureus subsp. aureus KCTC 1916, E. coli KCTC 1682, P. aeruginosa KCTC 2004와 S. typhimurium KCTC 2504는 37 o C에서 1 일간, P. acnes KCTC 3314는 37 o C에서 3일간배양하였으며, 효모와곰팡이는 28 o C에서각각 2일, 4일간배양하여생성된 inhibitory zone의유무및크기를통해판단하였다. 세포배양 : 한약및발효한약의알레르기억제효과는알레르기발생에관여하는 RBL-2H3 세포주를대상으로실험하였다. RBL-2H3 세포주는한국세포주은행 (KCLB) 에서분양받았으며, 10% FBS(Gibco Co.) 와 1% antibiotics(gibco Co.) 를포함하는 D-MEM배지 (Gibco Co.) 와 37 o C의 5% CO 2 를포함한포화습도공기조건에서배양하였다. 100 mm tissue culture dish에배양하면서세포가 70~80% confluency 에도달하면 PBS로 2회세척하고 1 trypsin-edta(gibco Co.) 를가하여 37 o C의 5% CO 2 를포함한포화습도공기조건에서 5분간배양후배지를첨가하여현탁하였다. 세포현탁액은새로운 50 ml centrifuge tube에옮긴후 500 g에서 5분간원심분리하여상등액을제거하고새로운배지를첨가하여 ~ cells/ml의밀도로분주하였다. 세포독성확인 : 세포독성은 Mitochondrial dehydrogenase activity를나타내는 MTT colorimetric reduction assay를수행하여검정물질이세포의생존에미치는효과를 Mosmann

4 262 KANG AND KIM 이보고한방법에따라측정하였다 [20]. RBL-2H3 세포주는 96 well plate에 well당 cells 밀도로분주하여 24시간배양을한후배지를제거하고 FBS가첨가되지않은배지를분주하여 24시간배양을하였다. 한약및발효한약의세포독성확인농도는한약의처리시간을 1시간, 3시간, 6시간, 12시간으로하여각시간에따라첨가량을달리하여확인한후결정하였다. 한약및발효한약을첨가하여세포배양후 0.5 mg/ml의 MTT시약 (Generay Biotech Co.) 을 10 µl씩 well에첨가하여 4시간배양을하였으며, 잔여 MTT시약과배지를제거하고 DMSO와 EtOH를 1:1로혼합하여 100 µl 씩분주한후침전물을충분히용해시켰다. 세포독성은 ELISA reader를사용하여 540 nm의측정파장을기준으로하여흡광도를측정한후확인하였다. β-hexosaminidase의측정 : β-hexosaminidase의측정 [27] 을위해 RBL-2H3 세포주는 10% FBS, 1% antibiotics를포함하는 D-MEM배지와 37 o C의 5% CO 2 를포함한포화습도공기조건에서배양하여 80~90% confluency에도달하면세포수를 cells/ml로조절하여 24 well plate에분주후 IgE를 0.5 µg/ml로첨가하여 24시간배양하였다. 배양후배지를제거하고 500 µl Siraganian buffer(119 mm NaCl, 5 mm KCl, 0.4 mm MgCl 2, 25 mm PIPES, 40 mm NaOH, ph 7.2) 로 2회세척한다음 5.6 mm glucose, 1 mm CaCl 2 및 0.1% BSA(Sigma Co.) 가포함된 Siraganian buffer를 160 µl 첨가하여 10분간배양하였다. IgE(Sigma Co.) 로감작된세포에농도별로시료를처리하여일정시간배양한후 antigen(dnp-klh, Alpha diagnostic Intl Inc.) 을 1µL/mL로첨가하여 10분간반응시켰다. 반응종결을위해 10분간얼음에꽂아둔후반응혼합물을 500 g에서 10 분간원심분리하여상등액을분리하였다. 96 well plates에상등액과기질 (1 mm nitrophenyl-n-acetyl-β-d-glucosaminide, Sigma Co.) 을각각 25 µl씩첨가하여 37 o C에서 1시간배양한후 0.1 M Na 2 CO 3 /NaHCO 3 를 200 µl 첨가하여반응을정지시켜 ELISA reader로 405 nm에서측정하였다. RBL- 2H3 세포주에서 β-hexosaminidase의방출억제는다음과같이계산하였다. ( Treated Blank Spontaneous) Inhibition (%) = ( Control Blank Spontaneous) 100 Control: 항체와항원첨가, 시료미첨가 ; Treated: 항체, 항원및시료첨가 ; Blank: 시료와기질만첨가 ; Spontaneous: 항체, 항원및시료미첨가 통계분석통계분석은 SigmaStat 를이용하여분산분석을실시하였으며, 시험구간의평균간유의성검정은 Student-Newman- Keuls test 에따른다중검정방법으로 5% 수준에서실시하였다. 결과및고찰 한약전처리한약은 Bacillus sp. 의포자가존재하고있어유산균을접종시유산발효가되지않았다. 한약내에 Bacillus sp. 의포자제거는열에의한성분변화를고려하여 0.2 µm 와 0.45 µm 의 filter 를이용해멸균을하였으며, 그결과한약내에미립자가많아 filter 이용이적합하지않았다. 유산균배양시한약의전처리는 Bacillus sp. 의포자를사멸시키기위해고압증기멸균방법으로수행하였다. 항산화활성 전자공여능 : 발효시킨방풍통성산의기능을검토하기위하여발효및미발효시킨방풍통성산의항산화활성을측정하였다. 항산화활성측정은 DPPH radical 소거능을이용하는전자공여능을검토하였다. 공시균주가일반적인배지인 MRS 배지에서항산화활성물질을생산할수있어이를검토한결과항산화물질을생산하지않는것으로확인되었다. 전처리한한약 (KM) 은항산화효과가우수하여 ( 결과미게재 ) 희석후측정하였다. Fig. 1 에서보는바와같이 100 배희석하였을경우한약 (KM) 은 radical 소거활성이 31.7% 로나타났으며, 발효한약은모두 77% 이상으로높게나타났다. Brown sugar 를첨가하지않고한약만으로배양하였을경우배양 7 일째 radical 소거능이 94.43% 로가장높았으며 (Fig. 1, A), 양성대조구인 BHA 의 0.5 mm( 결과미게재 ) 에해당하는 radical 소거능을갖는것으로나타났다. SOD 유사활성 : Fig. 1 에서발효시킨방풍통성산의기능으로강력한항산화활성이확인됨에따라발효및미발효시킨방풍통성산의 SOD 유사활성을검토하였다. SOD 유사활성을가지는물질은주로 phytochemical 에속하는저분자물질이 SOD 와유사한역할을하여 superoxide 로부터생체를보호하며인체내의 superoxide 를제거함으로써노화억제와더불어산화적장애의방어효과를가진다고알려져있다 [15]. 따라서한약및발효한약의 SOD 유사활성은 Fig. 2 에서보는바와같이한약 (KM) 의경우 36.3% 로확인되었으나, 여러조건으로복합배양된한약의 SOD 유사활성은모두 42% 이상으로확인되어한약보다높았으며, 전체적으로 1% 와 5% 로 brown sugar 를첨가하였을때활성이더높았다. 항균활성발효한약의새로운기능을탐색하기위해항균활성을검토하였다. 일반배지인 MRS배지를사용한공시균주배양액과한약은모든시험균주에항균활성이없었다 ( 결과미게재 ). 발효한약은 Table 3에서보는바와같이 B. subtilis PCI 219, P. aeruginosa KCTC 2004, S. aureus subsp. aureus KCTC 1916과 P. acnes KCTC 3314에항균활성을보였다. B. subtilis PCI 219에대한항균활성은한약만을

FUNCTIONALITY ANALYSIS OF KOREAN MEDICINE FERMENTED BY LACTOBACILLUS STRAINS 263 Fig. 1. Electron donating ability of the various co-cultured broths.

5 FUNCTIONALITY ANALYSIS OF KOREAN MEDICINE FERMENTED BY LACTOBACILLUS STRAINS 263 Fig. 1. Electron donating ability of the various co-cultured broths. Each sample was diluted 1 : 100 in sterile distilled water. A: KM, B: 1% brown sugar addition, C: 5% brown sugar addition. Results are expressed as mean ± standard deviation. This test was repeated 3 times. 이용해 1 일과 3 일간복합배양하였을때 9mm 로나타났으며, brown sugar 를 1% 와 5% 로각각첨가하여 5 일과 7 일간복합배양하였을때 9mm 로나타났다. P. aeruginosa KCTC 2004, S. aureus subsp. aureus KCTC 1916 과 P. acnes KCTC 3314 에대한항균활성은모든발효한약에서동일하게나타났다. Fig. 2. Superoxide dismutase-like activity of the various cocultured broths (FKM) A: KM, B: 1% brown sugar addition, C: 5% brown sugar addition. Results are expressed as mean ± standard deviation. This test was repeated 3 times. 세포독성한약의세포독성을검토하기위하여 RBL-2H3 세포주를대상으로실험을수행하였다. 한약의처리시간 (1 시간 ) 은일정하게하고, 한약 (KM) 의첨가량만을다르게하여세포독성을확인한결과 Fig. 3 에서보는바와같이사용한약을높은농도 (300 µl/ml) 로첨가하여도세포독성이없으며오히려성장이촉진되는것을확인하였다. 한약만을사용하여복합배양을한발효한약 (FKM A) 의세포독성확인은처리 Table 3. Antibacterial activity of the co-cultured broth. Bacillus subtilis PCI 219 Strains Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004 Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC 1916 Propionibacterium acnes KCTC 3314 Incubation time (days) -: No inhibition A: KM, B: 1% Brown sugar addition, C: 5% Brown sugar addition. FKM A The co-cultured broth FKM B Inhibitory zone (φ, 6 mm; Whatman Co.) FKM C *

264 KANG AND KIM Fig. 3. Cytotoxic effect of KM on RBL-2H3 cells by MTT assay. The percent cell viability was calculated relative to the untreated control.

농도 10 µl/ml 로하였으며, 처리시간은 30 분, 1 시간, 3 시간, 6 시간과 12 시간으로하였다. Fig. 4 에서보는바와같이발효한약을세포주에 30 분, 1 시간과 3 시간처리하였을때는세포독성이없었으나, 장시간 (6 시간이상 ) 처리시세포독성을보이는경향을나타내었다.

6 264 KANG AND KIM Fig. 3. Cytotoxic effect of KM on RBL-2H3 cells by MTT assay. The percent cell viability was calculated relative to the untreated control. Results are expressed as mean ± standard deviation. Results were a statistically significant difference (p<0.05). This test was repeated 3times. 농도 10 µl/ml 로하였으며, 처리시간은 30 분, 1 시간, 3 시간, 6 시간과 12 시간으로하였다. Fig. 4 에서보는바와같이발효한약을세포주에 30 분, 1 시간과 3 시간처리하였을때는세포독성이없었으나, 장시간 (6 시간이상 ) 처리시세포독성을보이는경향을나타내었다. β-hexosaminidase 의방출억제효과시험물질의알레르기억제효과를측정하는방법중에서 IgE 로부터감작된비만세포에서유리된 histamine 의양을측정하는방법은비만세포에서 histamine 의농도가낮고복잡한여러단계를수행하여야하기때문에큰편차를나타내기쉽다. 최근에는높은농도로세포내에존재하며, 탈과립시화학적매개체들과함께방출되는 β-hexosaminidase Fig. 5. Effect of FKM on the β-hexosaminidase release from RBL-2H3 cells. A: KM, B: 1% brown sugar addition, C; 5% brown sugar addition. Inhibition of the β-hexosaminidase release were expressed as mean ± standard deviation. Results were a statistically significant difference (p<0.05). This test was repeated 3times. 을측정하는방법이널리이용되고있다 [4]. 발효한약의 β-hexosaminidase 방출억제효과를측정한결과, Fig. 5 에서보는바와같이배양일수에따라유사한알레르기억제효과를나타냈다. 한약만으로발효한것은배양 5 일째에 57%, 1% brown sugar 가첨가된한약은배양 3 일째 54%, 5% brown sugar 가첨가된한약은배양 3 일째 53% 로가장억제효과가높았다. β-hexosaminidase 방출에있어 ph 의영향을검토한결과, ph 5.4 및 7.2 에서한약의 β-hexosaminidase 의방출억제효과는 60% 로유사하게나타났으며, 발효한약의 β-hexosaminidase 의방출억제효과는 57% 로나타났다 ( 결과미게재 ). 요 약 Fig. 4. Cytotoxic effect of negative control, KM and FKM A on RBL-2H3 cells by MTT assay. The percent cell viability was expressed as mean ± standard deviation. Results were a statistically significant difference (p<0.05). This test was repeated 3times. 본연구에서는중풍, 고혈압, 동맥경화, 염증성피부질환에사용되고있으며, 다양한질환들에서연구되어있는방풍통성산을선정하여 4 가지약재를가미한후기존의기능성물질과 Lactobacillus 균주에의해생성되거나증가된기능성물질을확인하고자하였다. 한약을이용한복합배양은공시균주의수및접종시기를달리하여여러조합으로수행하였다. 전자공여능및 superoxide dismutase 유사활성측정을통해한약의항산화활성은각각 31.7% 와 36.3% 로나타났으며, 복합배양을통해발효된한약의항산화활성은각각 77% 이상, 42% 이상으로나타나한약보다항산화활성이더높게나타났다. 항균활성은한약의경우모든시험균주에항균활성이나타나지않았으나, 복합배양된한약의경우에는 B. subtilis PCI 219, P. aeruginosa KCTC 2004, S. aureus subsp. aureus KCTC 1916 에항균활성을보였으

7 FUNCTIONALITY ANALYSIS OF KOREAN MEDICINE FERMENTED BY LACTOBACILLUS STRAINS 265 며, 특히여드름을유발시키는 P. acnes KCTC 3314 에항균활성을보였다. RBL-2H3 세포주에서알레르기억제효과를확인한결과한약은 60% 알레르기억제효과를보였으며, 발효한약은 57% 알레르기억제효과를보였다. 발효한약은알레르기억제효과와함께항균활성과항산화활성의증가로인하여알레르기개선, 피부노화및병원성미생물에의한피부질환의개선에효과가있을것으로사료된다. REFERENCES 1. Bae, H. C., J. Y. Lee and M. S. Nam Effect of red ginseng extract on growth of Lactobacillus sp., Escherichia coli and Listeria monocytogenes in ph controled medium. Korean J. Food. Sci. Ani. Resour. 25: Blois, M. S Antioxidant determination by use of stable free radical. Nature. 191: Cho, I. S., Y. H. Han, G. Y. Lee and K. Y. Park Search for medicinal plants on improvable effect of intestinal microflora. Korean J. Medicinal Crop Sci. 15: Choi, O. B Antiallergic effects of Petasites japonicum. Korean J. Food & Nutr. 15: Gibson, G. R. and M. B. Roberfroid Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J. Nutrition. 125: Huang, F., K. Yamaki, X. Tong, L. Fu, R. Zhang, Y. Cai, R. Yanagisawa, K. I. Inoue, H. Takano and S. Yoshino Inhibition of the antigen-induced activation of RBL-2H3 cells by sinomenine. International Immunopharmacology. 8: Jung, H. K Selection Criteria for Probiotics and Their Industrial Applications. Bioindustry news. 14: Jung, Y. J., D. O. Han, B. H. Choi, C. Park, H. J. Lee, S. H. Kim and D. H. Hahm Effect of fermented herbal extracts, HP-1 on enzyme activities and gene expressions related to alcohol metabolism in ethanol-loaded rats. Korean J. Oriental Physiology & Pathology. 21: Kim, D. H., S. B. Han, J. S. Park and M. J. Han Fermentation of antler and its biological activity. Korean J. Pharmacogn. 25: Kim, J. D. and T. S. Shin The growth promoting effect of Bifidobacterium bifidum by combination of natural products bearing antioxidative capacity. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 30: Kim, K. B., K. H. Yoo, H. Y. Park and J. M. Jeong Antioxidative activities of commercial edible plant extracts distributed in Korea. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 49: Kim, N. J., Y. H. Jin and N. D. Hong Studies on the processing of crude drugs (IV): Physico-chemical transformation of glycyrrhizin in glycyrrhizae radix by processing. Korean J. Phamacogn. 26: Kim, S. H. and Y. H. Park Antimicrobial resistance and food safety. Safe food. 3: Kim, S. Y., K. S. Park, S. H. Lee, S. W. Jung and W. S. Noh A study on effect of Acanthopanax sessiliflorum seemen water extract on the growth of lactic acid bacteria. J. East Asian Soc. Dietary Life. 16: Kitani K., C. Minami, T. Amamoto, S. Kanai, G. O. Ivy and M. C. Carrillo Pharmacological interventions in aging and aging associated disorders: potencials of propargylamine for human use. Ann. N. Y. Acad. Sci. 959: Lee, J. C Effects of Gamibangpungtongseungsan on lipid composition and antioxidant in rat fed high fat. Korean J. Herbology. 20: Lee, M. K., G. P. Choi, L. H. Ryu, G. Y. Lee, C. Y. Yu and H. Y. Lee Enhanced immune activity and cytotoxicity of Artemisia capillaris Thunb. extracts against human cell lines. Korean J. Medicinal Crop Sci. 12: Lim, S. D., K. S. Kim, H. S. Kim and Y. K. Park A study on effect of medicinal herbs extract on the growth of lactic acid bacteria. 2. Effect of Daechoo, Goldamcho, Jiwhang water extracts on the growth of lactic acid bacteria. Korean J. Dairy Sci. 20: Marklund, S. and G. Marklund Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur. J. Biochem. 47: Mosmann, T Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunological Methods. 65: Park, E. K., J. H. Sung, H. T. Trinh, E. A. Bae, H. K. Yun, S. S. Hong and D. H. Kim Lactic acid bacterial fermentation increases the antiallergic effects of Ixeris dentate. J. Microbiol. Biotechnol. 18: Park. S. J., D. H. Kim, N. S. Paek and S. S. Kim Preparation and quality characteristics of the fermentation product of ginseng by lactic acid bacteria (FGL) J. Ginseng Res. 30: Shin, J. Y Screening of natural products that have activities against skin-aging. Korean J. Food & Nutr. 14: Shon, M. Y Antioxidant and anticancer activities of Poria cocos and Machilus thunbergii fermented with mycelial mushrooms. Food Industry and Nutrition. 12: Shon, M. Y., S. H. Nam and S. W. Lee Antioxidant, anticancer activities and Nitric Oxide Production of Euphoria longana fermented with lactic acid bacteria and Bacillus subtilis. Korean J. Food Preserv. 14: Son, J. M. and S. U. Hong The Effects of Bangpungtongsungsan extract to the skin damage on mice model after atopic dermatitis elicitation. Korean J. Oriental Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology. 20: Yamada. P., H. Isoda, J. K. Han, T. P. N. Talorete, T. Yamaguchi and Y. Abe Inhibitory effect of fulvic acid extracted from canadian sphagnum peat on chemical mediator release by RBL-2H3 and KU812 cells. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71:

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,