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1 임상병리와정도관리 : 제 25 권제 2 호 2003 J. Lab. Med. & Quality Assuarance 2003:25: Microplate 를이용한장구균동정법 어영 황규열 장인호 윤갑준 이경원 * 이형환 ** 연세대학교원주의과대학진단검사의학과, 연세대학교의과대학진단검사의학과 *, 건국대학교생명과학과 ** Identification of Enterococcus Species Using a Microplate Young Uh, Gyu Yul Hwang, In Ho Jang, Kap Jun Yoon, Kyungwon Lee*, and Hyung-Hoan Lee** Department of Laboratory Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, Wonju, Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine, Seoul*, Department of Biological Sciences, Konkuk University, Seoul, Korea** Background:The aim of the study was to develop an accurate, convenient, and easy microplate system for the identification of enterococcal species from clinical specimens. Methods:The microplate identification method was composed of twelve biochemical tests and identification programs. The tests comprised in microplate were initially screened by a two-tube method, NaCl-esculin hydrolysis and pyrrolidonyl-β-naphthylamide test; arginine dihydrolase, acid production from mannitol, sorbitol, sucrose, arabinose, raffinose, methyl-α-d-glucopyranoside, and ribose in the microplate; and pigment production and hemolytic pattern in blood agar plate. The performance of the microplate for identifying enterococci to the species level was evaluated in comparison with conventional reference tests and commercial kits. Results:Among the 111 clinical isolates of Enterococcus species, the microplate system correctly identified 100% to genus level, and 91.0% to species level. All of E. casseliflavus, E. durans, and E. hirae were correctly identified by the microplate. The diagnostic sensitivity and specificity for identification of Enterococcus species were as follows: 100% and 96.7% in E. faecium, 93.5% and 100% in E. faecalis, 100% and 97.2% in E. raffinosus, and 33.3% and 98.1% in both E. avium and E. gallinarum. Conclusions:It is concluded that the microplate method offers a simple, cost-effective, rapid, and accurate identification system for the identification of most clinical isolates of Enterococcus species. Key Words:Enterococcus, Identification, Microplate 교신저자 : 어영우 ) 강원도원주시일산동 162 원주기독병원진단검사의학과전화 :033) , FAX:033) u931018@wonju.yonsei.ac.kr 서 세균동정을위해서는전통적인방법과상품화된제품을이용하는방법이있다. 최근에는분자생물학적방법들이균종동정에이용되기시작하였으나 [1], 흔히분리되는균종에는통상적으로이용되지는않는다. 장구균은병원성이낮은균종으로인식하였을뿐만아니라감별동정하기가어려 론 워과거에는균속수준으로만동정하였으나, 임상검체에서의분리빈도가높아지고균종별로항균제감수성양상에차이가많기때문에장구균감염증을적절히치료하기위해서는정확한균종동정이필요하게되었다. 그러나, 실제로장구균의전통적방법에의한균종수준에서의동정이가능하게된것은 1989 년 Facklam 및 Collins 가장구균의균종별동정방법을발표한이후로서 [2], 그이후로일부검사실에서장구균의간략동정법을사용하기시작하였다 [3]. 그러나 Facklam 및 Collins 의장구균동정법 [2] 은생화학시험종목수가다소많고시약의가격이비싼점이있으며결과판정시간이오래소요되므로일반검사실에서통상적으로사용하기에는어려움이있다. 이에많은검사실에서는

2 216 어영 황규열 장인호 윤갑준 이경원 이형환 상품화된동정제품을이용하지만제품의가격이비싸며, 장구균의균종별생화학성상에대한자료가적고, 균종간생화학적성상이유사한경우가많기때문에동정데이터베이스가없거나부실한경우에는정확한동정이안되는경우가있다 [4-7]. 따라서일부검사실에서는 Facklam 및 Collins 의장구균동정법 [2] 을변형한방법또는선별시험후균종군별로추가시험을시행하는방법을사용하기도한다 [3,8-10]. 본연구에서는이전의장구균의간략동정법 [10] 을개선한 microplate 동정법의유용성을평가하고자하였다. 재료및방법 1. 동정시험의구성과검사방법 Microplate 를이용한동정법은장구균선별시험인 pyrrolidonyl-β-naphthylamide (PYR) 시험과 NaCl-esculin 가수분해시험, microplate 에서시험하는 mannitol, sorbitol, arabinose, raffinose, sucrose, methylα-d-glucopyranoside (MGP) 와 ribose 의 7가지당분해시험과 arginine dihydrolase (ADH) 시험, 사람혈액한천배지에서의노란색소형성과용혈성시험으로모두 12 가지동정시험으로구성하였다. 장구균의 microplate 동정법에사용된시험중신속선별시험인 NaCl-esculin 가수분해와 PYR 시험은액체배지를사용하였고 [11], ADH 시험과 7가지의당분해시험은전통적방법대로 ph와당농도를맞춘배지를제조한후멸균된 U shaped 96 well microwell plate (Nunc, Denmark) 에 200 μl를무균적으로분주하여고체배지를만들었고, 노란색소시험과용혈성시험은혈액한천배지를사용하였다. 장구균의 microplate 배지의집락접종은평판배지에서장구균이순수분리될경우에는 4개의 microplate well 에한번에접종할수있는 4지접종침을사용하였고, 평판배지에집락이섞여있을경우에는일반적인접종침을이용하여접종하였다. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. saccharolyticus, E. raffinosus, E. sulfureus, Lactococcus garvieae, Streptococcus bovis I, Streptococcus bovis ll 및 Vagococcus fluvialis 의 20균종이다. 3. Microplate 동정법의평가 1) 표준균주와의비교 Microplate 장구균동정법의정확도를평가하기위하여 E. malodoratus ATCC 43197, E. raffinosus ATCC 49427, E. faecalis ATCC 29212, E. faecalis ATCC 51299, E. faecium ATCC 19434, E. faecium ATCC 35667, E. casseliflavus ATCC 25788, E. gallinarum ATCC 49753, E. durans ATCC 19472, E. hirae ATCC 9790, E. sulfureus ATCC 49903, E. flavescens ATCC 의 12개의표준균주를대상으로 microplate 동정법을평가하였다. 2) 임상분리주의동정력평가 2002 년 10월동안대변을포함한임상검체에서연속하여분리된장구균 111 주를대상으로 microplate 장구균동정법과 API Strep 20과 API rapid ID 32 Strep (bio- Mérieux, France) 을동시에시험한후각동정법에서시험하는생화학성상과균동정명을비교하였다. 생화학시험의양성과음성의기준은 3종류의동정법에서 2종류이상이양성이거나음성인경우를각각양성과음성으로정하였다. 최종동정명은 3가지동정법에서균종명이일치하면최종동정명으로하였고, 3가지동정법에서불일치를보일때에는운동성시험, sorbose 당분해시험, tellurite 내성시 2. 동정프로그램의개발장구균의균종동정방법은동정확률법 (%ID) 을이용하였다. 동정프로그램은 C- 언어와 visual basic 을이용하여개발하였고, 동정확률법은 Koneman 등 [12] 의방법을이용하되균종별생화학반응양성률이 0이면 을곱하여확률을산출하도록프로그램을구성하였고, 감별동정이어려운균종이분리되었을때의추가시험에대한 comment file을작성하여화면에표시되도록하였으며, 검사자가균종별생화학시험에대한자료를실시간으로비교할수있도록하였다. Microplate 동정법에포함된균종은 E. avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E. dispar, E. durans, E. faecalis, E. flavescens, E. Fig. 1. Biochemical reactions of ATCC strains of Enterococcus species by microplate identification method using direct colony inoculation (Lane 1, mannitol; lane 2, sorbitol; lane 3, arginine dihydrolase; lane 4, arabinose; lane 5, raffinose; lane 6, sucrose; lane 7, methyl-α-d-glucopyranoside; lane 8, ribose).

3 Microplate 를이용한장구균동정법 217 험을추가하였으며, microplate 법과상품화된동정제품에서생화학성상의불일치를보이는균종은전통적인생화학시험결과를기준으로하되, 전통적인방법으로감별되지않는균주는두가지동정법에서일치하는생화학시험결과를기준으로균종명을결정하였고, 이같은기준으로도균종을감별하기어려운경우는 Enterococcus species로분류하였다. 결과 1. 표준균주 12균종의장구균표준균주의 microplate 법에서의생화 학성상은육안으로쉽게구분이되었고동정명도정확하였다 (Fig. 1). 2. 임상분리주 Microplate 법과 API 20 Strep 및 API rapid ID 32 Strep 의 esculin 가수분해, PYR 시험, mannitol 과 ribose 시험은모두동일한결과를보였으며, sorbitol, ADH, arabinose, raffinose 와 sucrose 시험은일부균종에서불일치를보였다. sorbitol 시험의 microplate 법과 API rapid ID 32 Strep 및 API 20 Strep 과의일치율은 90.1% 와 93.7% 이었고, sorbitol 시험의 microplate 법, API 20 Strep 과 API rapid ID 32 Strep 의위양성률은 Table 1. Comparison of biochemical reactions of Enterococcus species between microplate identification method and API system Biochemical tests Biochemical reactions by identification methods Microplate API 32 Strep API 20 Strep No. of isolates Bile esculin + NT PYR Ribose Mannitol Sorbitol Arginine dihydrolase Arabinose Raffinose Sucrose - - NT NT NT NT 97 Abbreviations: NT, not tested; PYR, pyrrolidonyl-β-naphthylamide.

4 218 어영 황규열 장인호 윤갑준 이경원 이형환 Table 2. Comparison of identification results between microplate identification method and API 20 Strep for 111 Enterococcus species from clinical specimen Microplate No. of organisms identified by API 20 Strep ID method EAV EDU EFA EFM EGA LAC Total EAV 1 1 ECA EDU 1 1 EFA EFM EGA 1 1 EHI 5 5 EMA ERA Total Abbreviations: EAV, E. avium; ECA, E. casseliflavus; EDU, E. durans; EFA, E. faecalis; EFM, E. faecium; EGA, E. gallinarum; EHI, E. hirae; EMA, E. malodoratus; ERA, E. raffinosus; LAC, Lactococcus lactis. Table 3. Comparison of identification results between microplate identification method and API 32 Strep for 111 Enterococcus species from clinical specimen Microplate No. of organisms identified by API 32 Strep ID method EAV ECA EDU EFA EFM EGA EHI LGA Total EAV 1 1 ECA 7 7 EDU 1 1 EFA EFM EGA 1 1 EHI 5 5 EMA ERA Total Abbreviations: EAV, E. avium; ECA, E. casseliflavus; EDU, E. durans; EFA, E. faecalis; EFM, E. faecium; EGA, E. gallinarum; EHI, E. hirae; EMA, E. malodoratus; ERA, E. raffinosus; LGA, Lactococcus garvieae. 각각 2.7%, 0% 와 0.9% 였으며위음성률은 0%, 6.3% 와 3.6% 였다. Microplate 법의 ADH 시험의위음성률은 36.9% 로높았고위양성은없었다. API rapid ID 32 Strep 의 arabinose 위음성률은 3.6% 였고위양성률은 0.9% 였다 (Table 1). Microplate 동정법과상품화된동정법인 API rapid ID 32 Strep 및 API 32 Strep 의균종수준에서의동정일치율은각각 64.0%(Table 2) 와 55.0%(Table 3) 이었으며, API rapid ID 32 Strep 과 API 20 Strep 의균종수준에서의동정일치율은 56.8% 였다 (Table 4). Microplate 동정법은장구균균속까지는 100% 를동정할수있었고균종수준에서는 91.0% 를정확히동정할수 있었으며, 균종별로 E. casseliflavus, E. durans 와 E. hirae 는 100% 를동정하였고. E. faecium, E. faecalis, E. raffinosus 의동정예민도는 100%, 93.5% 와 100% 였고동정특이도는 96.7%, 100% 와 97.2% 였으며, E. avium과 E. gallinarum 의동정예민도는 33.3% 였고특이도는 98.1% 였다. 반면에 API 20 Strep 과 API rapid ID 32 Strep 은장구균균속까지각각 68.4% 와 60.4% 에서동정명이일치하였다 (Table 5). 고찰그람양성구균인장구균은소화기관이나여성생식기에

5 Microplate 를이용한장구균동정법 219 Table 4. Comparison of identification results between API rapid 32 Strep and API 20 Strep for 111 Enterococcus species from clinical specimen Enterococcus species by No. of Enterococcus species identified by API 32 Strep API 20 strep EAV ECA EDU EFA EFM EGA EHI LGA Total EAV EDU EFA EFM EGA LAC 1 1 Total Abbreviations: EAV, E. avium; ECA, E. casseliflavus; EDU, E. durans; EFA, E. faecalis; EFM, E. faecium; EGA, E. gallinarum; EHI, E. hirae; LGA, Lactococcus garvieae. EMA, E. malodoratus; LAC, Lactococcus lactis. Table 5. The performance of microplate identification method for identifying enterococci to the species level Enterococcus species (No.) Identification results of Enterococcus species according to ID methods Microplate ID method API 20 Strep API rapid 32 Strep Correct Incorrect Correct Incorrect Correct Incorrect No.(%) No. ID No.(%) No. ID No.(%) No. ID EFM (52) 52 (100) 0-40 (77) 8 4 EDU EGA 17 (33) EFA (31) 29 (94) 2 EMA 30 (97) 1 LAC 31 (100) 0 - ECA (7) 7 (100) 0-0 (0) 6 1 EFM EGA EGA EAV ECA 7 (100) 0 - EHI (5) 5 (100) 0-0 (0) 5 EDU 5 (100) 0 - ERA (5) 5 (100) 0-0 (0) 5 EAV 0 (0) 5 EAV EAV (3) 1 (33) 2 EFM 3 (100) 0-3 (100) 0 - EGA (3) 1 (33) 2 ERA 2 (67) 1 EFM 3 (100) 0 - EDU (1) 1 (100) 0-1 (100) 0-1 (100) 0 - ENT (4) 0 (0) 4-0 (0) 4-0 (0) 4 - Total 101 (91) (68) (60) 44 - Abbreviations: ID, Identification; EFM, E. faecium; EDU, E. durans; EGA, E. gallinarum; EAV, E. avium; ECA, E. casseliflavus; EFA, E. faecalis; EMA, E. malodoratus; LAC, Lactococcus lactis; EHI, E. hirae; ERA, E. raffinosus. 정상상재균으로존재하지만심내막염, 요로감염, 창상감염, 복강내감염등을일으키며, 최근병원감염의주요원인균으로부상하고있다 [13]. 또한장구균은흔히사용하는항균제에대하여자연내성을보이며, 패혈증, 심내막염, 뇌막염, 면역기능저하환자에서의감염등과같이위중한감염이있을때에는 ampicillin 또는 glycopeptide 항균제와 aminoglycoside 계열의약물을병행하여투여해야한다 [13]. 최근문제시되고있는 vancomycin 내성장구균도균종별로병원감염관리방침이다르다. 그러므로임상검체에서장구균의신속한동정과항균제감수성시험은미생물검사실의중요한업무의하나이다. 장구균의집락형태는다른 catalase 음성그람양성구균과유사하며혈액한천배지의용혈성도 α, β 및 γ로다양하므로집락성상만으로는장구균을다른연쇄구균과감별할수없다. 임상검체에서분리된 catalase 음성그람양성구균의동정은상품화된동정제품을이용하면편리하지만검사비용이많이들므로전통적방법을이용하여선별동정을한후그결과에따라추가시험을시행할수있다. 선별시험에서장구균으로판정되면균종수준까지동정해야한다. 장구균을균종수준까지동정하기위해서는 10가지정도의전통적인생화학시험을추가로시행하거나상품화된동정제품또는각장구균에특이한시발체를이용한

6 220 어영 황규열 장인호 윤갑준 이경원 이형환 polymerase chain reaction 법 [14,15] 을사용하면가능하다. 그러나임상검체에서분리되는모든장구균의동정을위하여분자생물학적동정법을사용하는것은비효율적이다. 따라서본연구에서는이전에개발하여사용하고있던장구균간략동정법 [10] 의문제점을개선하고자하였다. 즉, 전통적방법에의한장구균간략동정법은동정시험수가 8가지로적기때문에 E. cecorum, E. columbae 와 E. saccharoliticus 를동정할수없으며, E. hirae 와 E. durans 를감별할수없었고, 장구균과유사한생화학성상을보이는 Lactococcus와 Streptococcus bovis 에대한동정 database 가없으며, 동정방식이동정코드목록에근거하므로비정형생화학성상을가진균주는상품화된제품으로다시동정해야하는문제점이있었다. 이에장구균의감별동정의정확성을높이기위하여기존의간략동정법 [10] 에 mannitol, sorbitol, sucrose, ribose 시험을추가하였고, tellurite 시험은생화학성상의반응이뚜렷하지않아제외하였으며, 장구균선별시험은기존의연구 [11} 를바탕으로 NaCl-esculin 가수분해시험과 PYR 시험을사용하였다. 또한, 장구균간략동정법 [10] 은시험관배지를이용한동정방법이므로배지제조에시간이많이소요되고배지량이많이필요할뿐만아니라모든시험관배지에균주를따로접종해야하므로동정과정이복잡하고접종시간이오래걸리는단점이있었다. Microplate 를이용한장구균의동정법은배지제조가간단하며배지량이적기때문에보관공간이작은장점이있으며한번제조하면 1달동안사용할수있으므로배지제조에소요되는업무량을줄일수있었다. Microplate 를이용한동정법은적은양의균액으로도전통적시험관법보다색변화가뚜렷하였는데이는배지량이적고 microplate 의두께가얇아판독이쉬운것이원인으로생각되었다. Microplate 장구균동정법을 2가지종류의상품화된동정제품과비교해보면, API 20 Strep 은 E. avium, E. durans, E. faecalis, E. faecium과 E. gallinarum 의 5 가지장구균에대한동정 database 만을가지고있으므로 E. avium 과유사한생화학성상을보이는 E. raffinosus 의동정이불가능하고, methyl-α-d glucopyranoside 시험과 sucrose 시험이없으므로 E. faecium 과 E. gallinarum 으로동정된균종을대상으로 E. casseliflavus 와의감별을위한추가시험을해야하는단점이있고, E. hirae 는모두 E. durans 로동정되는문제점이있었다. 또한 mannitol 음성인비정형 E. faecium 은 API 20 strep 에서 E. durans 로동정되는경우가많았다. API rapid ID 32 Strep 도 8가지장구균에대한동정 database 만있으며, E. faecium 을 E. gallinarum 으로동정되는경우가많았다. 반면에 microplate 동정법은장구균의균종수준의동정정확도가 91.0% 로매우높았으며, 균종별로는 E. casseliflavus, E. durans, E. hirae, E. faecium, E. faecalis, E. raffinosus 의대부분을정확히동정할수있었다. 그러나 E. avium 의일부균주는오동정의가능성이있었다. Shewmaker 등 [16] 에의하면 E. avium 은 Globicatella sanguinis, Aerococcus viridans 및 Streptococcus uberis 와생화학성상이유사하여감별동정의어려움을보고하였는데, 이러한문제점을해결하기위해서는 microplate 동정법에 sorbose 당분해시험을추가할필요성이있었다. 요약배경 : 본연구에서는임상검체에서분리되는장구균을사용이편리하면서도정확하고신속하게동정할수있는 microplate 동정법을개발하고자하였다. 방법 : 새로개발한 microplate 를이용한장구균의동정법은 12개의생화학시험과동정프로그램으로구성하였다. 생화학시험은두개의시험관배지에서시험하는신속선별시험인 NaCl-esculin 가수분해시험과 PYR 시험, microplate 에서시험하는 arginine dihydrolase 시험, mannitol, sorbitol, arabinose, raffinose, sucrose, methyl-α-d-glucopyranoside 및 ribose 당분해시험과혈액한천배지에서시험하는색소시험과용혈성시험으로구성하였다. 동정프로그램은 visual basic 과 C 언어를이용하여개발하였다. Microplate 를이용한장구균동정법의균종수준에서의동정력은전통적인참고방법과상품화된제품을이용하여평가하였다. 결과 : 임상검체에서분리된 111 균주의장구균중에서 microplate 를이용한장구균동정법은장구균균속까지는 100% 를동정할수있었고균종수준에서는 91.0% 를정확히동정할수있었으며, 균종별로 E. casseliflavus, E. durans와 E. hirae 는 100% 를정확히동정할수있었고, E. faecium, E. faecalis, E. raffinosus 의동정예민도는 100%, 93.5% 와 100% 였고동정특이도는 96.7%, 100% 와 97.2% 였으며, E. avium 과 E. gallinarum 의동정예민도는 33.3% 였고특이도는 98.1% 였다. 반면에 API 20 Strep 과 API rapid 32 Strep kit 는장구균균속까지각각 68.4% 와 60.4% 를정확히동정하였다. 결론 :Microplate 장구균동정법은임상검체에서분리되는대부분의장구균을신속하고정확하게동정할수있었으며, 검사소요비용이저렴하면서도사용이편리한동정법으로생각되었다. 참고문헌 1. Donabedian S, Chow JW, Shlaes DM, Green M, Zervos MJ. DNA hybridization and contour-clamped homogeneous electric field electrophoresis for identification of enterococci

7 Microplate 를이용한장구균동정법 221 to the species level. J Clin Microbiol 1995;33: Facklam RR, Collins MD. Identification of Enterococcus species isolated from human infections by a conventional test scheme. J Clin Microbiol 1989;27: 정윤섭, 김영옥, 권오헌. 임상검체에서분리되는 Enterococcus의균종동정을위한간이감별법의고안. 임상병리와정도관리 1991;13: 신종희및양동욱. Aminoglycoside 고도내성 enterococci의빈도및임상적특성. 대한임상병리학회지 1993;13: 홍기숙, 강은숙, 이미애. Vancomycin 내성 enterococci의빈도조사및중합효소연쇄반응을이용한유전자형의분석. 대한임상병리학회지 1998;18: Ruoff KL, de la Meza L, Murtagh MJ, Spargo JD, Ferraro MJ. Species identities of enterococci isolated from clinical specimens. J Clin Microbiol 1990;28: Sader HS, Biedenbach D, Jones RN. Evaluation of Vitek and API 20S for species identification of enterococci. Diagn Microbiol Infect Dis 1995;22: Buschelman BJ, Bale MJ, Jones RN. Species identification and determination of high-level resistance among enterococci: comparison study of sterile body fluid isolates, Diagn Microbiol Infect Dis 1993;16: 김명숙, 김선희, 강지연, 용동은, 이경원, 정윤섭등. 장구균동정을위한변경된간이동정법의평가. 대한임상미생물학회지 2002;5: 어영, 장인호, 윤갑준. 장구균의간략동정법개발. 대한임상병리학회지 1999;19: 박순덕, 장인호, 황규열, 어영, 윤갑준. 장구균의신속선별동정을위한 L-pyrrolidonyl-β -naphthylamide (PYR) 시험과 NaCl-esculin 가수분해시험의유용성평가. 임상병리와정도관리 1999;21: Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC Jr. In: Enterobacteriaceae. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. 4th ed. Philadelphia: J.B Lippincott, 1992; Facklam RR, Sahm DF, Teixeira LM. Enterococcus. In: Murray PR, ed. Manual of clinical microbiology. 6th ed. Washington, D.C.: American Society for Microbiology 1999; Cheng S, McCleskey FK, Gress MJ, Petroziello JM, Liu R, Namdari H, et al. A PCR assay for identification of Enterococcus faecium. J Clin Microbiol 1997;35: Tyrrell GJ, Bethune RN, Willey B, Low DE. Species identification of enterococci via intergenic ribosomal PCR. J Clin Microbiol 1997;35: Shewmaker PL, Steigerwalt AG, Shealey L, Weyant R, Facklam RR. DNA relatedness, phenotypic characteristics, and antimicrobial susceptibilities of Globicatella sanguinis strains. J Clin Microbiol 2001;39:

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대한임상병리학회지 : 제 19 권제 1 호 1999 Korean J Clin Pathol 1999; 19: 57-61 임상미생물학 장구균의간략동정법개발 어영 장인호 윤갑준 연세대학교원주의과대학임상병리과학교실 Development of Simple Identification Method of Enterococci Young Uh, M.D., In Ho Jang,