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원호 설
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1 1) pissn J. Soc. Cosmet. Scientists Korea eissn Vol. 40, No. 3, September 2014, ,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride 를이용한병원성미생물확인시험에관한연구 강정욱 배준태 연재영 김영호 김진화 이근수 표형배 한불화장품 ( 주 ) 기술연구원 (2014년 3월 4일접수, 2014년 3월 12일수정, 2014년 5월 6일채택 ) Study of 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride for Detection of Pathogenic Microorganisms Jung Wook Kang, Jun Tae Bae, Jae Young Yeon, Young Ho Kim, Jin Hwa Kim, Geun Soo Lee, and Hyeong Bae Pyo R&D Center, Hanbul cosmetics Co. Ltd, 62, Daeseong-ro 547beon-gil, Samseong-myun, Eumseong-gun, Chungcheongbuk-do , Korea (Received March 4, 2014; Revised March 12, 2014; Accepted May 6, 2014) 요약 : 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) 는산화환원지시약으로미생물의증식에의한산소소비를쉽게확인할수있다. 용해후무색의형태를띠고있으나생리활성이있는조직에서는탈수소효소 (dehydrogenases) 에의해환원되어빨간색의불용성 1,3,5,-triphenylformazan (TPF) 가된다. 본연구에서는병원성미생물 (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Candida albicans) 에 TTC 지시약을활용하여미생물성장시험에대해확인하였다. 시험균주에 TTC 를첨가하여확인한결과, 모두탈수소효소반응으로인한 TPF 형성으로붉은색콜로니를관찰하였다. 이후 TTC 0.04% 이상의농도및 12 h 이상배양조건으로최적화실험후균주별 CFU 값을통해 TPF 발현능을확인하였다. 결국 TTC 가병원성세균및효모균성장에큰영향을끼치지않으며배양시세균의경우 12 h, 효모균의경우 48 h 이후부터확인이가능하였다. 이러한결과들로부터 TTC 를활용한미생물성장확인시험법이더신속정확한방법으로화장품연구에활용가능할것으로사료된다. Abstract: 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) is used as a redox indicator in culture media. It is colorless in the oxidized form and is reduced to formazan, an insoluble pigment, by dehydrogenases in actively growing microbial cells. The aim of this study was to assess by microbial test of the pathogenic microorganisms using TTC reduction. The pathogenic microorganisms were reduced in medium by dehydrogenase to produce insoluble red formazan. We observed that the optimization method of TTC allowed more than 12 h incubation in 0.04% concentration. Also, the growth of microorganisms with media was increased formazan production. We confirmed that microorganisms were quickly observed to grow colonies cultured red color without affecting the growth of microorganisms. It is suggested that the microbial test using TTC can provide better and quicker test method in cosmetics development. Keywords: 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, microorganism, microbial test, 1,3,5,-triphenylformazan 주저자 ( jwkkang@hanbul.co.kr) 307

2 308 강정욱 배준태 연재영 김영호 김진화 이근수 표형배 1. 서론 2. 실험방법 미생물시험은신속정확해야하며쉽게반복할수있으며시험비용이비싸지않아야한다. 또한, 시험샘플을다양하게다루기위한시료처리의극대화도필요하다. 미국임상시험표준협회 (clinical and laboratory standards institute, CLSI) 에는 agar dilution methods를이용한항생제관련정량적시험법, colorimetric method 등의다양한미생물시험법이존재한다. 특히 colorimetric assay는다양한 indicator들이존재한다. Alamar blue, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5- sulphophenyl)2h-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC) 등이있다 [1-2]. TTC는산화환원지시약으로미생물의증식에의한산소소비를쉽게확인할수있는생화학시약으로 1894년처음합성된이후세포성장과관련된시험에주로사용되어왔다. 흰색파우더로구성되어있으며물, 에탄올등에쉽게용해가가능하다. 용해후무색의형태를띠고있으나생리활성이있는조직에서는탈수소효소 (dehydrogenases) 에의해환원되어빨간색의불용성 1,3,5-triphenylformazan (TPF) 가된다 [3-5]. 이런특징을활용하여보다쉽게미생물의성장유무를확인할수있는장점을가지고있으며, 이를활용해토양미생물, 해양대형조류및생물막등의평가방법으로소개되고있다 [6-7]. 또한, TTC는미생물의증식에의한산소소비가배양기의산화환원전위를저하시키기때문에환원에의해서색깔이변하는색소를미생물성장에저해하지않는정도로배지에첨가하면배지중의미생물의활성을알수있다. 현재화장품의미생물시험은 2011년도에개정된 미생물한도기준및시험방법가이드라인 에의해미생물시험을진행하고있다. 또한최근식약처의 화장품안전기준등에관한규정 개정고시 ( 제 호 ) 에따른유통화장품의미생물검사판정 ( 통보 ) 등의안전관리기준이강화되고있다. 본연구에서는관련규정에속한병원성미생물에 TTC를적용시켜미생물검사확인시험을통해기존보다신속정확한안전성확보의가능성을확인해보았다 사용균주, 배지및시약균주는세균에그람양성균 Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Enterococcus faecium (HB 2003) 과그람음성균 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) 와 Escherichia coli (ATCC 8739) 를이용하고세균용배지는 tryptic soy agar (TSA, Merck, USA) 와 tryptic soy broth (TSB, Merck, USA) 를사용하였다. 진균에는효모류인 Candida albicans (ATCC 10231) 를이용하였으며배지는 potato dextrose agar (PDA, Merck, USA) 와 potato dextrose broth (PDB, Merck, USA) 를사용하였다. 본실험에사용된 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (231121, BD, USA) 는 Gibco inc. 에서구입후사용하였다 TTC assay 본실험은 Kim 등에의해사용된 TTC 방법을변형하여사용하였다 [8]. 미생물시험에사용되는각각의배지조성후멸균시키고, 정해진농도에맞춰첨가후사용하였으며배지에빛이통과하지못하게봉한후배양기에서배양하였다. 일정시간배양후 TTC에의한 formazan 형성을확인후 490 nm 흡광도에서측정하여반응을확인하였다 미생물한도시험화장품의미생물한도기준및시험방법가이드라인을근거로하여미생물한도시험을실시하였다. 제품 1 g을 TSB에 9 ml에첨가후충분히교반한다. 농도별희석액을만든후 TSA 및 PDA배지에각각 1 ml 씩분주후배양한다. 세균은 37 에서 2 d, 진균은 25 에서 5 d 배양후미생물생성유무를관찰한다. 3. 결과및고찰 3.1. TTC 환원력에의한 E. faecium 의 TPF 관찰 TTC의반응에의한 TPF 형성유무를 E. faecium을이용하여확인해보았다. 고체및액체배지를이용하여확인한결과 E. faecium이배양되면서 TTC의탈수소효소에의한 TPF 반응으로인해붉은색콜로니형성을관찰하였다 (Figure 1). 이런 TTC 지시약은배지 대한화장품학회지, 제 40 권제 3 호, 2014

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride 를이용한병원성미생물확인시험에관한연구 309 (A) (B) Figure 1.

The agar plates are not included TTC (a), added to the TTC (b).

faecium (d) and TTC-stained strain (e), respectively. (A) (B) (C) (D) Figure 2.

aureus (A), Pseudomonas aeruginosa (B), Escherichia coli (C), Candida albicans (D).

탈수소효소반응에의한병원성미생물의 TPF 형성확인화장품의안전기준에의거 S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, C.

3 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride 를이용한병원성미생물확인시험에관한연구 309 (A) (B) Figure 1. TTC-stained Enterococcus faecium in tryptone soy agar (A), and tryptone soy broth (B). The agar plates are not included TTC (a), added to the TTC (b). The liquid culture medium are represented control (c), including E. faecium (d) and TTC-stained strain (e), respectively. (A) (B) (C) (D) Figure 2. TTC-reducing bacteria (red color colonies) in pathogenetic microorganisms, Staphylococcus aureus (A), Pseudomonas aeruginosa (B), Escherichia coli (C), Candida albicans (D). The samples are not included TTC (left), added to the TTC (right). 에서성장하는균주를쉽고빠르게확인할수있는방법으로보고되고있다 [9]. 즉, TTC를통해화장품미생물한도시험방법에적용시켜제품내미생물에대한정확한판정을내릴수있는가능성을확인하였다 탈수소효소반응에의한병원성미생물의 TPF 형성확인화장품의안전기준에의거 S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, C. albicans 등의병원성미생물은불검출이되 어야한다 [8]. 이에 TTC배지의성능시험법을활용하여 4종의병원성미생물의검출유무를수행하였다. 그결과 4개의균주모두 TPF 반응으로인해붉은색콜로니를형성함을확인하였다 (Figure 2). 붉은색콜로니형성이배지내미생물생성유무를확인하는데보다정확한판별이가능할것으로사료된다 미생물성장확인시험을위한 TTC 염색의최적화 TTC를이용한보다신속하고정확한판정을위해 J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, Vol. 40, No. 3, 2014

4 310 강정욱 배준태 연재영 김영호 김진화 이근수 표형배 Table 1. Comparison of the Cytotoxic Effects from TTC Reaction Strains Total number of colonies g -1 Non-TTC TTC Visually observed time (h) S. aureus Figure 3. Determination of variable for the optimal conditions of TTC reaction by E. faecium. P. aeruginosa E. coli C. albicans E. faecium Figure 4. Correlation between TTC-reducing bacteria and triphenylformazan (TPF) formation. TTC 농도및배양시간등의최적의조건을확인해보았다. 0.04% 농도에서 TTC는환원반응을확인하였고 (Data not shown) 이를기준으로배양시간을확인한결과 12 h부터환원력이증가하는것으로나타났다 (Figure 3). 즉미생물성장곡선의변화가 TTC 활성과관련있는것을확인하였다. 이를토대로미생물대수기때급격히변화한 TTC 활성값을통해보다신속한판정을내릴수있는기준의시간을확립하였다. 이런결과를바탕으로 TTC를이용한탈수소효소생성세균계수를 ELISA로측정하였다. 배지에서성장하는균주가증가할수록 TTC 환원력에의한 formazan 형성도증가하였다 (Figure 4). 이는 TTC에의한탈수소효소반응이균주의양과유의적관계가있음을알수있었다 균주별 TPF 발현능확인 TTC 의환원력이미생물성장에영향을끼치는지를 확인해보았다. 총 5종의균주의 CFU 측정한결과, S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, E. faecium 등은 12 h부터 TTC의발현을확인하였다. 이때배지에성장된미생물은 Non-TTC의 CFU 값이거의동일하게확인되었다 (Table 1). 반면 C. albicans의경우 48 h이지났을때부터 TTC의환원력을확인할수있었다. 다만, 최초 48 h이지났을때배지에성장된미생물의 CFU 값이약간의차이가발생하였지만 5일까지경과했을때는 CFU값이거의동일하게확인되었다. 즉, TTC 환원에의한붉은색콜로니형성을통해미생물오염여부를미리확인할수있었으며, 이는균주의 CFU 값에영향을끼치지않았다. 또한선행연구에서도 Bredt에의해최대 10 7 CFU/mL까지 TTC 환원이일어난다고보고하였다 [10]. 이에 TPF 발현이미생물의성장에큰영향을끼치지않는것을확인할수있었으며세균의경우 12 h 이후, 효모균의경우 48 h 이후부터 TTC가발현된미생물성장확인이가능하였다. 대한화장품학회지, 제 40 권제 3 호, 2014

5 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride 를이용한병원성미생물확인시험에관한연구 결론본연구를통하여 TTC를이용하여병원성미생물을이용한미생물성장확인시험법을확인하였다. 병원성미생물에 TTC를첨가한배지는탈수소효소반응으로인한 TPF 형성으로붉은색콜로니를관찰하였다. 이에 TTC 확인시험에서는 0.04% 이상의농도에서 12 h부터 TPF 형성을관찰하였다. 또한, 균주별 CFU 값을통해 TPF 발현능을확인한결과유의적관계가있음을확인하였다. 병원성미생물을활용하여 TTC 가미생물성장에영향을끼치지않으며구체적으로세균의경우 12 h, 효모균의경우 48 h 이후배양시미생물성장확인이가능하였다. 이상의결과를바탕으로미생물한도시험법에의한 48 h 이상의배양후관찰가능한가이드라인을 TTC를활용하면미생물성장확인에정확하고신속한판정이가능할것으로사료되며, 이는화장품안전성연구에대한다양한방법적접근이될것으로기대된다. Acknowledgement 본연구는 2013년지역특화산업육성 (R&D) 기술개발사업의지원에의하여이루어진것으로이에감사드립니다 ( 과제번호 R ). References 1. A. Mohammadzadeh, P. Farnia, K. Ghazvini, M. Behdani, T. Rashed, and J. Ghanaat, Rapid and low-cost colorimetric method using 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis, J. Med. Microbiol., 55, 1657 (2006). 2. A. Klancnik, S. Piskernik, B. Jersek, and S. S. Mozina, Evaluation of dif fusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts, J. Microbiol. Meth., 81, 121 (2010). 3. P. Kumar and J. C. Tarafdar, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)as electron acceptor of culturable soil bacteria, fungi and actinomycetes, Biol. Fertil. Soils, 38, 186 (2003). 4. B. H. Nam, H. J. Jin, S. K. Kim, and Y. K. Hong, Quantitative viability ofseaweed tissues assessed with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, J. Applied Phycol., 10, 31 (1998). 5. J. Bederson, L. Pitts, S. Germano, M. Nishimura, R. Davis, and H. Bartkowski, Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats, Stroke, 17, 1304 (1986). 6. H. L. Brown, A. H. M. Vliet, R. P. Betts, and M. Reuter, Tetrazolium reduction allows assessment of biofilm formation by Campylobacter jejuni in a food matrix model, J. Appl. Microbiol., 115, 1212 (2013). 7. W. C. Chang, M. H. Chen, and T. M. Lee, 2,3,5-triphenyltetrazolium reduction in the viability assay of Ulva fasciata (chlorophyta) in response tosalinity stress, Bot. Bull. Acad. Sin., 40, 207 (1999). 8. S. Kim, M. J. Kim, H. Y. Kang, S. Y. Seol, D. T. Cho, and J. Kim, A simple colorimetric method for testing antimicrobial susceptibility of biofilmed bacteria, J. Microbiol., 48, 709 (2010). 9. T. Junillon and J. P. Flandrois, Diminution of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride toxicity on Listeria monocytogenes growth by iron source addition to the culture medium, Food Microbiol., 38, 1 (2014). 10. W. Bredt, Estimation of Mycoplasma pneumoniae inoculum size by rateof tetrazolium reduction, J. Clin. Microbiol., 4, 92 (1976). J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, Vol. 40, No. 3, 2014

보도자료 년 5 월 16 일 ( 목 ) 조간부터보도하여주시기바랍니다. 문의 : 에너지환경표준과최철우과장, 류지영연구사 ( ) 화장품에도국제표준이...? - 화장품도이젠표준선점으로세계시장선도를 - [ 붙임 1

보도자료 년 5 월 16 일 ( 목 ) 조간부터보도하여주시기바랍니다. 문의 : 에너지환경표준과최철우과장, 류지영연구사 ( ) 화장품에도국제표준이...? - 화장품도이젠표준선점으로세계시장선도를 - [ 붙임 1 보도자료 http://www.motie.go.kr 2013 년 5 월 16 일 ( 목 ) 조간부터보도하여주시기바랍니다. 문의 : 에너지환경표준과최철우과장, 류지영연구사 (509-7272) 화장품에도국제표준이...? - 화장품도이젠표준선점으로세계시장선도를 - [ 붙임 1 참조 ] [ 붙임 2 참조 ] [ 붙임 3, 4 참조 ] 이보도자료와관련하여보다자세한내용이나취재를원하시면산업통상자원부기술표준원에너지환경표준과류지영연구사