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선희 채
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1 분석기술지원사업교육교재 대구지방식품의약품안전청유해물질분석과 - 1 -

2 순 서 1. 검체의채취및취급 2. Coliform 3. Escherichia coli 4. Stapylococcus aureus 5. Salmonella spp. 6. Bacillus cereus 7. Listeria monocytogensis 8. 균동정을위한시험방법 8-1. 그람염색방법 8-2. Cogulase 시험방법 8-3. Haemolysis 시험방법 8-4. CAMP 시험방법 8-5. Motility 시험방법 8-6. Catalase 시험방법 8-7. Oxidase 시험방법 8-8. API 동정방법 - 2 -

3 1. 검체의채취및취급 1. 채취방법 1 검체가균질한상태일때는어느곳채취해도무방하나불균질할때는많은양채취 2 가능한한검체를잘섞어균질에가깝게검체를채취 반드시무균적을채취, 멸균한용기에넣어저온(3-5 도) 로유지시키면서검채채 취후 4시간안에검사기관으로운반 부득이하게저온으로유지할수없을때는채취일시및채취당시의검체상태를 상세히기술 채취기구는몇개씩건열, 화염멸균하여 1건마다바꾸어가면서사용 6 곡분이나분유와같이건조되어잘변질또는부패되지않는검체는냉장상태에 운반할필요는없으나 냉장운반시얼음을사용할때에는 않도록한다. 2차오염을방지하기위해밀봉또는밀폐 2차오염방지를위해검체가녹은물에닿지 고형및반고형인검체는균질기를이용하여적당량희석액과혼합하여균질화 칼도마및식기류에서검체를채취할때에는멸균한탈지면에멸균생리식염수 적셔, 검사하고자하는기구의표면을완전히닦아낸탈지면을무균용기에넣 어시험용액으로함 2. 시험용액조제방법 1 2 액상검체 : 채취된검체를강하게진탕, 혼합 반유동검체 : 채취된검체를멸균유리봉등으로잘혼합한후일정량(10~25 ml) 을멸균용기에취해 9배양의멸균생리식염수와혼합 3 고체검체 : 검체 10~25g을잘라멸균생리식염수를가해저온으로균질화한 후다시멸균생리식염수를가해일정량(100~250ml) 으로함 4 분말상검체 : 검체를잘혼합한후일정량(10g) 에멸균생리식염수와혼합 5 버터와아이스크림류 : 40 이하의온탕에서 15분내에용해시켜 10ml를취한 후멸균생리식염수를가하여 100ml로함 6 캅셀제품류 : 검체의일정량(10~25g) 을취한후 9배양의멸균생리식염수를가 해균질화. 필요에따라 10 배, 100 배, 희석액을만들어사용. 지방분이많은 시료의경우 Tween 80과같은계면활성제를첨가함 7 냉동식품 : 40 이하에서단시간에녹여상기의방법으로조제 - 3 -

4 3. 참고자료 * 식품공전 : 미생물검사법 *

Klebsiella 같은분변에서유래하는것, Citrobacter 및 Enterobacter 같은자연과분변에서유래하는것, Eriwinia

5 2. 대장균군 (Coliform Bacteria) 1. 성상및분류 -사람과동물의장관에서식 -Gram음성무아포성간균 -유당을분해하여산과가스생성하는호기성또는통성혐기성세균 대장균군 대장균군은대장균및 Klebsiella 같은분변에서유래하는것, Citrobacter 및 Enterobacter 같은자연과분변에서유래하는것, Eriwinia 같이자연에서만 유래하는것등다양하다. [ Enterobacter 그룹의균주들 검출의의미대장균군이검출되었다고해서무조건분변오염에의한것으로단정할수는없으나불결하고취급에잘못이있다거나전염병원균, 세균성식중독등의병원균에의하여감염될가능성이있다는것을의미 - 5 -

* 시험관에 durham발효관을넣어배지조제 2 35 에서 48 시간배양: 가스발생여부확인 - 가스비발생 추정시험음성 - 가스발생 추정시험양성 확정시험 1 BGLB 배지에접종 < 유당배지에서가스생성 > 2 35 에서 48 시간배양: 가스발생여부확인

6 2. 검출방법 정성실험 ( 유당배지법: 유당을분해하여가스발생) -- 추정, 확정, 완전시험 3단계로나눔 추정시험 1 검체처리법의검체에따른시험용액조제방법에따라시험용액 10ml를 2 배농도의유당배지, 시험용액 1ml 및 0.1ml를 1배농도유당배지에각 3 개씩넣는다. * 시험관에 durham발효관을넣어배지조제 2 35 에서 48 시간배양: 가스발생여부확인 - 가스비발생 추정시험음성 - 가스발생 추정시험양성 확정시험 1 BGLB 배지에접종 < 유당배지에서가스생성 > 2 35 에서 48 시간배양: 가스발생여부확인 배지색이갈색이면완전시험해야함 3 Endo 평판배지또는 EMB 한천평판배지에 접종 4 35 에서 24시간배양 5 전형적인집락형성시완전시험 ( 짙은자주, Blue-Black, 금속광택집락) EMB 배지 : 대장균 완전시험 * 균이그람음성, 무아포성간균, 유당분해가스발생재확인 1 확정시험의 Endo 평판배지또는 EMB 한천평판배지에서 1개또는비전형적인집락의경우 2개를따서유당부이온발효관과 보통한천배지(NA or TSA) 에이식 2 35 에서 48 시간배양: 가스발생여부확인 - 6 -

3 보통한천배지균체로부터그람음성, 무아포성간균시험 4 동정 -그람음성용 API20E 사용: http://apiweb.biomerieux.

1ml를약 50 에보존한 데옥시콜레이트유당한천배지약 2 그표면을같은배지로중첩(35, 20hr 배양) 3 전형적인집락계수 4 계수에포함된집락을선택

7 3 보통한천배지균체로부터그람음성, 무아포성간균시험 4 동정 -그람음성용 API20E 사용: 에서결과확인 -VITEK GNI 카드이용: 카드에 oxidase(-) 결과표시하여동정 정량실험 : 건조필름법으로대체가능 1 조제된시험용액및각단계희석액 1ml를약 50 에보존한 데옥시콜레이트유당한천배지약 2 그표면을같은배지로중첩(35, 20hr 배양) 3 전형적인집락계수 4 계수에포함된집락을선택 15ml를잘혼합한후냉각응고 5 EMB 또는 Endo 평판배지에서분리배양(35,20hr) 6 유당배지법의확정시험및완전시험법에의거확인 [ 데옥시콜레이트유당배지 [ 3M PetriFilm 대장균군 - 7 -

8 [API 미생물동정사이트 먹는물수질검사항목의대장균군 * 대장균 : 사람이나동물의장에서식하는통성혐기성장내세균종으로분원성오염의지표 * 분원성대장균군 : : 대장균군과같은정의에서배양온도가 44 로높아열저항성대장균군이라고도한다. -> 대장균 + 열저항성세균 * 총대장균군 : 분원성대장균군 + 기타세균 - 8 -

7 1-30um크기의 주모성편모가있어운동성이있으나, 편모가 없고비운동성인것도있음 lactose, fructose

분변중에는병원성균이나바이러스등이존재할가능성이있기때문에식품위생의지표로활용 2.

9 3. 대장균 ( (Escherichia coli) 1. 성상및분류 사람이나동물의장관에상재하는세균으로 장내세균과에속하는 그람음성간균 um크기의 주모성편모가있어운동성이있으나, 편모가 없고비운동성인것도있음 lactose, fructose 를분해하여산과가스를 생산하는호기성또는통성혐기성균주 대부분병원성은없으나정상대장균과는 달리설사증이나급성장염을일으키는 대장균이있는데이는병원성대장균이다. [ 대장균 [ 검사목적 대장균이나대장균군자체가반드시사람에게위해를주는것은아니나, 분변중에는병원성균이나바이러스등이존재할가능성이있기때문에식품위생의지표로활용 2. 검출방법 한도시험 1 검체처리법의검체에따른시험용액 조제방법에따라시험용액 3개 EC배지접종 1ml를 ( 시험관에 durham 발효관을넣어배지조제) 에서 24 시간배양: 가스발생여부확인 가스발생 : 추정시험양성, 비발생 : 음성 양성인경우 1 EC발효관으로부터 1백금이따서 EMB 평판배지 streaking 2 35 에서 24시간배양 - 9 -

3 4 유당배지및보통한천배지에접종 유당배지 48 시간배양, 보통한천사면배지 24시간배양 유당한천배지가스발생시보통한천사면배지에서집락을취함 5 그람음성, 무아포성간균시 ---- 생화학시험 대장균군양성판정 6 동정 - 그람음성용 API 20E 사용 : http://apiweb.biomerieux.

10 3 4 유당배지및보통한천배지에접종 유당배지 48 시간배양, 보통한천사면배지 24시간배양 유당한천배지가스발생시보통한천사면배지에서집락을취함 5 그람음성, 무아포성간균시 ---- 생화학시험 대장균군양성판정 6 동정 - 그람음성용 API 20E 사용 : 에서확인 - VITEC GNI 카드를이용 : 카드에 oxidase(-) 결과표시하여동정 건조필름법 1 검체처리법의검체에따른시험용액조제방법에따라시험용액 희석액 1ml 을대장균건조필름배지 [ 배지55 에접종 1ml과각단계별 2 35 에서 24-48시간배양 -> 판정 : 푸른색집락중주위기포를형성 3 집락수계산한후희석배수곱하여대장균수산출 < 사용배지 > * EC Broth(CM853): -spore former 와 enterococci 의성장을저해, 분변대장균의선택적증균배지 * EMB(CM69)-Eosin Methylene Blue Agar - 장내미생물(E.coli, Enterobacter aerogenes) 의감별을위한분리배지 - 광산화를막기위해배지는빛을피해보관해야함 - 대장균을의심되는집락에대해더많은실험이필요함( 금속성광택 ) - 탄수화물분해시암녹색또는보라색계열의색( 광택나는짙은보라색 ) 이발생되기도함. 따라서모든대장균균주가초록색금속성광택을가지는것이아니므로이특성만으로섣불 리확신해서는안된다

11 < 병원성대장균 (Pathogenic Escherichia coli) ) > 1. 성상 -정상대장균과는달리유아에게전염성설사증이나성인의급성장염을일으키는대장균 ( 사람이나동물의대장상재균(E. coli) 은장관외감염에있어화농성질환등의원인이될수있는있지만식중독의원인이되지는않음 ) - 형태와성상은비병원성대장균과비슷함: 그람음성간균, 주모성편모가있어서운동성이 있으나편모가없고비운동성인것도있음 -lactose, fructose 를분해하여산과가스생산, 호기성또는통성혐기성균 - 일반대장균과병원성대장균사이에는항원성의차이가있는데, 항원성분( 균체항원:O 항원, 협막항원:K 항원, 편모항원:H 항원) 의면역학적특이성에의해구별되어짐. * 180여종의 O 항원, 90여종의 K 항원, 50여종의 H항원으로분류하고있음 2. 분류 1 장관출혈성대장균 (Enterohemorrhagic E. coli) - 혈변과심한복통 -Verotoxin: 인체내에생성하여병을일으키며 개의적은균량으로도발병가능 -O26,O103, O104, O111,O113,O146, O157 등 *O157:H7 : 1982 년미국에서햄버거에의한식중독사건으로처음알려짐. 세계각국의주요식중독원인균으로여겨지고있음 2 장관독소원성대장균 (Enterotoxigenic E. coli) - 콜레라와같은설사증, 복통, 구토, 산성증, 피로, 탈수등 -Enterotoxin: 콜레라와유사한독소, 이열성또는내열성있음 -O27, O63, O78, O114, O115, O128, O148, O153, O159, O167 등 3 장관침투성대장균 (Enteroinvasive E. coli) - 발열, 복통, 혈액과점액이섞인설사 -O28, O112, O124, O136, O143, O144, O152, O164, O167 등 4 장관병원성대장균 (enteropathogenic E. coli) -1 세이하의신생아에게주로발생, 구토, 복통, 설사, 발열증상 - 오염된신생아용분유와유아음식이원인식품 -O44, O55, O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O142, O158, O

4. 황색포도상구균 ( (Staphylococus aureus) 1. 성상및특징 사람과동물의화농성질환의가장중요한원인균 식중독의원인균으로도가장중요한것중하나이다.

원인식품으로김밥, 슬라이스햄, 소시지, 주먹밥, 황색포도상구균 도시락, 샌드위치 ( 전분질식품에많음) 등 2.

aureus 선택용이) 2 35-37 에서 16시간배양 (2) 분리배양 1 난황첨가만니톨식염한천배지및 2 37 에서 16-24시간배양 3 Baird-Parker agar에접종 (potassium

12 4. 황색포도상구균 ( (Staphylococus aureus) 1. 성상및특징 사람과동물의화농성질환의가장중요한원인균 식중독의원인균으로도가장중요한것중하나이다. 그람양성, 포도상배열을가지는구균 일상적인음식물의조리과정상잘파괴되지않는 내열성장독소(enterotoxin) 생성,Coagluase 양성 10% 식염농도, 온도에서발육이가능 원인식품으로김밥, 슬라이스햄, 소시지, 주먹밥, 황색포도상구균 도시락, 샌드위치 ( 전분질식품에많음) 등 2. 검출방법 (1) 증균배양 1 검체 25g 또는 25ml ml TSB 배지 + 10% NaCl (S.aureus 선택용이) 에서 16시간배양 (2) 분리배양 1 난황첨가만니톨식염한천배지및 2 37 에서 16-24시간배양 3 Baird-Parker agar에접종 (potassium tellurite 를환원하여검은색집락형성) MSA 에서황색불투명집락을나타내고주변에혼탁한백색환( 난황반응양성) 이 있는집락은확인시험 => mannitol을분해하여 yellow zone, yellow colony 형성 => lecithinase egg yolk 분해하여집락주위 clear zone 형성 * lipase 활성으로침전물이불투명 zone 을형성할수있음. MSA Baird-Parker agar

(3) 확인시험 1 보통한천배지에접종 2 37 에서 18-24시간배양 3 그람염색: 포도상의배열을갖는 그람양성구균확인 그람염색 : 양성 4 coagulase( 토끼, 사람혈장응고인자) 시험 5 => 혈장내 fibrinogen과반응하여 clumping 토끼혈청( 신선혈청 5%, 건조혈청용액 10%) 가한 생리식염수를멸균한시험관에 0.5m - 1.

13 (3) 확인시험 1 보통한천배지에접종 2 37 에서 18-24시간배양 3 그람염색: 포도상의배열을갖는 그람양성구균확인 그람염색 : 양성 4 coagulase( 토끼, 사람혈장응고인자) 시험 5 => 혈장내 fibrinogen과반응하여 clumping 토끼혈청( 신선혈청 5%, 건조혈청용액 10%) 가한 생리식염수를멸균한시험관에 0.5m - 1.0ml 씩분주 coagulase : 양성 6 보통한천배지에서순수배양시킨균 1백금이를접종하여 37 에서배양 7 배양후 3,6,9,24시간의각시간에응고의유무를판정하여어느시간후에는응 고또는섬유소(fibrin) 가석출된것은 coagulase 양성 --- 황색포도상구균판정 ( 대조균실험필요) 8 미생물동정기로동정 - 황색포도상구균용 API Staph 사용 : 에서확인 - VITEK GPI 카드를이용 : 카드에 coagulase(+), catalase(+) 결과표시하여동정 3. 정량시험 (1) 균수측정 1 검체 25g 또는 25ml 225ml 멸균인산완충액희석액에가하여 2분간고속으로균질 2 3 화실시하여시험용액으로함 멸균인산완충희석액을사용하여 10배단계별희석액을만듬 Baird-Parker 한천평판배 3장에 0.3ml, 0.4ml, 0.3ml씩총접종액이 1ml이되도록 함 4 접종액이배지에완전히흡수되도록함(10 분정도방치) 5 35 에서 45~48시간배양 6 투명한띠로둘러싸인광택의검정색집락을계수 (2) 확인시험 1 계수한평판에서 2 37 에서 18-24시간배양 3 황색포도상구균 5개이상의전형적인집락을선별하여보통한천배지에접종 (1) 정성시험법의확인시험법에따라확인시험

[ 그외황색포도상구균실험방법 1. DNase 시험 ; 내열성 DNase 생산여부확인 2. blood agar 시험 : 용혈인자확인 [DNase : 양성 [blood agar: 양성 4.

reagent와동시실험함 test reagent control reagent ( 항상음성 ) *Baird-parker Agar: -coagulase-positive staphylococci -egg yolk

-coagulase-positive staphylococci 는 pstassium tellurite를환원하여검은색집락형성 -lipase 활성으로인해침전물이불투명한 zone 을형성할수있다.

14 [ 그외황색포도상구균실험방법 1. DNase 시험 ; 내열성 DNase 생산여부확인 2. blood agar 시험 : 용혈인자확인 [DNase : 양성 [blood agar: 양성 4. Staphylase 시험 sheep red blood cell에민감한 fibrinogen의응집으로 coagulase 를검출하며, 반응 의재현성은 sheep red blood cell에민감하지않은 control reagent와동시실험함 test reagent control reagent ( 항상음성 ) *Baird-parker Agar: -coagulase-positive staphylococci -egg yolk tellurite emulsion 과함께사용 분리및추정동정 -Lecithinase를가지고있는 staphylococci 는 egg yolk를분해하여집락주위에 clear zone 을형성함 -coagulase-positive staphylococci 는 pstassium tellurite를환원하여검은색집락형성 -lipase 활성으로인해침전물이불투명한 zone 을형성할수있다. *Mannitol salt agar: - 약간의호염성균을제외한대부분의균이저해, 선택성이강함 -배지내의 mannitol을분해하여 yellow zone을가진 yellow colonies를형성하여비벼 원성 Staphyococci는 mannitol을분해하지않아주변배지의색깔변화가없으며크기가 작은 red colonies 형성

15 1968 MRSA(Methicillin resistant staphylococcus aureus) Cephalosporine 계, β -lactam 계항생제내성 Vancomycin 이가장강력한항생제였음 VRE(Vancomycin 내성장구군 ) 발견 (1986 영국 ) VRSA 발견 (1996 년일본, 미국, 유럽, 한국 ) =>super bacteria 법정전염병으로지정

5. 살모넬라 (Salmonella) 1. 성상및특징 미국 Campylobacter에이어두번째로중요한식중독 그람음성, 비아포성, 통성혐기성간균 크기(0.5-1.0 1-5um) 으로서주모를가져서 대부분운동성이있지만운동성이 대장균군과는달리 없는것도있음 lactose을분해하지못함 (lactose 분해하는 sal.spp.

검출방법 (1) 증균배양 1 대조 2 1 검체 25g 또는 25ml를취하여 225ml의 buffered peptone water에 가함 ( 열, 건조, 보조제, 높은삼투압, ph 변화등 식품보존방법으로손상된살모넬라의치료및 회수촉진 ) 2 35 에서 18시간배양 3 배양액 0.

16 5. 살모넬라 (Salmonella) 1. 성상및특징 미국 Campylobacter에이어두번째로중요한식중독 그람음성, 비아포성, 통성혐기성간균 크기( um) 으로서주모를가져서 대부분운동성이있지만운동성이 대장균군과는달리 없는것도있음 lactose을분해하지못함 (lactose 분해하는 sal.spp. 발견 ISO 에서는개정되었음< 노란책 p60>) 원인식품: 육류, 가금류, 달걀등 2. 검출방법 (1) 증균배양 1 대조 2 1 검체 25g 또는 25ml를취하여 225ml의 buffered peptone water에 가함 ( 열, 건조, 보조제, 높은삼투압, ph 변화등 식품보존방법으로손상된살모넬라의치료및 회수촉진 ) 2 35 에서 18시간배양 3 배양액 0.1ml 를취하여 10ml 의 Rappaport-Vassilliadis 배지에접종 4 42 에서 24시간배양 [Rappaport-Vassilliadis * RV: Salmonella spp. 선택증균, malachite green, 높은삼투압, 낮은 ph로장내세균의여러 균들을저해하여선택성높음. (2) 분리배양 1 증균배양액을 MacConkey한천배지또는 Desoxycholate Citrate 또는 XLD <Xylose 분해 특성및 lysine 탈카르보닐화특성이용> 또는 bismuth sulfite 한천배지에접종 2 35 에서 24시간배양 3 의심나는집락은확인시험 * Desoxycholate Citrate 한천배지: sodium citrate, sodium deoxycholate 그람양성, coliform, proteus spp. 저해

[MacConkey 한천배지 [Desoxycholate Citrate [XLD 한천배지 CHROM agar -매우높은 sensitivity, specificity 로위양성을감소시킴,

* Enzymatic chromogenic substrate 사용으로집락자체만색깔을띄므로 color diffusion, color overlap 살모넬라용 CHROM agar

분리배양된평판배지상집락을보통한천배지에접종 2 35 에서 18-24시간배양후 3 TSI 사면배지의사면과고층부에접종 4 35 에서 18-24시간배양후생물학적검사 5 그람음성, 간균확인 -

17 [MacConkey 한천배지 [Desoxycholate Citrate [XLD 한천배지 CHROM agar -매우높은 sensitivity, specificity 로위양성을감소시킴, 추가동정시험감소 - 뚜렷한집락색을나타냄 : 일반선택배지( 지시약으로인한고유색나타냄) 고달리, CHROM agar는투명한베이 지색으로목적균확인이쉬움. * Enzymatic chromogenic substrate 사용으로집락자체만색깔을띄므로 color diffusion, color overlap 살모넬라용 CHROM agar -amphotericin B: Candida 속저해 없어용이 -sodium cefsulodin: proteus(salmonella 집락위에겹쳐자람) 성장억제 (3) 확인시험 생화학적확인시험 1 분리배양된평판배지상집락을보통한천배지에접종 2 35 에서 18-24시간배양후 3 TSI 사면배지의사면과고층부에접종 4 35 에서 18-24시간배양후생물학적검사 5 그람음성, 간균확인 - 그람음성용 API 20E 사용 : 에서결과확인 - VITEC GNI 카드을이용 : 카드에 oxidase 결과표시하여동정 ---- urea 시험 ( 음성), lysine decarboxylase( 양성)

18 [ 그람염색 : 양성 TSI 사면배지 24시간배양후 - Glucose 분해, Lactose, Sucrose 비분해, 가스생성, H 2 S 생성 ( ) Control ( ) ATCC ( ) 검체 No.1 응집시험 Spicer-Edwards 등과같은 H 혼합혈청과 O 혼합혈청응집반응 [ 살모넬라응집시험 ( ) Salmonella test kit (oxoid) - 응집반응나타남. ( ) 살모넬라진단용혈청 ( 국립보건원) - 응집반응나타남

( 설사형, 구토형으로구분됨) 1 설사형 : 원인식품 : 육류, 스프류, 소스류, 소시지, 푸딩등다양한식품 증상 : Clostridium perfringens

원인식품 : 대부분쌀밥, 볶음밥, 스파게티등전분을주원료로하는 식품들 증상 : Staphylococcus aureus 식중독과유사하여음식섭취 0.

19 6. 바실러스세레우스 ( (Bacillus cereus) 1. 성상및분류 그람양성의간균( 사슬형태의배열), 편모를소유하여운동성양성 내열성의아포형성, 호기성세균 토양, 수중, 공기등자연계에널리분포, 증식온도 : 5~ 50 독소생성 ( 설사형, 구토형으로구분됨) 1 설사형 : 원인식품 : 육류, 스프류, 소스류, 소시지, 푸딩등다양한식품 증상 : Clostridium perfringens 식중독증상과유사하여음식섭취 6~15 2 구토형 : 시간이후에수인성설사, 어지러움및복통등이발생하며, 때때로 메스꺼움이설사와동반되기도함. 원인식품 : 대부분쌀밥, 볶음밥, 스파게티등전분을주원료로하는 식품들 증상 : Staphylococcus aureus 식중독과유사하여음식섭취 0.5~6 시간의잠복기후에메스꺼움, 구토가발생하며, 가끔심한복통 및설사를일으키나, 대개 24시간이내에회복됨 2. 검출방법 1 검체 25g( ml) 을취하여 225ml의인산완충희석액에가하여균질화 2 MYP agar에접종하여 30, 24시간배양 * 혼탁한환의분홍색집락을선별 3 NA에접종하여 30, 24시간배양 4 그람염색및각종생화학시험등

5 운동성, nitrate 환원능, VP, β-haemolysis, 혐기배양시포도당이용등 6 동정 - 그람양성용 API 50CHB 사용 : http://apiweb.biomerieux.

정량시험 (1) 균수측정 1 검체 25g( ml) 을취하여 225ml의인산완충희석액에가하여 2분간균질화 2 멸균인산완충액을사용하여 10-2 ~ 10-6 까지다단계희석 3 MYP agar에단계별희석액 0.

20 5 운동성, nitrate 환원능, VP, β-haemolysis, 혐기배양시포도당이용등 6 동정 - 그람양성용 API 50CHB 사용 : 에서결과확인 : Bacillus cereus 까지동정 - VITEC BAC 카드을이용 : Bacillus cereus group으로동정 API KIT 로동정하는것이유리 3. 정량시험 (1) 균수측정 1 검체 25g( ml) 을취하여 225ml의인산완충희석액에가하여 2분간균질화 2 멸균인산완충액을사용하여 10-2 ~ 10-6 까지다단계희석 3 MYP agar에단계별희석액 0.2ml씩 5장총 1ml 분주 4 30, 24시간배양 5 집락주변에 lecithinase 를생성하는혼탁한환이있는분홍색집락계수 (2) 확인시험 1 계수한평판에서 2 37 에서 18-24시간배양 3 바실러스세리우스 5개이상의전형적인집락을선별하여보통한천배지에접종 (1) 정성시험법의확인시험법에따라확인시험

<0-45 >) 2. 검출방법 증균배양 우유, 유제품, 가공식품및수산물검체경우 Listeria 증균배지 [ 배지 35 식육및가금류검체 1차증균배지 UVM-modified Listeria 증균배지 [ 배지36 1 검체 25g 또는 25ml 증균배지 2 30 에서24시간배양 3 식육및가금류검체경우 : 배양액 0.

21 7.Listeria monocytogenes 1. 성상및분류 50 년이상인축공통병원균으로야생동물및가금류, 오물 그리고폐수에분리보고 그람양성, 비아포성균, 통성혐기성간균, catalase 양성, oxidase 음성, 혈액배지에서투명대를생산하는 β-hemolysin 을가지고있음 원인식품으로우유, 유제품, 식육, 식육가공품, 난제품, 야채 * 열저항력이강 ( 냉장온도성장가능 <0-45 >) 2. 검출방법 증균배양 우유, 유제품, 가공식품및수산물검체경우 Listeria 증균배지 [ 배지 35 식육및가금류검체 1차증균배지 UVM-modified Listeria 증균배지 [ 배지36 1 검체 25g 또는 25ml 증균배지 2 30 에서24시간배양 3 식육및가금류검체경우 : 배양액 0.1ml Fraser Listeria 배지[ 배지 3510ml에접종 2차증균 (esculin 가수분해, supplement 첨가된 ferric ion 과반응해배지가흑색으로 ) 분리배양 1 증균액을멸균된면봉이용 Oxford agar 한천배지또는 lithium chloride -phenylethano l-moxalactam 한천배지및 PALCAM 한천배지에접종 (esculin 가수분해, supplement 첨가된 ferric ion과반응하여 black colony 형성 2 30 에서 24-48시간배양 3 의심집락확인시 포함된 Tryptic Soy 4 30 에서 24-48시간배양 0.6% yeast extract가 한천배지에접종

[ Oxford agar 배지접종직후 [Oxford agar 에서 48 시간배양후 (

22 [ Oxford agar 배지접종직후 [Oxford agar 에서 48 시간배양후 ( ) Listeria monocytogenes (ATCC 15313) ( ) 검체 No. 1 (Listeria 증균배지) 확인시험 시 험 결 과 비고 β - hemolysis 양성 catalase 양성 motility 양성 CAMP TEST Staphylococcus aureus ATCC : 양성 Rhodococcus equi ATCC6930 : 음성 mannitol 비분해 rhamnose 분해 xylose 비분해

23 표준균주검체 1 검체 2 [ β - hemolysis [Motility : 배지전체에균이퍼져서자라면양성 [ 4% 보통한천고층배지배양 24 시간후 Control 2 Listeria monocytogenes (ATCC 15313) : 양성 3 4 검체 No. 1 (FraserListeria 배지) : 양성 검체 No. 1 (Listeria 증균배지) : 양성 [CAMP test Staphyiococcus aureus(atcc 25923) : Rhodococcus equi(atcc 6939) : 음성 양성 Fig. 16. 면양혈액한천배지(BAP) 배양 24시간후 ( ) Listeria monocytogenes (ATCC 15313) : 양성 ( ) 검체 No. 1 (FraserListeria 배지) : 양성

24 ( ) 검체 No. 1 (Listeria 증균배지) : 양성 동정시험 - 그람양성용 API Listeria 사용 : 에서결과확인 : Listeria monocytogenes 까지동정 - VITEC GPI 카드을이용 : Listeria sp. 로동정 API KIT 로동정하는것이유리

25 8. 균동정을위한시험방법 8-1. 그람염색방법 TSA 배지에분리균을배양 분리균을생리식염수로연하게희석 슬라이드글라스에백금이로연하게깔라줌( 원모양으로) 알코올램프위에서열기로고정( 너무가까이로가서태우면안됨) 염색시약인 crystal violet solution 을떨어뜨러균체를적셔줌 (1 분동안 ) 슬라이드글라스위에있는 crystal violet solution 버리고 Lugol's solution으로씻어냄 Lugol's solution 을떨어뜨러균체를적셔줌 (1 분동안 ) 약하게흐르는물로 Lugol's solution을씻어줌 슬라이드그라스를탈색액( 에탄올또는메탄올) 에담그어흔들어주면서탈색시킴 약하게흐르는물로씻어줌 슬라이드글라스위에 safranine solution 을떨어뜨러균체를적셔줌 (1 분동안 ) 약하게흐르는물로씻어주고말려줌 슬라이드글라스위에커버글라스를덮고 mineral oil를떨러드려현미경으로검경 [ 대장균 : 음성 [ 황색포도상구균 : 양성

26 8-2. Coagulase 시험방법 [ 시약예 : Mecrk 사 Bactident Coagulase - 동결건조된토끼혈청 다른시약회사에서도판매되고있음 TSA 배지에분리균을배양하여준비함 Bactident Coagulase 시약 1병에 DW 3ml을넣어녹여줌 피펫을이용하여작은시험관에 미리배양한표준균주와분리균주를 있는시약에접종함 0.3ml씩분주함 1/2 conoly를따서시험관내에 37 배양기에서매 1시간간격으로시약이응고되는지관찰함 위에서부터 1 : Negative 2.: 표준균주 3.: 분리균 1 4.: 분리균 2 5.: 분리균

27 8-3. Haemolysis 시험방법 [ 배지 : sheep blood agar plate - 아산제약 다른시약회사에서도판매되고있음 병원성균분리및용혈서시험에사용 TSA 배지에분리균을배양하여준비함 sheep blood agar plate에분리균을백금이로접종 각분리균의지정된온도에서배양후 plate 관찰 [ 황색포도상구균 : 양성

28 8-4. CAMP 시험방법 : Listeria monocytogesis 확인시험 [ 배지 : sheep blood agar plate - 아산제약 다른시약회사에서도판매되고있음표준균주 : Staphyiococcus aureus(atcc 25923) Rhodococcus equi(atcc 6939) : 음성 TSA 배지에분리균을배양하여준비함 sheep blood agar plate에표준균및분리균을백금이로접종후배양 분리균은평행하게접종 S.aureus R. equi 직선으로접종

29 8-5. Motility 시험방법 [ 배지 : Motility test medium - BBL agar 농도가 0.35% 정도들어가반유동배지임 다른시약회사에서도판매되고있음 TSA 배지에분리균을배양하여준비함 Motility test medium이들어있는시험관에에표준균및분리균을백금선로찔어접종후배양(35, 2 일) 접종한중심부로부터솜털처럼퍼저서자라면양성 [ 음성양성양성양성

30 8-6. Catalase 시험방법 [ 시약 : Mecrk 사 Bactident Catalase-3% hydrogen peroxide 다른시약회사에서도판매되고있음 TSA 배지에분리균을배양하여준비함 분리균을슬라이드글라스위에백금이로접종 분리균위에시약을스포이드나피펫으로떨어뜨림 균체에서기포가형성유무를확인함

31 8-7. Oxidase 시험방법 [ 시약 : Mecrk 사 Bactident Oxidase-N,N-dimethyl-1,4-phenylene dammonium chloride 0.1umol; 1-naphthol 0.1umol 다른시약회사에서도판매되고있음 TSA 배지에분리균을배양하여준비함 분리균을 strip 위 reaction zone에백금이로접종 20~30초후 reation zone의색깔관찰 양성 : blue to blue-violet 예) 양성균 : Vibrio spp, Campylobacter spp, 음성균 : Staphylococuss spp, Listeria spp, Bacillus spp

32 8-8. API 동정방법 예 ) Listeria 추정균 API 동정시험 분리균을현탁에사용되는앰플로뚜껑을밀면주입구 가깨져사용할수있음 순수분리균을 TSA 배지에배양하여각 API KIT 농도 에맞게현탁을함 -- 균체를떠서앰플에풀어탁도 를맞춤 : Listeria는 McFarland 1에맞춤 탁도계는사용전보정을실시함투고도 0 : Malacate green solution 투과도 100 : 앰플에들어있는생리식염수 탁도를맞춘액을 DIM 칸에 100ul를넣어줌 그외 ESC에서 TAG까지는 50ul를넣어줌 현탁액을넣은후사진 사진 : 각동결건조된시약이용해된

33 현탁액을넣은 넣어배양동안마르지않게함 strip를배양할인큐베이션박스에물을 36 에서 24 시간배양후사진 : 균이각 well의성분 을이용하면노랗게변함 DIM well에는 함 ZYM B를시약을떨어뜨려반응을판독 항상표준균주와같이실험을해야좋은결과판독을 쉽게할수있음 결과판독지에성분을이용했으면 +, 아니면 -로기록 후 API 정보를넣을홈페이지들어가결과정보입력 로그인후 Listeria 동정에클릭하여들어가판독지정 보입력 판독지정보를이용하여동정하면현재동정하는균이 어느균과가장가까운지나타냄 특별한장비가없어도시약을구매하여각균을동정할수있음

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Microsoft PowerPoint - PDFCoTemp.PPT 주요유방염세균의검출및 항생제감수성검사 임숙경 1. 검사시료 1. 시료채취 유방염우유 2. 체세포수측정 3. 대상세균 - Staphylococcus aureus - Coagulase negative staphylococci -Escherichia coli 3. 균분리방법 E. coli CHEC Agar 직접도말 (37 18-24h) 보라색집락 EMB Agar