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사희 허
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J. Fd Hyg. Safety Vol. 25, No. 3, pp. 220~225 (2010) Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.

1 J. Fd Hyg. Safety Vol. 25, No. 3, pp. 220~225 (2010) Journal of Food Hygiene and Safety Available online at 서울시내유통식품에서분리한대장균의항생제내성및내성유전자 유영아 * 김무상 김경식 박선희 정성국 서울시보건환경연구원 Antimicrobial Resistance and Implicated Genes of E. coli Isolated from Commercial and Cooked Foods in Seoul Young Ah Yoo*, Moo Sang Kim, Kyong Sik Kim, Sun Hee Park, and Sung Kuk Jung Seoul Metropolitan Government Research Institute of Public Health and Environment (Received August 2, 2010/Revised August 27, 2010/Accepted September 13, 2010) ABSTRACT - Distribution of foodborne E. coli strains, antimicrobial resistant genes and antimicrobial susceptibility have been carried out on E. coli isolated from commercial and cooked foods distributed food in Seoul. Of total 1,313 samples, fifty samples(3.8%) were found E. coli that included one of the ETEC and EPEC, respectively. The serotype of ETEC in seasoning raw meat was E. coli O26 and produced Verotoxin 2. Fifty percentage of total isolates were susceptible to all antimicrobial agents. Specially, there were ampicillin(36%), amoxicillin/clavulanic acid(32%) and tetracycline(22%) etc. Resistant gene (tetb) were found in four tetracycline resistant E. coli strains, and TEM gene was found in one ampicillin resistant E. coli isolate. Key words: pathogenic E. coli, antimicrobial resistant, ETEC, EPEC 식품의약품안전청의자료에따르면, 호흡기감염에이어두번째로많이발생하는질환이소화기성설사질환인것으로보고되어있다. 전세계에서해마다 1,440만명이설사질환을포함한감염성질환으로목숨을잃고, 미국의경우매년 7천6백만명이수인성전염병을앓으며, 1000명당 1명은 1년에 1회설사질환으로입원한다는통계가있는만큼급성설사는전세계적으로질병위험이매우큰질병이다 1). 뿐만아니라설사질환은전염력도높아, 매년 500만명정도의어린이가후진국에서설사질환의합병증으로사망하고있어우리나라는물론세계적으로설사질환이공중보건학상매우중요하게다루어지고있다 2-3). 2007년발표된국립보건원자료에따르면우리나라에서 8개시도에서발생한설사환자의가검물에서밝혀진원인체중 49% 가 E. coli라는보고가있으며 4), 세계적으로도병원성대장균은설사질환등각종감염질환의주요원인균으로서연구가활발히진행중에있다. 병원성대장균을포함한세균에의한대부분의감염질환과질병치료를위해화학치료제에의존할수밖에없으 *Correspondence to: Young Ah Yoo, Seoul Metropolitan Government Research Institute of Public Health and Environment, Juamdong 1, Gwacheon-si, Gyeong gi-do , Korea Tel: lilycoe@seoul.go.kr 며, 치료제의대부분은항생제 (Antibiotics) 이다. 그러나항생제의사용은세균들이다양한경로를통해항생제와접하게되는기회가많아지게되면서항생제내성균의출현이라는필연적인결과를가져왔다 5-6). 항생제내성으로인한문제는내성균의증가로인해감염증치료효과를약화시킬뿐아니라부가적으로의료비용을상승시키고 7) 효과적인약제선택을어렵게함으로써적절한치료시기를놓치게되어심각한문제들을야기하고있다 8). 특히 Pseudomonas 감염치료를위해서는감수성있는약제를선택하기어려울정도로내성균이많아졌다 9-13). 병원성대장균역시여러항생제에내성을갖는균주가증가하였고, 각종질환의원인균으로작용하는병원성대장균에사용되던항생제가듣지않아새로운계열의항생제로대체해서치료하는경우가늘어나고있다. 내성균은다양한경로를통해빠르게전파될수있으며, 특히현대사회는전세계가 1일생활권이가능하게되고식품오염에의한내성세균의전파가빠르게진행될수있는문제가있음으로식품에서분리된세균의항생제감수성조사분석을통하여식품에서유래하는병원성세균의식품위생학적기초자료를제공하고자한다. 본연구에서는 2010년 1월부터 6월까지서울시내에서유통되는식품과식품접객업소 ( 집단급식소포함 ) 의조리식품을대상으로식중독원인균분석및위생미생물검사를실시하였다. 그결과검출률이가장높은대장균을대상 220

2 Antimicrobial Resistance and Implicated Genes of E. coli Isolated from Commercial and Cooked Foods in Seoul 221 으로그분포를살펴보았으며, 분리된대장균의항생제감수성시험을통하여이들의내성정도를파악하고, 내성유전자와병원성유전자의분포도알아보았다. 재료및방법 실험균주 2010년 1월부터 6월까지서울시내에서유통되는식품과식품접객업소 ( 집단급식소포함 ) 의조리식품중각구청을통해서울시보건환경연구원으로검사의뢰된제품에서분리된대장균 50주를시험대상으로하였다. 검사대상이된식품은모두 1,313건으로김밥과샌드위치등을포함한즉석섭취식품이 635건으로가장많았으며, 접객업소등에서제공되는조리음식이 374건, 선선편의식품 115건, 조미건포류 85건, 조미식품 77건, 과채가공품 14건, 젓갈류 13건등이었다. 대장균분리및동정식품검체의일정량을멸균생리식염수와함께균질화하여시험용액으로사용하였다. 3개의 9 ml EC broth(difco, USA) 에시험용액 1mL씩을각각접종하고 44 o C에서 24시간배양후가스발생양성인경우 EMB 배지 (Difco, USA) 에접종하여 35 o C에서 24시간배양하였다. EMB 배지에서 전형적인집락을분리하여보통한천배지에순수배양후 API 20E kit (BioMerieux, France) 를사용하여동정하였다. 항생제감수성시험항생제감수성시험은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines에의해 disc diffusion method로다음과같이실시하였다. Mueller Hinton broth (Difco, USA) 에서진탕배양된균액의농도를 MacFarland No. 0.5정도로희석하여 Mueller Hinton agar (Difco, USA) 에균일하게도말하였다. 균액을접종한배지는실온에서약 5분간건조시킨후 disc dispenser (Becton Dickinson, USA) 를이용해 16종의항생제디스크 (BBL, USA) 를두개의 plate에나누어올려놓고 35 o C에서하룻밤배양하였다 (Table 1). 각항생제에대한억제대크기를 zone reader로측정하고 CLSI guideline 따라감수성과내성을판정하였다 14). 대장균 DNA 추출순수분리된대장균을 Tryptic soy broth(difco, USA) 에서 37 o C로 4시간진탕배양하고, Cole의방법에따라 DNA 를추출하였다 15). 증균배양된가검물 1ml을 microcentrifuge tube에옮겨 14,000 rpm에서 10분간원심분리하였다. 상층액 0.5 ml을새로운 tube에옮기고 0.3 ml의 PEG (20% Polyethyleneglycol 8000, 2.5 M NaCl) 용액을추가한다음 Table 1. Antimicrobial agents used in E. coli strains susceptibility test Antimicrobial agents Class Concentration Zone diameter(mm) (µg/disc) Resistant Intermediate Susceptible Cephalothin(CF) Cephem 30 µg 14 15~17 18 Ceftriaxone(CRO) Cephem 30 µg 19 20~22 23 Cefoxitin(FOX) Cephem 30 µg 14 15~17 18 Gentamicin(GM) Aminoglycoside 10 µg 12 13~14 15 Kanamycin(K) Aminoglycoside 30 µg 13 14~17 18 Streptomycin(S) Aminoglycoside 10 µg 11 15~20 21 Amikacin(AN) Aminoglycoside 30 µg 14 15~16 17 Ampicillin(AM) Penicillin 10 µg 13 14~16 17 Ticarcillin(TIC) Penicillin 75 µg 14 15~19 20 Amoxicillin/clavulanic acid(amc) β-lactam/β-lactamase inhibitor combination 20 µg/10 µg 13 14~17 18 Ampicillin/sulbactam(SAM) β-lactam/β-lactamase inhibitor combination 10 µg/10 µg 11 12~14 15 Chloramphenicol(C) Phenicol 30 µg 12 13~17 18 Ciprofloxacin(CIP) Quinolone 5 µg 15 16~20 21 Nalidixic acid(na) Quinolone 30 µg 13 14~18 19 Tetracycline(TE) Tetracycline 30 µg 14 15~18 19 Trimethoprim/sulfamethoxazole(SXT) Folate pathway inhibitor 1.35 µg/23.75 µg 10 11~15 16

3 222 Young Ah Yoo, Moo Sang Kim, Kyong Sik Kim, Sun Hee Park, and Sung Kuk Jung vortex하여 37 o C 배양기에넣고 10분간정치한후, 14,000 rpm에서 15분간원심분리한다음상층액을제거하였다. DNA 침전물을 70% 에탄올 1ml로세척하고, 잔여에탄올을제거한후, DNA를완전히말린다음 0.1 ml의멸균증류수를넣고 vortex 하고 60 o C에서 10분간녹인후 14,000 rpm에서 10분간원심분리한후 PCR의 DNA template로사용하였다. 병원성대장균유전자분석 E. coli detection kit (Genet bio, Seoul, Korea) 를사용해 multiplex PCR로 5가지병원성대장균유전자를분석하였다. E. coli detection kit의 mixing condition은 2X E. coli용 premix solution 10 µl, Template DNA 7 µl, primer mixture 3 µl로 total volume 20 µl로하였으며 PCR condition은다음과같다. 94 o C에서 10분간예비가열한후 94 o C에서 30초, 62 o C에서 20초, 72 o C에서 40초를 35 cycles 실시하고, 72 o C 에서 5분간반응하였다. PCR 반응액은 1.5% agarose gel에서전기영동하여특정병원성대장균유전자가존재하는지확인하였다 (Table 2). 항생제내성유전자분석디스크환시험법에의한 16종의항생제감수성시험결과내성이높게나타난 Ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, tetracycline 등 3종류의항생제를대상으로내성유전자분 포를조사하였다. 모든 PCR의증폭물질은 0.5% ethidium bromide가첨가된 1.5% agarose gel에서전기영동을실시하고밴드를확인하였다. Ampicillin β-lactam계항생제에대한내성유전자분석을위해 bla SHV (F:5'-TCG CCT GTG TAT TAT CTC CC-3', B:5'-CGC AGA TAA ATC ACC ACA ATG-3'), bla OXA (F:5'-GCA GCG CCA GTG CAT CAA C-3', B:5'-CCG CAT CAA ATG CCA TAA GTG-3') bla TEM (F:5'-GAG TAT TCA ACA TTT TCG T-3', Table 2. Target genes and PCR product size Classes of Pathogenic E. coli Genes Product size EAEC aggr 122 bp ETEC ST 168 bp LT 394 bp EPEC eaea 260 bp EIEC spa 331 bp EHEC VT bp VT bp Abbreviation : EAEC; Enteroadherent Escherichia coli, ETEC; Enterotoxigenic Escherichia coli, EPEC; Enteropathogenic Escherichia coli, EIEC; Enteroinvasive Escherichia coli, EHEC; Enterohaemorragic Escherichia coli., ST: heat-stable toxin, LT: heat-labile toxin, VT: verotoxin Table 3. The nucleotide sequences of primers for targeting tetracycline efflux pumps Genes tet A tet B tet C tet D tet E tet G tet H tet J tet Y tet Z tet 30 Primer 5'-GCG CGA TCT GGT TCA CTC G-3' 5'-AGT CGA CAG YRG CGC CGG C-3' 5'-TAC GTG AAT TTA TTG CTT CGG-3' 5'-ATA CAG CAT CCA AAG CGC AC-3' 5'-GCG GGA TAT CGT CCA TTC CG-3' 5'-GCG TAG AGG ATC CAC AGG ACG-3' 5'-GGA ATA TCT CCC GGA AGC GG-3' 5'-CAC ATT GGA CAG TGC CAG CAG-3' 5'-GTT ATT ACG GGA GTT TGT TGG-3' 5'-AAT ACA ACA CCC ACA CTA CGC-3' 5'-GCA GAG CAG GTC GCT GG-3' 5'-CCY GCA AGA GAA GCC AGA AG-3' 5'-CAG TGA AAA TTC ACT GGC AAC-3' 5'-ATC CAA AGT GTG GTT GAG AAT-3' 5'-CGA AAA CAG ACT CGC CAA TC-3' 5'-TCC ATA ATG AGG TGG GGC-3' 5'-ATT TGT ACC GGC AGA GCA AAC-3' 5'-GGC GCT GCC GCC ATT ATG C-3' 5'-CCT TCT CGA CCA GGT CGG-3' 5'-ACC CAC AGC GTG TCC GTC-3' 5'-CAT CTT GGT CGA GGT GAC TGG-3' 5'-ACG AGC ACC CAG CCG AGC-3' PCR annealing and extension temp ( o C) Amplicon size (bp)

4 Antimicrobial Resistance and Implicated Genes of E. coli Isolated from Commercial and Cooked Foods in Seoul 223 B:5'-ACC AAT GCT TAA TCA GTG A-3') 의증폭은 95 o C 에서 15분간예비가열한후 94 o C에서 denaturation 30초, 58 o C 에서 annealing 30초, 72 o C에서 extention 1분을 30 cycles 실시하고, 72 o C에서 10분간반응하였다 16). Tetracycline Tetracycline계항생제에대한내성유전자중 efflux pump 와관련된 tet A, tet B, tet C, tet D 유전자의 primer는 Table 3과같고, PCR 증폭은 94 o C에서 5분간예비가열한후 94 o C 에서 denaturation 5초, 그리고 Table 3에표시한온도로 annealing 30초를 25 cycles 실시하고, 마지막단계로 annealing 온도와같은온도로 10분간반응하였다 16). AM - AMC 에내성을보였다 (Fig. 1, Table 5). 항생제내성유전자검출 β-lactam 계항생제내성유전자분포 항생제감수성시험결과 AM과 AMC에내성을갖는 20균주를대상으로 β-lactam계항생제내성유전자분포를모니터링한결과 1균주에서 857bp의크기를가진 TEM 유전자가검출되었으며그외유전자는검출되지않았다. 대장균혈청형동정시험 Brain heart infusion agar (Difco, USA) 에균을접종하여 18~24시간배양후균을멸균식염수에농후하게풀어균부유액을제조하였고, 이균액을 slide glass에도말한후시판되는대장균 O 항혈청 (Denka Seiken, Japan) 을동량첨가하여응집반응유무로혈청형동정을실시하였다. 결과 대장균분리현황검사대상이된 1,313건의식품중 50건에서대장균이검출되어 3.8% 의검출률을보였으며각식품별대장균검출현황을 Table 4에나타내었다. 항생제감수성및다제내성 2010년상반기유통식품에서분리된대장균의항생제감수성시험결과는시험균주의 50% 인 25균주는 16종의항생제에대한내성을보이지않았으며, 각항생제에대한내성은 ampicillin (AM) 에대한내성이 36% 로가장높았으며, amoxicillin/clavulanic acid (AMC) 과 tetracycline (TE) 의내성이각각 32%, 22% 였다. 이들의내성양상은모두 17가지패턴이었으며, 2제내성을가진 9균주중 8균주가 Table 4. Distribution of E. coli isolates and each samples Products No. of E. coli isolates per each samples (%) Ready-to-eat food 34/635 (5.4) Cooked food 11/374 (2.9) Fresh ready-to-eat food 3/115 (2.6) Seasoned dried marine product 2/85 (2.4) Seasoning food 0/77 Processed Fruit & vegetable product 0/14 Salted seafood (jeotkal) 0/13 Total 50/1313 (3.8) Fig. 1. Antibiogram of E. coli isolated from Commercial and Cooked food in Seoul. Abbreviation : NA; nalidixic acid, GM; gentamicin, CF; cephalothin, TIC; ticarcillin, S; streptomycin, C; chloramphenicol, CRO; ceftriaxone, SAM; ampicillin/sulbactam, SXT; trimethoprim/sulfamethoxazole, AM; ampicillin, AN; amikacin, TC; tetracycline, K; kanamycin, CIP; ciprofloxacin, FOX; cefoxitin, AMC; amoxicillin/clavulanic acid. Table 5. Multiple drug resistant patterns of 50 E. coli strains Multi drug-resistant patterns No of Isolates None 25(25%) NA 2 AM 1 GM 1 5 (10%) AMC 1 NA-TC 1 AM-AMC 8 9 (18%) CF-AM-AMC 1 TIC-AM-TC 1 CF-AM-TC 1 4 (8%) S-C-TC 1 S-AM-TC-AMC 1 1 (2%) NA-S-AM-TC-AMC 1 1 (2%) NA-S-AM-TC-FOX-AMC 1 NA-TIC-S-AM-TC-AMC 1 2 (4%) CF-TIC-S-AM-TC-K-AMC 1 1 (2%) NA-CF-TIC-S-C-SXT-AM-TC- K-CIP-AMC 1 NA-CF-TIC-S-SXT-AM-TC-K- CIP-FOX-AMC 1 2 (4%)

5 224 Young Ah Yoo, Moo Sang Kim, Kyong Sik Kim, Sun Hee Park, and Sung Kuk Jung Tetracycline 내성유전자항생제감수성시험결과 TC에내성을갖는 11균주를대상으로 TC 내성유전자의분포를모니터링한결과 4균주 (8%) 에서 tetb가검출되었고그외유전자는검출되지않았다. 병원성대장균분리및혈청형동정 식품에서분리한 50건의대장균을대상으로병원성대장균형별을조사한결과 vero toxin 2를생산하는장출혈성대장균 O26 1건, eaea 유전자를가진장병원성대장균 1건이검출되었다. 고찰 식품의위생관리는식중독사고와밀접한관계가있으며, 대부분세균에의한식중독이주를이루고있다. 식품에의한식중독사고는보건위생학적인측면에서뿐만아니라, 식품에오염된내성세균의전파로최근심각한문제가되고있는내성세균의감염기회를제공하기도한다 17). 2010년 1월부터 6월까지서울시내에서유통중인식품을대상으로위생세균및식중독세균을모니터링한결과 1,313 건의샘플중 50건의대장균이검출되었으며, 대장균이분리된식품을유형별로살펴보면김밥과육회를포함한즉석섭취식품 635건중, 34건에서대장균이검출되어 5.4% 로가장높았으며, 단체급식소에서제공되는음식을포함하는조리식품 374건중 11건이검출되어 2.9% 의검출률을보였다. 이중육회에서분리된대장균중에는 VT2를생산하는장출혈성대장균 (EHEC) 이 1건검출되었으며 O혈청형은 O26이었다. 장출혈성대장균은장점막에심한손상을일으키고때로는적혈구를파괴하는독소를생성하는 Shiga toxin-producing E. coli 중하나로현재전세계적으로증가하고있는 non-o157 strain중가장흔한 serotype 으로알려져있다 18-21). 그리고포장마차에서판매되는김밥에서검출된대장균에서는 eaea 유전자를갖는장병원성대장균 (EPEC) 도 1건검출되었다. 즉석섭취식품의경우별도의조리과정없이소비자가그대로섭취하는식품으로식중독세균에오염된식품을섭취했을때인체에미치는영향이심각하게나타날수있음으로식품위생관리에각별히신경을써야할것이다. 국내외연구자료에따르면식품에서유래하는세균에대한항생제내성연구결과내성률이매우높게나타나고있으며 22), 특히대장균의경우설사증세가없는정상인에게서나심지어는식당에서제공되는음식과생수에서까지병원성대장균의한종류인 EAEC가갖는특유의유전자인 east1과 aggr이검출된보고가있었다 23-28). 이처럼 EAEC 유전자는이미광범위하게퍼져있다고추정할수있기때문에, 본연구에서는서울시내에유통되는식품에서분리된대장균의항생제내성률과 EAEC를비롯한병원성대장 균의유전자분포에관하여조사하였다. 그러나실험결과 EAEC 유전자는한건도검출되지않았다. 그리고대표적인그람음성균인 E. coli에대한항생제감수성시험결과는세파로스포린계항생제와아미노글리코시드계항생제에모두감수성이높았으며전체균주의 50% 는 16가지항생제에모두감수성을보였다. 내성이높게나타난항생제에대한내성유전자분포를살펴보면, 최근국내대형병원의임상검체에서분리되는 E. coli의 70% 이상이 ampicillin에내성이며그중대부분은 TEM-1 에의한것이라는보고가있었는데본연구결과 TEM이 1건에서검출되었으며, 테트라싸이클린계항생제내성유전자중에서도우리나라에서흔하게발견되는종류인 tetb가 4균주에서검출되었을뿐특이사항은없었다 29). 요약 서울시내에서유통되는식품과식품접객업소 ( 집단급식소포함 ) 의조리식품을대상으로식중독원인균분석및위생미생물검사를실시한결과, 분리된대장균의항생제감수성시험을통하여이들의내성정도를파악하고, 내성유전자와병원성유전자의분포도알아보았다. 모두 1313건의샘플중 50건에서대장균이검출되어 3.8% 의검출률을보였다. 이중육회 1건에서장출혈성대장균 O26 1건, 김밥에서장병원성대장균 1건이각각검출되었다. 50건의대장균중 50% 가 16종의항생제에모두감수성을보였으며내성이높게나타난항생제는 ampicillin(36%), amoxicillin/ clavulanic acid(32%) 그리고 tetracycline(22%) 의순이었다. 이들의내성유전자분포는 TEM이 1건, tetb 4건이각각검출되었다. 참고문헌 1. Christophr, J. L. M., and Alan, D. L. : Mortality by cause for eight regions of the world : global burden of disease study. Lancet, 349, , (1997). 2. Flint, J. A., Van Duyhoven, Y. T., Angulo, F. J., and DeLong, S. M. : Estimating the burden of acute gastroenteritis, foodborne disease, and pathogens commonly transmitted by food: an international review, CID. 41, , (2005). 3. Scallan, E., Majowicz, S. H., Hall G., and Banerjee, A. : Prevalence of diarrhea in the community in Austria, Canada, Ireland, and the United States. Int. J. Epidemiol., 34, , (2005). 4. 국립보건연구원 : 수인성식품매개성감염병감시망운영 : 2007 년사업결과및 2008 년사업계획서. 서울, (2008). 5. Dixon, B. : Antibiotics as growth promotors: risks and alternatives. ASM News, 66, , (2000). 6. Jack, A. H., Robert, G. A., and Carlos, F. A. : Do antibiotics maintain antibiotic resistance. Drug discovery today, 5, 5,

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