대한진단검사의학회지 : 제 22 권제 5 호 2002 Korean J Lab Med 2002; 22: 임상미생물학 Escherichia coli O157 의산처리후배양법과증균후 PCR 법의비교 백인기 한태희 인제대학교의과대학상계백병원진단검사의학과 Compar

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정훈 함
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1 대한진단검사의학회지 : 제 22 권제 5 호 2002 Korean J Lab Med 2002; 22: 임상미생물학 Escherichia coli O157 의산처리후배양법과증균후 PCR 법의비교 백인기 한태희 인제대학교의과대학상계백병원진단검사의학과 Comparison of Detection of Escherichia coli O157 Between Culture After Acid Treatment and Polymerase Chain Reaction After Enrichment In Ki Paik, M.D., and Tae Hee Han, M.D. Department of Laboratory Medicine, Inje University Sanggye Paik Hospital, Seoul, Korea Background : The Polymerase Chain Reaction (PCR) for the Shiga toxin has been widely used for diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) infection including Escherichia coli O157 (O157) instead of using a culture. However, bacteriological isolation must be followed for final diagnosis. Our study was aimed to compare the detection limit between the culture after the acid treatment and the PCR after enrichment. Methods : The standard strain of O157 was cultured, diluted and mixed with the stool of normal adult in order to make a final concentration of the colony forming unit (CFU)/g of stool. Each concentration of samples was enriched in a trypticase soy broth for 6 hours at 42 and treated with acid to suppress normal flora. Then it was streaked on cefixime-tellurite-sorbitol MacConkey (CT-SMAC) agar evenly and cultured for 18 hours at 37. The same concentrations of bacterial suspension in the stool were enriched in a Luria-Bertani (LB) broth overnight at 37. The centrifuged pellets from 1 ml of each concentration of the samples were boiled and DNA was extracted using the resin method and PCR was performed to amplify stx2. Results : The detection limit for the culture after acid treatment was 10 3 CFU/g of the stool and that for PCR after enrichment was 10 1 CFU/g of the stool. Conclusions : Culture after acid treatment for O157 would be an effective method for isolation of O157 from a patient s stool. However, this method is less sensitive than the PCR after enrichment as far as detection limit is concerned. A combination of both methods would be an effective method for detecting O157 from patient stools. (Korean J Lab Meb 2002; 22: 331-5) Key words : Escherichia coli O157, Culture, PCR, Acid treatment 서 론 병원성대장균 (Escherichia coli, E. coli) 에는 Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E. coli (EPEC), Enteroinvasive E. coli (EIEC) 와 Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) 접수 : 2002년 8월 19일접수번호 : KJCP1603 수정본접수 : 2002년 10월 7일교신저자 : 백인기우 서울시노원구상계7 동 상계백병원진단검사의학과전화 : , Fax: ikpaik@sanggyepaik.ac.kr 가있다 [1]. 그중 EHEC는 Shigella dysentery type I이만드는것과비슷한 shiga 독소를만들어내어혈관내피세포를손상시켜출혈성대장염과용혈성요독증후군 (Hemolytic uremic syndrome, HUS) 을일으키기때문에 Shiga toxin-producing E. coli (STEC) 라부르기도한다 [2]. STEC 중에대표적인것이 E. coli O157:H7 (O157) 으로서이균의감염증은과거에미국이나일본에서간헐적으로집단발생이보고되어왔으며, 1996년 7월일본사카이시에서발생한 O157의집단발생은그규모가매우큰것으로서 62개초등학교에서 6,309명의학생과 92명의교사가감염되었고, 학생가족 160명에서 2차감염이있었으며,

2 332 백인기 한태희 명이 HUS로진행되었고, 그중 3명이사망하였다 [3]. 그후국내에서도몇예의 O157 감염증이산발적으로보고되어왔으며현재제1군법정전염병으로지정되어있다. 그러나 O157을포함한 STEC의세균학적진단은그동안국내에서용이치않았다. 그분리배양원리는 O157이다른대장균과는달리 sorbitol 을발효하지않는성질이있기때문에병원검사실에서는주로 sorbitol-macconkey (SMAC) agar에서무색의균집락을찾아내는방법을 O157을검출하기위한일차적수단으로사용하는것이었다. 그러나환자의대변중에 O157의세균수가 1% 미만으로매우적은경우에는 SMAC만으로이세균을검출할수없는것으로보고된바있다 [4]. 따라서국내에서김등 [5] 은그대로 shiga 독소 I (stx1) 과 shiga 독소 II (stx2) 를이용한중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 법이대변에서 O157 감염증을진단하는가장효과적인방법이라주장하였다. 그러나이방법이민감하기는하나비용이높고, 시간이많이걸리며독소를증명하는방법일뿐이므로어차피확인을위하여추후에세균학적인동정이수반되어야정확히진단될수있다는문제점이있었다. 이에저자들은 Fukushima 등 [7] 이개발한배양법의변법을사용하여대변에서 O157을포함한 STEC를효과적으로배양할수있게되었기에그검출방법을소개하고, 이방법에의한 O157의검출민감도와 shiga 독소의 PCR 검출민감도를상호비교하고자한다. 대상및방법 1. 배양법 Fukushima ( 시네마현립위생시험소, 일본 ) 로부터제공받은 O157 표준균주 (SE97029) 를 SMAC 배지에분주하여 37 항온기에서하룻밤배양한후 3-4개의균집락을면봉으로채취하여생리식염수에희석한후 McFarland nephelometer를사용하여균액의농도를측정하였다. 균액의농도를 10 8 colony forming unit (CFU)/mL로맞춘후계대희석하여 CFU/mL로농도를맞추었다. 정상성인의대변 1 g을취하여생리식염수 10 ml에풀어서 vortex를사용하여잘혼합하였다. 1.5 ml 시험관에변 1 ml씩넣은후, 균액 10 L씩첨가하여균액이 100배희석되며, 최종균액농도는 CFU/mL 이되도록하였다. 각농도의균변혼합액을 trypticase soy broth 10 ml에넣은후 42 에서 6시간증균배양하였다. 이배양액을 20 L씩취하여거기에 1/8 N 염산 (0.5% 식염수사용제조 ) 을첨가한후 30초간잘혼합하였다. 그중 20 L씩 CT-SMAC 배지에분주하고유리봉을사용하여고르게도포하였다. CT- SMAC 배지조성성분은 SMAC 500 ml, potassium tellurite (0.1%) 1.25 L 및 cefixime 3가지농도 (0.05 mg/l, 0.1 mg/l 및 0.2 mg/l) 이었다. 37 항온기에서하룻밤배양한후 3가지 cefixime 농도에서각각의무색균집락과분홍색균집락수를측정하였다. 그중무색균집락에서 O157에대한혈청학적검사 (O항원, H항원 ) 를실시하였다. 2. PCR법상기배양법에서와같은방법으로균변액농도를맞춘후 vancomycin (10 g/ml) 함유, Luria-Bertani (LB) broth (Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) 10 ml에각각 1 ml 씩넣어잘섞은후37, 하룻밤증균한후 1 ml씩취하였다. 13,000 rpm에서 5분간원심분리하여얻은침사를 PBS로잘세척한후침사에 15% resin (Chelex 100 resin, Bio-Rad, CA, USA) 200 L를첨가하여잘혼합한후 20분간끓였다. 4 에서 10분간식힌다음 13,000 rpm에서 5분간원심하여상청액 1 L 를 template DNA로사용하였다. 본실험에사용된표준균주는 stx2에만양성이므로 stx2 유전자의염기서열중 225 bp의 DNA 를증폭할수있는 2F (5 -GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC-3 ) 와 2R (5 -TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT G-3 ) 시발체를사용하였다 [5, 6]. PCR 반응액구성은 Accu- Power PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea, 조성 : 1U of Taq DNA polymerase, 250 M of dntps in 10 mm Tris- HCl, 40 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2 ) 에 samples (1 L), primer 15 pmol씩을넣어총량 20 L로맞추었다. 증폭조건은 denaturation 95 30초, annealing 58 30초, elongation 72 30초로 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ, USA) 을사용하여 30회증폭하였다. 증폭된 DNA 산물은 2% agarose gel에서 100 V, 30분동안전기영동후 ethidium bromide (0.5 g/ml) 로염색하여판독후사진촬영하였다. 결과 1. 배양법이방법으로 O157균은 CT-SMAC 배지중 cefixime 농도 0.1 mg/l에서대변 g당 10 3 CFU까지검출할수있었으며, CT- SMAC 배지에서의 cefixime 농도는 0.1 mg/l에서다른 2가지농도에비하여 O157인무색의균집락숫자가 3가지균농도 ( 대변g당10 3, 10 4, 10 5 CFU) 에서모두가장많았고, 기타장내세균인분홍색균집락이없었으므로최적의 cefixime 농도는 0.1 mg/l로사료되었다 (Table 1)(Fig. 1). 2. PCR법 LB broth에서하룻밤증균후시행된 stx2에대한 PCR은대변g당10 1 CFU까지검출할수있었다 (Fig. 2).

Escherichia coli O157 의산처리후배양법과증균후 PCR 법의비교 333 1 2 3 4 5 6 7 8 1,000 bp 500 bp 225 bp Fig. 1. Many colorless colonies without pink colonies are shown in 0.

coli O157 CFUs/g of stool CFUs of E. coli O157 Colony color Abbreviations: CT-SMAC, cefixime-tellurite-sorbitol MacConkey; CFU, colony forming unit. 고 Concentration of cefixime 0.05 mg/l 0.1 mg/l 0.

3 Escherichia coli O157 의산처리후배양법과증균후 PCR 법의비교 ,000 bp 500 bp 225 bp Fig. 1. Many colorless colonies without pink colonies are shown in 0.1 mg/l cefixime concentrations in CT-SMAC agar with 10 5 CFU of E. coli O157/g of stool. Table 1. The colony count in each concentration of cefixime in CT-SMAC agar with various E. coli O157 CFUs/g of stool CFUs of E. coli O157 Colony color Abbreviations: CT-SMAC, cefixime-tellurite-sorbitol MacConkey; CFU, colony forming unit. 고 Concentration of cefixime 0.05 mg/l 0.1 mg/l 0.2 mg/l 10 3 colorless pink colorless pink colorless pink 년 Konowalchuk 등 [8] 이 vero 세포에대해세포독성을보이는대장균을처음보고하였다. 그러나그당시에는 O157 혈청형이포함되지않았다. 그로부터지금까지 STEC 혈청형의종류가매우다양하게보고되고있다. 그중에서 O157 혈청형은 1982년미국에서집단발생후가장독성이강한혈청형으로알려지게되었으며, 보고된 STEC의 40-70% 가 O157 혈청형이었다 [9]. 일본에서는 1990년 2개의유치원에서 319명의 O157 환자가발생하여그중 2명이용혈성요독증후군으로사망한후이감염증이사회문제화되기시작하였으며, 그당시집단발생의원인은오염된우물물의음용때문이었다 [10]. 또한 1996년사카이시에서도 6,000명이상이 O157에감염되는대규모집단발생이있었으며, 이중 3명의소아가 HUS로사망하였다 [3] 년사이에일본에서발병한 STEC 감염증을분석해보면가장흔한혈청형은 O157:H7 (73%) 이었고, 그다음이 O26:H11 (7.3%) 이었으며, 나머지는 O111:H- 등이었다. 발병연령은주로유아원, 유치원과초등학교학생층이었으며역학조사결과학교급식 안 Fig. 2. Agarose gel electrophoresis of PCR products of E. coli O157 ; Lane 1: size marker, Lane 2: positive control, Lane 3: negative control, Lane 4: 10 5 CFU of E. coli O157/g of stool, Lane 5: 10 4 CFU of E. coli O157/g of stool, Lane 6: 10 3 CFU of E. coli O157/g of stool, Lane 7: 10 2 CFU of E. coli O157/g of stool, Lane 8: 10 1 CFU of E. coli O157/g of stool. 음식중샐러드, 해물소스, 참외및연어회등이의심되었으나아직까지는확실한감염경로는밝혀지지않고있다 [11]. 반면에미국과유럽에서는가축, 특히소들이 O157의보균숙주임이입증되었다 [12]. 우리나라에서도보건복지부를중심으로하여 O157 감염증에대비한신고체계가수립되었고, 이에따라병원검사실에서도꾸준히 O157을검출하려는노력이지속되었다. 그러나아직까지국내에서는 O157의효과적인세균배양이실시되지못하고있었으며, 현재까지진단의대부분을중합효소연쇄반응법을이용한 shiga 독소의유전자를찾는방법에의존하여왔었다 [5]. 현재까지 O157을검출하기위한배양법은 O157이 sorbitol을발효하지않는성질을이용하여 MacConkey agar에들어있는 lactose를빼고, 그대신에 sorbitol을넣은 sorbitol-macconkey (SMAC) agar에서무색의균집락을찾는방법을일차적인방법으로사용하였으나이방법으로는환자대변중에 O157 균수가 1% 미만인경우에는검출할수없는것으로보고되어있으며, 따라서이방법은 O157을검출하는예민한방법이아니다 [4]. 따라서초기에대변중에존재하는소수의 O157균을증균시키는방법이필요한데, Fukushima 등 [7] 은 trypticase soy broth (TSB) 에서진탕 (agitation) 없는 42 에서 6시간증균법이 37 증균법보다효과적임을입증하였고, 이방법은 37 증균법에비하여다른장내세균의증균이상대적으로억제됨을입증하였다. 또한인체에서음식물에의한세균감염증의일차적인방어벽은위산이며위액의산도가높기때문에산에잘견딜수있는 Salmonella 종, Shigella 종과병원성대장균들이장에서감염증을잘일으킬수있다는것이이미입증되어있다 [13]. 따라서 Fukushima 등 [7] 은대장균의이특성을이용하여증균시킨 STEC를 1/8 N 염산에 30초간처리하여배지에분주할경우대

4 334 백인기 한태희 변중에정상균총 (normal flora) 으로존재하고있는다른장내세균들과 Pseudomonas 종들을효과적으로억제시켜 STEC 분리의민감도를높인다는것을확인하였다. STEC의배양배지로 SMAC만은불충분하며여기에 cefixime, vancomycin, novobiocin 등항균제와 potassium tellurite 및 bile salt 등을첨가시키면 STEC를제외한장내세균들을효과적으로억제시킬수있다는보고가있으며 [14], 본연구에서는 Fukushima 등 [15] 이사용한방법인 SMAC 배지에 cefixime과 potassium tellurite를첨가한 CT-SMAC 배지에서항균제인 cefixime의농도를재조정하여배양배지로사용하였다. 즉본연구에서는 Fukushima 등 [7] 이사용한배양법의변법을사용하여증균, 염산처리후사용된배지인 CT-SMAC 배지에서 cefixime의최적농도를찾아낸후, 최적상태에서 O157의검출민감도를측정하여보았으며, 그결과 cefixime 농도는 Fukushima 등 [7] 이사용했던 0.05 mg/l의 2배인 0.1 mg/l가최적농도임을입증하였다. 즉 0.1 mg/l에서 O157인무색의균집락수가가장많았고, 기타장내세균인분홍색균집락이없었다. 또한이방법에의하여대변 g당 10 3 CFU의 O157까지배양할수있어서 Fukushima 등 [7] 이주장한 10 2 CFU에는미치지못하였으나, 반복적인실험결과어떤때는 10 2 CFU까지도검출할수있었기에이결과들은상호비슷한결과로사료된다. 또한이결과는 Holland 등 [16] 이사용한 PCR법에서의검출민감도인 10 4 CFU보다오히려높은민감도를보여주었다. 결론적으로저자들은 Fukushima 등 [7] 이사용한 STEC의분리배양법인증균, 염산처리후 CT-SMAC 배지분주법에서항균제인 cefixime의농도를 2배높인배지를사용하여효과적으로 E. coli O157:H7을배양할수있었기에그방법들을소개하였으며, 이방법에의한 O157의검출민감도는대변 g당 10 3 CFU로서, 과거에수행되었던 shiga 독소에대한중합효소연쇄반응법에서의민감도보다오히려우수하였다. 그러나김등 [5] 은 LB broth에서하룻밤증균후, PCR진단법을 O157의 1차진단에사용하였으며, 이방법에서의검출민감도는본연구에의하면 10 1 CFU로서상기저자들의산처리후배양법보다검출민감도가높았다. 따라서두방법을병용하면 O157 및기타 STEC의확진에유용하게사용할수있다. 요약배경 : Escherichia coli O157 (O157) 을포함한 shiga 독소생성대장균의배양은그동안국내에서효과적으로수행하지못하였으며, 그대신 shiga 독소에대한 PCR법이 1차검사법으로사용되어왔었다. 이에저자들은일본에서사용되어지는배양법의변법으로 O157을배양하여 PCR법과의검출민감도를상호비교하여보았다. 방법 : 표준균주인 SE97029를배양, 정상인의변과혼합하여 대변 g당 colony forming unit (CFU) 로조정한후, 각농도의균변혼합액을 trypticase soy broth에서 42, 6시간증균한후, 산처리하여 cefixime-tellurite-sorbitol MacConkey 배지에균일하게바른후 37, 18시간배양후무색균집락의수를세었다. 또한 PCR법에서는상기의같은균변혼합액을 vancomycin 함유 Luria-Bertani (LB) broth에서 37, 하룻밤증균후, 원심분리한침사를 resin을이용한 boiling법으로 DNA 를추출한후, stx2에대한 PCR을실시하였다. 결과 : 산처리후배양법에서의검출한계는대변 g당 10 3 CFU였으며, 하룻밤증균후실시한 PCR법에서의검출한계는대변 g당 10 1 CFU였다. 결론 : 산처리후배양법의검출민감도는증균후 PCR법에는아직미치지못하지만, 두방법을병행하면 O157진단에매우유용한방법이될것으로사료된다. 감사의글본연구에많은도움을준곽은영병리사에게감사드립니다. 참고문헌 1. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schrechenberger PC, Winn Jr WC. Diagnostic microbiology. 4th ed. Philadelphia: J. B. Lippincott company, 1992: 장철훈, 송근암, 이복권. 세균성이질의병인기전과최근유행양상. 대한임상미생물학회지 1999; 2: 국립보건원. 장출혈성 E. coli O157:H7 감염최신보고, 1996, 일본감염병발생정보 1996; 7: Paton JC and Paton AW. Pathogenesis and diagnosis of shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clin Microbiol Rev 1998; 11: 김의종, 오준호, 이환종. 환자대변에서중합효소연쇄반응을이용한 E. coli O157:H7의검출. 감염 1999; 31: Paton AW and Paton JC. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaea, enterohemorrhagic E. coli hlya, rfbo111, and rfbo157. J Clin Microbiol 1998; 36: Fukushima H and Gomyoda M. An effective, rapid and simple method for isolation of Shiga toxin-producing Escherichia coli O26, O111 and O157 from faeces and food samples. Zent bl Bakteriol 1999; 289: Konowalchuk J, Speirs JI, Stavric S. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. Infect Immun 1977; 18: Griffin PM, Blaser MJ, Smith PD, Ravdin JI, Greenberg HB, Guerrant RL. Infections of the gastrointestinal tract. 2nd ed. New York:Reven Press, 1995;

5 Escherichia coli O157 의산처리후배양법과증균후 PCR 법의비교 Akashi S, Joh K, Tsuji A, Ito H, Hoshi H, Hayakawa T, et al. A severe outbreak of haemorrhagic colitis and haemolytic uraemic syndrome associated with Escherichia coli O157:H7 in Japan. Eur J Pediatr 1994; 153: National Institute of Infections Disease and Infections Disease Control Division, Ministry of Health and Welfare of Japan. Enterohemorrhagic Escherichia coli (verocytotoxin-producing E. coli) infection, 1996-April Infect Agents Surveillance Rep 1998; 19: Chapman PA, Siddons CA, Wright DJ, Norman P, Fox J, Crick E. Cattle as a possible source of verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 infections in man. Epidemiol Infect 1993; 111: Benjamin MM and Datta AR. Acid tolerance of enterohemorrhagic Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 1995; 61: Zadik PM, Chapman PA, Siddons CA. Use of tellurite for the selection of verocytotoxigenic Escherichia coli O157. J Med Microbiol 1993; 39: Fukushima H and Gomyoda M. Hydrochloric acid treatment for rapid recovery of Shiga toxin-producing Escherichia coli O26, O111 and O157 from faeces, food and environmental samples. Zent bl Bakteriol 1999; 289: Holland JL, Louie L, Simor AE, Louie M. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. J Clin Microbiol 2000; 38:

대한진단검사의학회지 : 제 23 권제 4 호 2003 Korean J Lab Med 2003; 23: 임상미생물학 타액에서 Helicobacter pylori 검출을위한배양법과연쇄중합효소법의비교 백인기 한태희 인제대학교의과대학상계백병원진단검사의학과 The

대한진단검사의학회지 : 제 23 권제 4 호 2003 Korean J Lab Med 2003; 23: 258-62 임상미생물학 타액에서 Helicobacter pylori 검출을위한배양법과연쇄중합효소법의비교 백인기 한태희 인제대학교의과대학상계백병원진단검사의학과 The Comparsion of Polymerase Chain Reaction and Culture