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1 병원약사회지 (2016), 제 33 권제 3 호 J. Kor. Soc. Health-syst. Pharm., Vol. 33,. 3, 239 ~ 247 (2016) Original Article Media fill test 를이용한 Aseptic technique 모니터링 송지윤, 김정현, 최미용, 정선영, 인용원, 이영미 삼성서울병원약제부 Aseptic Technique Monitoring Evaluated by Media Fill Test Ji Yun Song, Jung Hyun Kim, Mi Yong Choi, Seon Young Chung, Yong Won In, And Young Mee Lee Department of Pharmaceutical Services, Samsung Medical Center 81, Irwon-ro, Gangnam-gu, Seoul, , Korea Abstract : The purpose of this study is to evaluate the aseptic technique of a compounding personnel or process via media fill test, which is recommended by USP Chapter 797. The procedure of the test is designed based on the media fill test for low risk. For each set of experiments, five 50 ml vials each with 25 ml of TSB (Bacto TM Tryptic Soy Broth, BD) medium and three 50 ml autoclaved empty vials are used; TSB medium used for the experiment had gone through a suitability test for sterility and growth promotion by a department of laboratory medicine. The experiment is conducted at the end of the compounding task. A 60 ml Luer-Lok TM syringe is given to each compounding personnel to transfer 40 ml of the TSB medium from the given 5 vials to the 3 autoclaved empty vials, making three 40 ml vials and one 5 ml vial with TSB. The transferred media are then checked for bacteria infiltration after two weeks of incubation under 35. evidence of bacteria was observed, implying that the compounding personnel had done the task with an appropriate aseptic technique. Throughout the paper, this study has significance in monitoring aseptic technique of compounding personnel via a procedure similar to the actual compounding of an intravenous injectable drug. When the suggested method is taken into a regular performance assessment drug quality and dispensing practice improvements are expected. [Key words] Media fill test, Aseptic technique, Compounding personnel 투고일자 ; 심사완료일자 ; 게재확정일자 교신저자이영미 Tel: opym.lee@samsung.com

2 JKSHP, VOL.33, NO.3 (2016) 연구배경및목적미국약전 USP Chapter <797> (Pharmaceutical compounding sterile preparations) 에서는 aseptic technique을모니터링하는방법으로써 media fill test 를명시하고있으며 조제자의무균적조작술을평가하여그과정이미생물의오염없이무균적인제품을생산한다는것을보장해주는시험 으로정의하고있다. 1) 시험과정은대두카제인소화배지와같이미생물이자랄수있는배지를약물대신사용하여혼합조제업무를시행하는것을기본으로하며, 실제조제업무에있어서청결유지가가장어려운상황을바탕으로유사한과정을설계하여시행하도록하고있다. 1) 시험진행시고려해야할사항으로는시험과정설계, 배지의선택, 시험에사용할배지의부피, 배양온도와시간, 완성된결과물의관찰, 기록및해석이있다. 1) 또한무균조제과정에서미생물학적 ( 예 : 세균, 포자, 내독소등 ), 화학적또는물리적으로오염될가능성에따라 compounding sterile preparation (CSP) microbial contamination risk level을세가지로나누어그에따 른서로다른수준의 media fill test를권고하고있다. 1) Low risk level은 ISO Class 5 이상의환경에서약액을옮기거나필요로하는부피의약액을취하고수액에약을혼합하는조제업무가해당되며매년적어도 1 회이상시행할것을권고하고있다. 1) 조작은앰플의개봉, 주사바늘을바이알의고무마개에꽂는작업, 무균화된기구들을가지고무균화된약액을취하여옮기는것으로제한된다. 1) 구체적인예를들면무균화한주사기와바늘을이용하여앰플, 바이알, 병, 수액 bag에서일정부피를취하여단순히옮기는것, 약물을수액에희석시키는것이이에해당된다. 1) Medium risk level은 ISO Class 5 이상의환경에서단순히약액을옮기는작업보다복잡한조제과정을포함하며매년적어도 1회이상시행할것을권고하고있다. 1) 그예로조제장비를이용하여정맥영양수액을조제하는경우처럼주사기를통한여러번의주입이시행되는경우, 세개이상의약물을주사기나주입기구를이용하여빈용기에채우는경우가있다. 1) High risk level은앞서설명한 low, medium risk level의경우와달리 ISO class 5 이하의환경에서시 Table 1. CSP microbial contamination risk levels Risk Level Description Examples Low Transfer, measuring and mixing with closed or sealed packaging systems Limited to aseptically opening ampules, penetrating sterile stoppers on vials with sterile liquids in sterile syringes to sterile administration devices Single transfers of sterile dosage forms from ampules, bottles, bags, and vials using sterile syringes with sterile needles Medium Multiple individual or small doses are combined or pooled to prepare a CSP for administration to multiple patients or to one patient on multiple occasions Complex aseptic manipulations or requires a long duration to prepare TPN fluids using manually or automated compounded, involving multiple injections, detachments, and attachments of nutrient source products to deliver components to a final sterile container Filling reservoirs of injection and infusion devices with multiple sterile drug products and evacuation of air from those reservoirs before dispensing High n-sterile ingredients are incorporated or a nonsterile device is employed before terminal sterilization n-sterile components are exposed for at least 6 hours before being sterilized Dissolving non-sterile bulk drug and nutrient powders to make solutions which will be terminally sterilized

3 송지윤 : Media fill test 를이용한 Aseptic technique 모니터링 행되는작업을포함하며매년 2회시행할것을권고하고있다. 1) 비무균화된상태의제품들을비무균화된기구를이용하여측정하거나혼합하고, 마지막에멸균하는작업의경우가이에해당된다 (Table 1). 1) 실제미국등여러나라에서는병원환경에서무균조제자의 aseptic technique을 risk 별로매년정기적으로모니터링하고있다. 삼성서울병원에서는항암제, TPN, 항생제와전해질제제등다양한주사제를대상으로무균조제업무를수행하고있으며, 조제약의무균성을확보하기위한과정으로무균조제실무가안전하고무균적으로수행되고있는지객관적으로평가하기위해 media fill test를업무에활용해보고자본연구를진행하였다. 연구방법 Media fill test를진행하기전에배지의적합성시험을실시하고이시험을통과한배지로 media fill test 를위한키트를제작하였다. 제작된키트로본시험인 media fill test를진행하였으며시험결과물은 35 에서배양하여 14일간배지의혼탁도여부를매일관찰하였다 (Fig. 1). 1) 1. 시험설계 본원의항암제무균조제업무수행과정중바이알에서일정부피의약액을취하여수액에희석시키는작업이많은부분을차지하므로이를바탕으로 CSP level 의기준에부합하는 low risk level을선택하였다. 항암제조제수행과정은바이알에서일정약액을취하여 bag에혼합하는과정이주를이루고있으며연속된조제가수행되고있으므로이러한조작을포함하도록시험과정을설계하였다. 이를반영하여 50 ml 규격의빈바이알에 25 ml의액체배지를충진하여총 5개의바이알을제작하고연속된조작으로 40 ml 씩취하여빈바이알에옮기는것으로시험을설계하였다 (Fig. 2). 2. 배지적합성시험 Media fill test에쓰일배지의무균성을검증하고호기성균, 혐기성균및진균에대한배지의성능을입증하기위하여대한약전제 11 개정판의무균시험법중배지적합성시험법에근거하여진단검사의학과에의뢰하여시험을진행하였다. 2) 배지가충진된 5개의바이알을준비하여번호를부여하였다. 1번은 Aspergillus brasiliensis, 2번과 3번은 Bacillus subtilis를접종하였으며 2번과 3번바이알은배양온도를다르게설정하였다. 4번은 Candida albicans를각각 CFU 대두카제인소화배지 (Tryptic Soybean Broth, TSB) 제조 배지를충진한바이알 5 개만들기 배지충진한바이알멸균 대한약전무균시험법에따라시험진행 배지를충진하여멸균한바이알에각각의균을접종 배양후균증식여부확인 대두카제인소화배지 (TSB) 제조 빈바이알 45+α 개준비 배지를충진한바이알 75+α 개제작 빈바이알과배지를충진한바이알멸균 빈바이알 3 개와배지를충진한바이알 5 개를 1set 로준비 업무종료후 BSC 청소직전시험시행 한사람당 4 개의바이알을제조 배양기에넣고 에 14 일간배양 매일바이알내배지의혼탁도여부를관찰 Fig. 1 Overview of the media fill test

4 JKSHP, VOL.33, NO.3 (2016) Fig. 2 Test procedure Table 2. Test for sterility and growth promotion 바이알 균주 Inoculum CFU 배양기간 배양온도 1 Aspergillus brasiliensis CFU 5 일 Bacillus subtilis CFU 3 일 Bacillus subtilis CFU 3 일 Candida albicans CFU 5 일 일 (Negative control*) * 배지의무균성 : 5번째바이알은배지의무균성을보기위한 negative control으로대한약전에서는배지의무균성에대한시험법을다음과같이정의한다. 배지의일부를 14일간배양할때미생물의증식이나타나지않는다. 2) 씩접종하였으며 5번은배지의무균성시험을위한대조군으로균을접종하지않았다. 2) 배양기간은세균은 3일, 진균은 5일을초과하지않도록하여, 1번과 4번바이알은 5일, 2번과 3번바이알은 3일을배양하였고 5번바이알은배지의무균성시험법의정의에따라 14일간배양하였다 (Table 2). 2) 배지적합성시험결과, 균을접종한 1, 2, 3, 4번바이알에서는균이잘자랐고대조군이었던 5번바이알에서는균이자라지않아진단검사의학과로부터배지가시험에사용하기적합한것으로판정받았다 (Fig. 3). 3. Media fill test kit 제작본시험인 media fill test의과정은배지가충진된바이알에서빈바이알로배지를옮기는작업이진행되므로시험은배지가충진된바이알과빈바이알로구성하여제작하였다. 실험에사용하는배지는 BD사의 Bacto TM Tryptic Soy Broth배지로분말형태의배지 60 g을증류수 2 L에넣고가열하여완전히녹인후 ph가 7.3±0.2가되도록조정하였다. 3) 준비한빈바이알에제조한 2 L 배지를 25 ml씩소분하여고무마개로

5 송지윤 : Media fill test 를이용한 Aseptic technique 모니터링 Fig. 3 Media conformance test report

6 JKSHP, VOL.33, NO.3 (2016) capping하였다. 배지를충진한바이알은고압증기멸균기를이용하여멸균하였으며, 빈바이알은건열멸균기를이용하여멸균하였다. 1개의 media fill test kit의구성품은 25 ml 배지가충진된바이알 5개와빈바이알 3개, 60 ml Luer- Lok TM syringe 1개, 18 gauge needle 3개, sealing sticker로하였다 (Fig. 4). 4. Media fill test 진행시험을수행하는복장기준은항암제무균조제와동일하게하였다. 시험진행은무균조제수행직원 9명을대상으로조제가종료된후 biological safety cabinet 청소직전에실시하였고작업자 9명에대하여 A부터 I 까지의식별코드를사전에부여하고조제가완료된바이알에해당코드를라벨링하면서진행하였다. 시험과정은다음과같다. 60 ml Luer-Lok TM syringe 에 18 gauge needle을끼운후 25 ml 배지가충진된바이알 5개에서연속적으로 40 ml씩배지를뽑아빈바이알에옮기고 needle은 40 ml 배지가충진된바이알이완성될때마다교체하면서진행하였다. 외부공기의유입을막기위하여빈바이알에배지를옮길때는보조 needle을쓰지않고주사기의공기를제거하면서진행하였다 (Fig. 5). 최종적으로 40 ml 배지가담긴바이알 3개와 5 ml 배지가남겨진바이알 1개가만들어지고각바이알을실링하여벤치밖으로꺼낸뒤바이알에각실험자에게배정된코드를라벨링하였다. 결과물로는한키트당 4개의바이알이조제되며한사람당한키트씩시험을진행하였다. 총 9명을대상으로하였으므로 36 바이알이조제되었다. 조제가완료된 36 개의바이알은배양기에넣고 35 에서 14일간배양하였다. 5. 평가결과의해석은배양후 14 일이내육안으로혼탁이관찰될경우미생물이성장한것으로판단하였다. 1) 혼탁도가관찰될경우 media fill test는불합격한것으로보고해당실험자는올바른무균조작술을시행하지 못한것으로평가하였다. 연구결과 14일간바이알혼탁유무를매일관찰한결과혼탁이발생한바이알은없었으며 14일후시험이종료되어바이알내혼탁유무를관찰하였을때에도혼탁이발생한바이알은없었다 (Table 3). 따라서시험을진행한무균조제수행직원이적절하게무균조작술을수행한것으로평가하였다. 고찰 USP 797과 American society of health system pharmacists (ASHP) guidelines on quality assurance for pharmacy-prepared sterile products에서는무균조작술을수행하는약국에대하여정기적인 media fill test를진행하고무균조제업무에있어서의오염률을확인하도록권고하고있다. 1),4),5) 시험은조제환경에따라 risk를 low, medium, high 세가지로구별하여 low, medium risk의경우는매년적어도 1번이상, high risk의경우는매년 2번시행하도록하고있다. 1) 이번연구는현재병원에서의주사제무균조제업무수행과정을바탕으로 USP 797에서제시하는 low risk level을선택하여무균조제수행직원의무균조작술을모니터링하는과정을실무에도입해보기위해진행하였다. 관련주제에대한해외의연구자료들을보았을때이전연구들은대부분시험에쓰이는키트를직접제작하지않고상품형키트를구입하여시험을수 행하였는데 6)-9) 본연구는자체제작한키트로시험을 수행하였다. 이는시험을설계할당시상품형키트를사용하는데있어서구입절차나비용적인문제를해결하기어려웠고이와관련하여국외 USP 관계자에문의하였을때각병원의주사제조제업무과정과유사한과정으로방법을자체설계하여수행한시험에서더좋은검증효과를기대할수있다는답변을받아키트를자체제작하게되었다. 이로인해키트를제작하기전시험에사용될배지의적합성시험을수행하게되었고진단검사의학과에의

또한키트를구성하고있는배지가충진된바이알과멸균된빈바이알은본원약제부제제실에의뢰함으로써설계했던구성품을제작하여시험을진행할수있었다.

7 송지윤 : Media fill test 를이용한 Aseptic technique 모니터링 Fig 4. Media fill test kit Fig. 5 Media fill test procedure 뢰하여대한약전에서제시하고있는시험에적합한균주를접종하여배지의성능과무균성을확인하였다. 또한키트를구성하고있는배지가충진된바이알과멸균된빈바이알은본원약제부제제실에의뢰함으로써설계했던구성품을제작하여시험을진행할수있었다. 이와같이본시험은병원환경내에서시험에쓰이는배지를직접제작하고배지적합성여부를검증하는과정을수행하였으며, 실제본원정맥주사조제업무와 유사한과정으로무균조작술수행여부를평가할수있는방법을고안하였다는데의의가있다. 다만현재본원주사제조제를수행하고있는직원중일부만을대상으로하여시험을진행하였고한사람당한번의시험만을실시하여신뢰도가높은결과를얻기에는시료가부족하였다. 하지만이번연구에서의시험은향후 media fill test를전직원을대상으로실시하여업무평가에반영하고자시범적으로실시해본것임

8 JKSHP, VOL.33, NO.3 (2016) Table 3. Results: Culture observation log sheet Vial Number A-1 A-2 A A-3 A-4 B-1 B-2 B B-3 B-4 C-1 C-2 C C-3 C-4 D-1 D-2 D D-3 D-4 E-1 E-2 E E-3 E-4 F-1 F-2 F F-3 F-4 G-1 G-2 G G-3 G-4 H-1 H-2 H H-3 H-4 I-1 I-2 I I-3 I-4 Incubation Temp. Length of Incubation Result: Growth/ growth Interpretation: /Fail

9 송지윤 : Media fill test 를이용한 Aseptic technique 모니터링 을고려하였을때반복하여시험과정을진행하면서개선할수있을것으로생각된다. 결론정맥주사조제서비스를수행하는과정에서조제자의적절한무균조작술수행여부를모니터링하기위해무균조제수행직원 9명을대상으로 media fill test를진행하였다. 연구결과, 혼탁이발생한바이알이없었고따라서시험을진행한무균조제수행직원이적절하게무균조작술을수행한것으로평가할수있었다. 향후본시험을주사제무균조제수행직원의정기적인업무수행과정에반영한다면주사제무균조제업무의안전성확보와질적향상에기여할수있을것으로사료된다. 참고문헌 1) Pharmaceutical compounding - sterile preparations (general chapters 797). In: The United States Pharmacopeia, 38th rev. and The National Formulary, 33th ed. The United States Pharmacopeial Convention, Twinbrook Parkway, Rockville, MD; ) 신일서적ㄜ편집위원회 : 대한민국약전제 11 개정, 신일서적, 서울 ; ) Sterility tests (general chapters 71). In: The United States Pharmacopeia, 38th rev. and The National Formulary, 33th ed. The United States Pharmacopeial Convention, Twinbrook Parkway, Rockville, MD; ) American Society of Health-System Pharmacists. ASHP guidelines on quality assurance for pharmacy-prepared sterile products. Am J Health-Syst Pharm. 2000;57(12): ) Lawrence A. Trissel; Abayomi B; Ogundele; Delshalonda S. Ingram; Christopher A. Saenz and Joseph A. Gentempo: Using medium-fill simulation to establish a benchmark microbiological contamination rate for low-risk-level compounding. Am J Health- Syst Pharm. 2003;60: ) Sigward, E.; Fourgeaud, M.; Vazquez, R.; Guerrault-Moro, M. N.; Brossard, D.; Crauste-Manciet, S., Aseptic simulation test challenged with microorganisms for validation of pharmacy operators. Am J Healthsyst pharm. 2012;69(14): ) Savry, A.; Correard, F.; Bennis, Y.; Roubaud, S.; Gauthier-Villano, L.; Pisano, P.; Pourroy, B., Aseptic simulation test for cytotoxic drug production in isolators. Am J Health-syst pharm. 2014;71(6): ) Isanhart, C. M.; McCall, K. L.; Kretschmer, D.; Grimes, B. A., Parenterals laboratory course to reduce microbial contamination rates in media fill tests performed by pharmacy students. American journal of pharmaceutical education. 2008;72(2):27. 9) Kramer, I.; Federici, M.; Kaiser, V.; Thiesen, J., Media-fill simulation tests in manual and robotic aseptic preparation of injection solutions in syringes. Journal of oncology pharmacy practice. 2016;22(2):