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1 보안과제( ), 일반과제( o ) 바약안304 의약품등안전관리 바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구 Development of Biosafety Testing SOPs for Gene Therapeutic Virus Vectors 충북보건대학교산학협력단 식품의약품안전청

2 별지제 6 호서식 용역연구개발과제연차실적 계획서 과제번호 바약안 304 단위과제명 과제명 주관연구책임자 국문 영문 2) 바이오의약품안전관리연구 바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구 Development of Biosafety Testing SOPs for Gene Therapeutic Virus Vectors 충북보건과학대학교산학협력단 소속기관충북보건대학교부서명전화번호산학협력단연구지원법인번호 담당자김우섭전자우편 성명박기랑전공생화학직위교수 ( 영문 ) Keerang Park 세부전공생화학및분자생물학 전화 휴대전화 전자우편 생년월일 세부과제성명소속기관전화번호휴대전화전자우편 세부과제책임자 1 2 총연구기간 2012 년 02 월 15 일 ~ 2013 년 11 월 30 일 (20.5 개월 ) 총연구개발비 당해연도연구기간 ( 연구개발비 ) 300,000 천원 2012 년 02 월 15 일 ~ 2012 년 11 월 30 일 (9.5 개월 ) (150,000 천원 ) 1 차연도 150,000 천원 2 차연도 150,000 천원 3 차연도천원 ( 총 2 개년중 1 년차 ) 관계규정과모든지시사항을준수하면서이용역연구개발사업을성실히수행하고자다음과같이용역연구개발과제연차실적 계획서를제출합니다 년 11 월 30 일 주관연구책임자 : 박기랑 ( 서명또는인 ) 주관연구기관장 : 충북보건과학대학교산학협력단 ( 직인 ) 식품의약품안전청장또는식품의약품안전평가원장귀하

3 제출문 식품의약품안전청장 / 식품의약품안전평가원장귀하 이보고서를 바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구 ( 충북보건 과학대학교 / 박기랑 ) 과제의연차실적 계획서로제출합니다 년. 11 월. 주관연구기관명 : 충북보건과학대학교 주관연구책임자 : 박기랑 - 1 -

4 목 차 당해연도연구개발실적 1. 연구의필요성 3 2. 연구개발과제의최종연구목표와당해연도연구목표 연구개발과제의당해연도연구내용및방법 연구개발과제의당해연도연구결과및고찰 연구개발과제의당해연도연구성과 연구수행에따른문제점및대책 요약문 115 차기연도연구개발계획 < 총괄연구과제 > 1. 총괄요약문 총괄차기연도연구개발비총괄표 총괄차기연도연구목표및내용 총괄차기연도연구개발추진전략 방법및추진체계 총괄차기연도연구개발결과의활용방안및기대성과 총괄주관연구책임자인적사항및연구개발실적 총괄참여연구원편성표

5 당해연도연구개발실적 1. 연구의필요성가. 연구개발필요성 - 최근임상시험용바이러스벡터유래유전자치료제가글로벌급신약으로산업화되기위해제조시설및제조공정확립이급속히진행되고있음 - 현재재조합아데노바이러스 (rad) 는신약개발중인생물의약품중, 특히유전자치료제벡터, 암백신, 항바이러스백신등에가장많이사용되는바이러스벡터인데, 국내에서는임상시험용의약품및 rad 생물의약품의제조및품질평가시험분석기술이낮은편이고, 전문시설이매우미비한형편임. 그러므로 rad의생산공정모델설정을통한생산공정중안전성관리체계확립이요구됨 - 유전자치료제생산에사용되는세포주는인간유래등동물세포유래가대부분이어서이에적합한세포주안전관리가또한매우필요하고그러한목적을달성하기위해생산세포주의안전성을검증하는품질평가시험법기반확립이시급함. 또한이러한시험법은유전자치료제를포함한대부분의생물학적제제의약품을생산하는생산세포주에도적용가능하므로확립된시험법의적용분야는매우광범위함. - 유전자치료제를개발하는대부분의국내수요처들은품질평가분석시험이필요할때, 해외 CRO 에시험을의뢰하여분석결과를받고있는실정이어서, 막대한외화가그비용으로유출되고있고신약개발및효율적인임상시험진행을방해하는요인으로작용하고있음. 따라서최근에국내에서도글로벌수준의시설과기술력을확보한국제적인 GMP 운영을하는 CDMO (Contract Development and Manufacturing Organization, CMO 및 CRO 기능을함께하는기관 ) 가설립되어 GMP 제조및품질분석시험을수행하기시작함. - 이러한필요성으로지난수년간본사업팀의유전자치료기술센터는임상시험용바이러스제제 (rad, raav 등 ) 의품질평가분석시험법을개발하고있으며, ( 주 ) 에스씨티와긴밀한산학협력으로 GMP 기반의품질평가시험법개발및 SOP 확립을추진하고있음. 이러한기술의확립을통해세계적인기술경쟁력확보, 수입대체효과와수출기대효과까지포함하는매우필요하고중요한분야임

6 나. 연구개발의경제적 산업적중요성 - 세계적인제약산업의시장규모에서생명과학과생명공학기술을이용한생물의약품 ( 유전자치료제, 재조합단백질, 치료항체, 백신, 세포치료제등 ) 이차지하는비중은그림 1와같이빠르게증가하고있음. 그림 1. 합성의약품 (Conventional) 과생물의약품 (Biotechnology) 의세계제약산업시장에서의변화추이 ( 상 ). 매출 규모 Top 100 제약품목의합성의약품과생물의약품의연차별비중변화 ( 하 ) 년미국 Genentech 생명공학회사에서 Humulin 이라는재조합인슐린단백질의약품을출시한이래그림 2와같이 blockbuster 급의다양한생물의약품이제품화되었고, 2009 년자료에의하면그림 1에서처럼가장높은매출을가진 "Top 100 제약품목 " 중생물의약품은 2014 년까지 50% 를차지할만큼그비중이급격히증가하고있음. 그림 2. 세계적인생물의약품의세계시장진입현황 - 4 -

7 - 전세계적으로지난수십년간생물의약품의신약개발은집중적으로진행되어왔으며, 글로벌급신약으로창출되면그경제적 산업적파급효과와함께시장규모가막대하므로선진국의대형제약사를포함하여무수히많은벤처기업, 국공립연구소, 대학등엄청난규모의개발비용과시간을들여 blockbuster 급 (1조원이상의시장규모제품 ) 신약개발을위하여매진하고있는추세임. - 현재세계시장규모가 1조원이상이되는 blockbuster 급생물의약품신약의대다수는단클론항체 (monoclonal antibodies, mabs) 와재조합단백질 (Recombinant proteins) 이며, 2015 년정도까지는이들의오리지널특허만료시점이예상됨에따라바이오시밀러 (Bio-similar) 제품을준비하기도하고, 이들보다효능을월등히개선한슈퍼바이오시밀러 (Super-biosimilar, Bio-better) 제품까지활발히개발하고있음 ( 그림 3). 그림 3. 생물의약품오리지널제품의특허만료시점과바이오시밀러제품의산업화전망 - 한편, 생물의약품바이오신약중에서유전자치료제와백신은매우큰부분을차지하고기술적으로유사한분야임. 초기의유전자치료는주로헌팅턴 disease 나 cystic fibrosis 같은단일유전자결손치료에초점을두었으며, 환자수가매우적은질병의시장성이적은분야로인식됨. 그러나, 2003 년 head and neck cancer에대한획기적인치료제로 Gendicine( 재조합아데노바이러스 rad-p53, SiBiono GeneTech) 을중국 the State Food and Drug Administration(SFDA) 에서승인하면서유전자치료가암, 혈관질환, 감염성질환등의치료방법으로확대되었고, 수많은제약, 투자회사들이관심을갖고추진하는 blockbuster 급임상용신약으로개념이확립되고있 - 5 -

8 음. 특히재조합아데노바이러스벡터 (rad) 는암치료제 암백신 약물스크리닝에도많이이 용되고있고, 가축구제역백신개발에도적용가능한그응용분야가매우광범위한바이러 스벡터임. - Frost Sullivan 의보고에의하면미국은유전자치료분야의지원을 2006 년 US $125 million에서 2011 년 US $ 6.5 billion으로증액하여지원함. 한편최근전세계를강타한신종플루와같은 Pandemic influenza 를대비하기위해백신개발및제조기술들도집중적으로개발되고있는데, 항암, 항바이러스백신분야에서는아데노바이러스벡터를가장많이이용하고있음. 그림 년현재유전자치료임상시험에사용되고있는벡터현황 (J. Gene Medicine) - 그림 4과같이 2012 년현재세계적인유전자치료제임상시험에가장많이사용되는벡터는아데노바이러스벡터 ( 총 483 건, 전체임상건수의 23.3%) 이고다음은레트로바이러스와 naked/plasmid DNA 등순으로그비중을차지하고있음. 또한아래표에서처럼 Pharma Ventures 보고에의하면, 암백신과유전자치료제등에아데노바이러스벡터가가장많이사용되고있고허가후곧시장에출시될가능성도높다고전망하고있음

9 표. 유전자치료제의개발현황의일부 (PharmaVentures Ltd, 2009) 회사적용대상질환제제명사용벡터임상현황 Merck & Co. Introgen Introgen SiBiono Oxford BioMedica anticancer Cervical vaccine Cancer(HPV) Gardasil rhpv16 On market gene therapy head and neck cancer INGN241 AdMda7 임상 3상 gene therapy head and neck cancer Advexin Adp53+Chemo 임상 3상 gene therapy head and neck cancer Gendicine Adp53 On market Vaccine HIV VIRxSYS lentivector 임상 3상 GeneVec Vaccine HIV N/A Ad 임상 1/2 상 GE Health Care Drug discovery Gene reporter assay system N/A Ad N/A Sunway Biotech gene therapy Head and neck (+ chemotherapy) H101 Oncolytic Ad 임상 3 상 - 한편, 국내유전자치료제임상시험현황은승인건수가총 15건이고, 이중아데노바이러스는총 4건 ( 약 27%) 이다. 비록세계적인임상현황에비해작은숫자이지만국내에서는최근들어지속적으로개발하는건수가빠르게증가하고있으며, 아데노바이러스를이용한전임상시험건수가현재총 9건 ( 두경부암, 피부암, 뇌종양, 유방암, 난소암, 췌장암등 ) 으로다른플라스미드 (4건) 와 AAV(2건 ) 에비해가장많이선호되는벡터이다. - 유전자치료제, 백신등생물의약품신약개발에서아데노바이러스가많이사용되는데에는유전자전달체로서여러가지우수한장점을가졌기때문인데, 가장큰장점은유전자전달효율성과발현이매우우수하고삽입가능한치료소재유전자크기에제한 ( 제 2세대 Ad 벡터는최대 35 kb 정도 ) 이거의없다는것이다. 또한무작위적인돌연변이와숙주세포유전체에건의영향을주지않는장점도있지만, 단점으로는면역반응이강하고유전자현기간이매우짧다는것이다. 한편, 아데노바이러스벡터가유전자치료제등임상시험을통한제품화로진행하면서그안전성에대한검증이매우중요하고따라서이러한안전성을검증할수있는평가시험법개발은매우필요하다. - 따라서선진생물의약품강국들은 ( 미국, 유럽 ) 수십년전부터유전자치료제등임상시험용의 약품의제조및품질평가분석기술을개발하고안전성을확보하기위해 GMP 제조및 - 7 -

10 testing SOP를확립하였고, 아직도그분석방법의민감도, 다양성및효용성을향상시키기위한방법들을활발히개발하고있으며, 이를통해생물의약품의신약개발및임상시험의활성화로신약의시장진입시간의감축, 산업화가능성증대, 조기투자를방지한경비절감효과등막대한경제적인효과를증명하고있음. - 특히, 이러한기술들은유전자치료제를포함한생물의약품전문 CDMO 사업분야에적용되어왔으며, 매년 15% 이상의고성장하는분야로시장규모 4.0 billion 달러를가진해외수출효과가높은것으로기대될뿐아니라, 현재국내바이오신약개발업체에서해외로부터공급받는것을대체할수있는수입대체효과가막대한분야임. 다. 연구개발의사회적중요성 - 본사업을통한유전자치료제및생물의약품의품질평가분석시험법개발과 SOP가확립되면, 현재개발중인많은생물의약품신약의임상시험이활성화되고 ( 비용절감효과 ), 이러한결과글로벌급신약의품목허가와시장진입이촉진됨. - 따라서, 악성종양, 심혈관질환, 감염성질환등현대의약학으로치료가어려운난치성질환으로 고생하는환자들에게빠르게신약이보급되어삶의질향상및건강한생명유지가가능함. 라. 연구개발의기술적중요성 - 유전자치료제등의생물의약품및임상시험용의약품에대한품질평가기준과시험방법들은국제적인 GMP 기준 (US FDA, EU European Pharmacopoeia, ICH, WHO 등 ) 에따라생물의약품의특성과안전성을검증하기위해요구되는분석및검증방법임. 따라서품질평가분석시험의기준과시험법을확립하여수행하게되어있음. - 특히임상시험용의약품의경우는 EU Clinical Trial Directive(2001/20/EC) 에따라 GMP 기준으로제조하고 cell banks와 virus banks 등제조시작단계에서부터 GMP에준한품질평가를실시하도록지시함. 미국 FDA의경우 2008 년 7월 21CFR part 211을수정하였는데임상시험 1상의약품만 GMP 원칙하에제조할수있도록약간 GMP 적용을느슨하게하였고반면, 임상시험 2상이상부터는완전 GMP에따라제조와품질평가를실시하도록규정하였음. - 유전자치료제개발에서가장큰부분을차지하는재조합아데노바이러스등생물의약품의제 조및품질평가분석시험 (QC) 규정으로는미국 FDA 의 21CFR Parts 210 과 211 인 current - 8 -

11 good manufacturing practice in manufacturing, processing, packing or holding of drugs general and current good manufacturing practice for finished pharmaceuticals ( 의전반적인규정을따라제조하여야하고, Biological products 에대한 21CFR Parts 600~680 규정, 그리고미국 FDA의 Center for Drug Evaluation and Research 와 Center for Biologics Evaluation and Research(CBER) ( /default.htm) 가이드라인, EP 7.0, USP 2011 등을참고하여야함. - 아래표에서유전자치료제등바이러스제제생산에사용되는생산세포주및임상시험용의 약품의특성분석과안전성분석에대한 cgmp 규정상요구하는시험항목및판정기준의일 례를정리하였음

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14 마. 연구개발의국내연구현황 - 국내의생명공학및유전공학기반의연구및관련기술은매우우수하고선진국의기술과비교하여거의차이가없는반면, 유전자치료제등생물의약품신약의산업화를활성화하기위한인프라조성및국가적인차원의지원정책은매우미약한편임. - 그러나 2000 년초부터차세대신약기술및고부가가치창출분야로관심을갖기시작하였고, 비전II 건강한생명사회지향 이라는목표로국가 12 부 1실 1처 3청이협력하여범정부차원에서기획한국가기술지도 (National Technology Road Map, NTRM) 가 2002 년 11 월발표되면서 유전자조작 전달기술 편이포함되었고, 유전자치료기술의세계적인경쟁력강화를위해필요한핵심기술과관련전략제품군을발표하였음 년 12월한국과학기술기획평가원 (KISTEP) 에서는 차세대성장동력 9개분야 를기획하면서유전자치료제등생물의약품의산업화의활성화를위한국가적인지원정책을제언하였고, 2004 년에는한국산업기술재단에서유전자치료제산업기술로드맵을기획하여암 심혈관질환 유전질환 뇌신경질환에대한표적지향적유전자치료제개발및산업화방안을구체적으로제시하였고 2013 년까지 세계 5위의유전자치료제개발국 을목표로하였음. 국가기술지도의 유전자조작 전달기술 편 (214 쪽 ) 에있는국내관련기술동향은아래표와같이정리되었음. 표. 국내유전자치료제의발전단계검토및예측 (NTRM, 유전자조작 전달기술, 214쪽 ) 단계 기간 ( 년 ) 내 용 기술도입 1995 ~ 1998 G7 프로젝트시작, 국외로부터관련기술습득 기술발전 1998 ~ 2000 본격적인유전자치료기술의기반확립 기술응용 2000 ~ 2005 환자를대상으로하는임상응용, 자체기술획득 기술산업화 2006 ~ 2010 본격적인산업화, 치료기술개발로세계시장진출 기술수출 2011 ~ 2020 확립된기술력을바탕으로수출 - 국내유전자치료제개발분야에대한최초의국가적인지원프로그램은 1999 년산업자원부주관의 차세대신기술개발사업 을통해시작되었고, 연세대학교암센터의김주항교수팀이지난 10 년간 난치성질환유전자치료제개발사업단 을이끌며매우우수한성과를내어암을포함한난치성질환을대상으로하는여러건의임상시험진입후보물질을개발하였음 (200 억지원 ) 년 12 월차세대성장동력사업의기획에준하여 2005 년과학기술부주관의 나노바이오연구개발사업 이시작되었고 9년간 120 억원을지원할예정임

15 - 생물의약품중유전자치료제개발및산업화를위한국내정부차원의지원은주변싱가포르및중국에비하여매우미약한편이고이러한것들은현재임상시험을진행하는제약회사및기관들이어려움을겪고있는결과로나타나고있음. 생명공학기술의우위를보이고있는국내연구자들은임상시험을진입하고싶어도대부분지원을받을수없는어려운형편이어서우수한유전자치료제후보물질을개발하여도비임상시험진입단계에서부터지원을받기가어렵고이러한결과는임상시험진입이매우어려운결과로이어지고있음. - 또한, 유전자치료제등생물의약품및생산세포주에대한제조공정과품질평가시험법개발에대한국내수준은신약개발분야보다도훨씬저조하고미비한실정임. 이에대한주된원인은유전자치료제를개발하는전문가들은 GMP 제조및품질평가시험법의 GMP testing 기반의 SOP 확립에대한전문적인지식과경험이매우부족하기때문임. - 국내에서유일하게본사업팀의유전자치료기술센터는바이러스제제기반의유전자치료제개발을주도하여왔고, 최근몇년간은바이러스제제임상시험용의약품의 GMP 제조공정개발및품질평가시험법의 GMP testing에의한 SOP 확립연구를집중적으로수행하여왔음. 지난 2010 년 ( 주 ) 에스씨티와산학협약을맺은이래긴밀한산학협력연구개발을효율적으로진행하고있음. 바. 연구개발의국외연구현황 - 본과제를통하여개발하고자하는기술은유전자치료제및생산세포주의품질평가시험법 SOP 확립이고이러한시험법은생명과학및생명공학전반적인기술과도연관되므로생명공학기술발전에대한전반적인현황과이러한기술들의사업화분야인바이오신약임상시험용의약품전문 CDMO 발전현황까지요약하고자함. - 세계적인의약품개발및시장은 1880 년~1930 년탁월한과학기술력의독일이화학약품을중심으로주도하다가, 1, 2차세계대전중인 1930~1970 년에는페니실린을포함한항생제개발을중심으로영국과학자들이주도하였음. 제2차세계대전후미국은전세계의우수한과학자들을의약학및과학기술분야로유입하여급격한발전을이룩하며 1980 년대글로벌급생물의약품신약의상품화를성공시켰고, 재조합단백질인슐린을생명공학기업 Genentech 에서출시하면서급속도로다양한글로벌급생물의약품신약개발및제품화와함께바이오의약품시장을선도하고있음

16 - 선진생물의약품강국중선도적인미국은 1990 년초부터바이오신약개발활성화와함께 GMP 기반의제조공정과품질평가방법개발, 그리고이들의산업화를촉진하였음. 임상시험용유전자치료제전문, 세포치료제전문위탁제조및품질평가 (CDMO) 인프라를구축하여신약개발을효율적으로지원하였는데, NIH를중심으로 National Gene Vector Laboratories(NGVL) 를선정하고지난 10 년간유전자치료제임상시험용의약품전문 CDMO 인프라를구축하여총 270 건이상의임상시험용의약품을생산하여공급하였고, 후속으로 National Gene Vector Bio-repository(NGVB) 사업및 Gene Therapy Resource Program(GTRP) 사업을통해유전자치료제임상시험용의약품을제조하여공급함으로써연구자들의신약개발및임상시험진행을활성화하였음. 그림 5. NGVL 홈페이지안내및제 2 단계 (2001 년 ~2005) 에선정된유전자치료제전문 CDM O 기관 - 한편, 2005 년부터 5년간미국에서실시한 Production Assistance for Cellular Therapies(PACT) 사업을통해세포치료제전문 CDMO 인프라를구축하였고, 세포치료제임상시험용의약품을 70건정도생산하여신약개발자들에게지원하였으며제조및품질평가기술의 know-how 에대한교육프로그램도활발히운영하고있음. PACT 사업에서는 NGVL을통해확립된유전자치료제전문 CDMO 시설을활용하여세포치료제전문 CDMO를구축하기도함. - 유럽에서도유전자치료제등생물의약품의 GMP 기반제조공정개발과함께품질평가기술 을개발하고확립하였는데, 영국에서는 2001 년부터 National Bio-manufacturing

17 Centre(NBC) 라는유전자치료제전문 CDMO를민간과정부가협력사업으로건립하여 2006 년부터운영함. 다국적 big pharma 들이밀집되어있고세계적인수준의생명과학기술이집중되어있는영국중서부지역위치하고있으며임상시험용의약품을생산하여공급함으로써유전자치료제신약개발을적극적으로지원하고있음. - 한편, 프랑스를중심으로한유럽연합은 1997 년부터 Gene Vector Production Network (GVPN) 을유럽연합과프랑스의민간희귀성질환협회 (Association Francaise contre les Myopathies, AFM) 가주도하여구축하였는데유전자치료제전문 CDMO 인프라를유럽각지역에있는기존의대학및연구소인프라를활용하여설립하고있으며, 유전자치료제제조및품질분석관련서비스운영의중심역할은 Genethone 이라는기업이주도하여 1997 년부터연간평균 300 건정도의임상시험용의약품을공급하는등매우높은효율성을인정받고있고글로벌급바이오신약창출에지대한공헌을하고있는것으로평가되고있음. - 이상과같이미국과유럽의선진바이오의약품강국들은유전자치료제개발과함께 GMP 제조공정및픔질평가기술의확립, 전문 CDMO 구축과함께민간기업을통해효율적으로운영하는시스템을구축하였고, 한편, 활성화정책및재정지원프로그램도추진하여생물의약품신약개발활성화효과로다수의 blockbuster 급신약이창출되어막대한매출을확보하는성공적인사례들입증하였음. 아울러허가에임박한다수의신약들도이러한효과로인해대부분미국과유럽등의선진강국에서나오고있음. 사. 연구개발의국내 외시장현황 - 국내 외시장규모 구분현재의시장규모 (2011 년 ) 예상시장규모 (2016 년 ) 세계시장규모 ( 억원 ) 4,000 8,060 국내시장규모 ( 억원 ) 산출근거 Nature Biotech, Frost & Sullivan, 한국보건산업진흥원 2007 년자료. 국내외시장규모는최근매년 15% 이상의성장을기록하고있다는통계를근거로하여계산

18 - 국내 외기술개발관련기업 경쟁사명 제품명 판매가격 ( 천원 ) 연판매액 ( 천원 ) 1 BioReliance ( 미국, Scotland) 재조합아데노바이러스제조및 품질평가분석시험 1,000,000 50,000,000 2 Wuxi/AppTec ( 중국 / 미국 ) 재조합아데노바이러스제조및 품질평가분석시험 1,000,000 50,000,000 3 Lonza/Vivante ( 미국 ) 재조합아데노바이러스제조및 품질평가분석시험 800,000 16,000,000 아. 총괄연구개발내용과관련한이전연구실적 (1) 외래성바이러스오염검출 - 본사업팀은외래성바이러스중 HTLV-1 과 2, 그리고 HIV-1 과 2의존재여부를확인하는 PCR 검출법을개발하였다. 아래그림 6 에서처럼, 일정분자수의 synthetic viral DNA(sViral DNA) 와 "viral DNA + gdna ( 세포주 genomic DNA)" 검체에서만특이적인 PCR product 가검출되었다. - 반면, gdna ( 세포주 genomic DNA) 만있거나, 음성대조군에서는 PCR 분석결과전혀증폭이 검출되지않았다. 그림 6. 동물세포 genomic DNA 에서외래성바이러스의검출을위한 PCR 결과

19 외래성바이러스 PCR 검출법에동물세포 genomic DNA (gdna), synthetic viral DNA (sviral DNA) 를넣고수행함. 동물세포 genomic DNA (gdna, lane 1~3), synthetic viral DNA(sViral DNA, lane 4~6), spiked control (lane 7~9), no template (lane 10~12). M: 100-bp ladder - Synthetic HTLV-1 과 2, 그리고 HIV-1 과 2 에대한유전자를각각이용하여정량화조건을확 립하였으며, 각 qrt-pcr 반응에는 10 6 ~ 10 분자수 copies 까지사용하였다 ( 그림 7). 그림 7. Synthetic HTLV-1 유전자를이용한표준곡선의한일례 (2) 외래성바이러스검출의민감도 - 본사업팀이현재까지개발한 PCR 검출법은외래성바이러스의존재여부를확인하는시험법 이고, 검출한계, 즉시험법의민감도는 500 copies 이다 ( 그림 8). 그림 8. 외래성바이러스의검출한계에대한 PCR 결과

20 - 상기그림 8에서처럼외래성바이러스 HTLV-1 과 2, 그리고 HIV-1 과 2의각각 PCR 반응에 synthetic Viral DNA를 10,000 ~ 0 copies 까지첨가하여 PCR 검출한계를분석하였다 (Lane 1: 10,000 copies, lane 2: 5,000 copies, lane 3: 1,000 copies, lane 4: 500 copies, lane 5: 100 copies, lane 6: 50 copies, lane 7: 10 copies, lane 8: 1 copies, lane 9: 0 copies, M: 100 bp ladder). (3) Detection and quantification of residual 293 DNA in adenovirus - 정제된아데노바이러스에서숙주세포 (293 cells) genomic DNA를검출하기위해정량화조건을확립하였다. Standard curve 는 293 세포에서분리한 genomic DNA를사용하여, 100 ng ~ 1 pg 수준까지검출할수있었다 ( 그림 9). 그림 genomic DNA 를이용한 Standard curve - 상기그림 9 에서 A 는증폭곡선, B 는 standard curve 로 R 2 값은 0.99 이상의값을얻을수있다. A 에서처럼 100 ng 부터 1 pg (10 배씩희석 ) 까지검출할수있으며, background 는무시할수준이 라증폭곡선에서생략하였다. (4) Detection of RCA in recombinant adenovirus vectors (ra d) - RCA (recombinant competent adenovirus) 생성정도를분석할수있는정확하며민감도높은 세포배양방법및복합적 nested PCR 방법을개발하고있다 ( 그림 10 과그림 11)

21 그림 10. Cell culture/cpe 방법으로관찰한 RCA 시험결과 - rad 검체에서는 RCA 가관찰되지않았으며, rad+wt (1 VP) 그룹중하나의 plate (Plate 3) 와 rad+wt (10 VP) 그룹중두개의 plate (Plate 2 와 Plate 3) 에서 CPE 가관찰되었다. 그림 11. Nestd PCR 방법을이용한 RCA 검사 - 그림 11 의 Cell culture/cpe 방법에의한결과를재확인할수있는 Nested PCR 분석방법을개발 하고있다 ( 그림 11)

22 (5) 품질평가시험법개발및검증을통한 SOP 확립의일례 - 본사업팀이마이코플라스마를검출하기위해 PCR 시험법을개발하고, 시험법밸리데이션프로 토콜을통해 SOP 를확립한일례를아래그림 12 에서제시함. 그림 12. 품질평가분석시험법개발및 SOP 확립의한일례. 마이코플라스마 - PCR 검출법의 SOP

23 그림 12. 품질평가분석시험법개발및 SOP 확립의한일례. 마이코플라스마 - PCR 검출법의 SOP

24 그림 12. 품질평가분석시험법개발및 SOP 확립의한일례. 마이코플라스마 - PCR 검출법의 SOP

25 자. 연구과제제안서 (RFP) 연구과제제안서 (RFP) 세세사업명 2) 바이오의약품안전관리연구과제번호 바약안 304 단위과제명 1 바이오의약품선도적평가기반연구 과제명 바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구 주관부서첨단바이오제품과과제담당자오일웅 보안성 미지정 연구기간단년도다년도총 (2) 개년중 (1) 년차 수행방법자체용역 공모 지정 1 차년도 150,000,000 원 2 차년도 150,000,000 원 소요예산 총액 ( 원 ) 300,000,000 원 3차년도 0원 4차년도 0원 5 차년도 0 원 연구형태조사연구 ( ), 시험연구 ( ) 제도개선등실용화성과 () 인력양성 () 연구성과활용확산 ( ) 안전관리기반미래기술확립 () 연구성과활용유형 시험조사연구역량강화 ( ) 표준화활동기반구축 () 국제경쟁력제고 ( ) 정책제안활용 () 학술성과를통한전문성강화 ( ) 기타 () 연구분야기술코드

26 연구의필요성 최근임상시험용바이러스벡터유래유전자치료제가글로벌급신약으로산업화되기위해제조시설및제조공정확립이급속히진행되고있음 현재유전자치료제중바이러스벡터유래유전자치료제에대한임상이가장활발하게진행되고있으며이중아데노바이러스가가장높은사용빈도를나타내고있어이의생산공정모델설정을통한생산공정중안전성관리체계확립이요구됨 유전자치료제생산에사용되는세포주는사람유래등동물세포유래가대부분이어서이에적합한세포주안전관리가필요함 이러한상황에서바이러스벡터유전자치료제에대한안전성을검증하는품질평가시험법기반확립이시급함 연구목표 유전자치료제개발시가장많이사용되는재조합아데노바이러스 (rad) 의생산세포주 (MCB, WCB) 및마스터세포주로부터최종제품까지의안전성평가지표제시및품질평가시험법확립 [1 차연도 ] 재조합아데노바이러스 (rad) 벡터제조용사람유래생산세포주 (MCB, W CB) 의안전성평가시험법확립 - EP, FDA 및 ICH 등외국공정서자료비교분석을통한사람유래생산세포주바이러스안전성평가지표항목설정 사람유래 virus(hiv1, HIV2, HTLV1, 2 provirus, HAV, HBV, HCV 등 ) 오염의 R T-PCR 검출법확립및검증을통한 SOP 확립 세포유래 virus(simian Spumavirus, Retrovirus, Proviral SIV 등 ) 오염의 in vitro 시험법확립및검증을통한 SOP 확립 연구내용 [2 차연도 ] 재조합아데노바이러스 (rad) 의제조공정중마스터세포주로부터최종제품까지의안전성평가시험법확립 - 외국 CRO 등의안전성평가시험관련자료비교분석을통한제조공정중바이러스안전성평가지표항목설정 생산공정물질유래 bovine virus, porcine virus 및 AAV 오염분석을위한시험법확립및검증을통한 SOP 확립 제조공정에기인한오염물질 ( 잔류 DNA 및단백질등 ) 검출시험법확립및검증을통한 SOP 확립 Replication competent adenovirus(rca) 검출시험법확립및검증을통한 SOP 확립 기대성과 바이러스벡터유래유전자치료제의안전성평가에필요한 SOP 확립을통한안전성평가기반구축 바이러스벡터유래유전자치료제가글로벌급신약으로산업화하는기간단축및시장진입촉진 연구성과활용계획일정 바이러스벡터유래유전자치료제의안전성평가시험기반마련 바이러스벡터유래유전자치료제의안전성품질평가시험법 SOP 확립 색인단어 국문 영문 유전자치료제 gene therapy 재조합안전성평가시험아데노바이러스 recombinant adenovirus biosafety testing

27 2. 연구개발과제의최종연구목표와당해연도연구목표 가. 최종연구개발목표 구분최종연구개발목표 총괄연구과제 유전자치료제개발시가장많이사용되는재조합아데노바이러스 (rad) 의생 산세포주 (MCB, WCB) 및마스터세포주로부터최종제품까지의안전성평 가지표제시및품질평가시험법확립 재조합아데노바이러스 (rad) 를포함하는생물의약품생산에사용되는동물세포주는 the EMA Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP), the FDA's Center for Drug Evaluation and Research (CDER), the International Conference on Harmonisation (ICH) 등에따라안전성평가분석시험이수행되어야하고, 공정서에나오는시헙법으로수행되는것이아니면시험분석법이밸리데이션프로토콜에따라검증되어야함. 본사업팀은외래성바이러스오염시험개발을위해 PCR 시험법을상당부분개발하였으나, 민감도가낮고 (500~1000 copies 이상검출가능 ), 정량적으로분석하기어려운단점이있다. 이러한문제점을해결하기위해서, 본과제의 1차년도에서는재조합아데노바이러스생산세포주 (MCB, WCB) 를이용하여외래성바이러스를검출하기위해 quantitative real-time PCR (qrt-pcr) 법과 in vitro 시험법을확립하여검증하고, 2차년도에는제조공정중마스터세포에서부터최종제품까지의외래성바이러스및기타오염물질의검출법을개발하여, 검증후 SOP 확립까지수행할계획임. 나. 당해연도연구개발목표 구분당해연도연구개발목표 총괄연구과제 유전자치료제개발시가장많이사용되는재조합아데노바이러스 (rad) 의생 산세포주 (MCB, WCB) 의안전성평가지표제시및품질평가시험법확립

28 3. 연구개발과제의당해연도연구내용및방법 가. 총괄연구개발과제 총괄연구개발과제명 총괄연구책임자 바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구 박기랑 / 충북보건과학대학교 / 생화학및분자생물학 (1) 1차년도연구개발내용재조합아데노바이러스 (rad) 벡터제조용사람유래생산세포주 (MCB, WCB) 의안전성평가시험법확립 ( 가 ) EP, FDA 및 ICH 등외국공정서자료비교분석을통한사람유래생산세포주바이러스안전성평가지표항목설정 ( 나 ) 사람유래 virus (HIV1, HIV2, HTLV1, 2 provirus, HAV, HBV, HCV 등 ) 오염의 qrt-pcr 검출법확립및검증을통한 SOP 확립 ( 다 ) 세포유래 virus (Simian Spumavirus, Retrovirus, Proviral SIV 등 ) 오염의 in vitro 시험법확립및검증을통한 SOP 확립 ( 라 ) 일반적인외래성바이러스오염검출을위한 in vitro 시험법확립및검증을통한 SOP 확립 (2) 1차년도연구개발방법 ( 가 ) Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction (qrt-pcr) 을통한외래성바이러스의검출 - 세포독성시험 (cytopathic effect, CPE) 을기반으로한외래성바이러스검출법은 bovine 또는 porcine 유래의일부검사법을제외하고는종특이적으로검출할수없는단점이있으며, 많은외래성바이러스는생물안전성수준 (biosafety leve, BSL) 이 3 이상이어서, in vitro 에서배양조건을확립하기가매우어렵다. - 따라서본과제에서는, 외래성바이러스의유전체염기서열중일부를이용하여합성유전자 ( 플라스미드 DNA) 를제작하고, 이를이용하여 quantitative PCR 법중하나인 real-time PCR (qrt-pcr) 방법으로외래성바이러스의오염에대한정량법을확립하고 SOP 를개발하고자한다. 즉, 종특이적외래성바이러스검출을위해특정바이러스의합성유전자를이용하여 qrt-pcr 방법으로극미량의오염이존재하는외래성바이러스를정량적으로검출하는방법을확립하고자하며, 아래그림 6의전략이적용되는바이러스는 HIV-1&2, HTLV-1&2, Hepatitis A, B & C viruses, SIV 등이다

29 그림 13. 외래성바이러스오염분석을위한 qrt-pcr 시험법확립전략 - 그림 13 에서검체는 MCB 나 WCB 같은아데노바이러스생산세포의 genomic DNA 이며, HTLV-1 genome 의일부유전자를합성하여 standard, positive control 과 spiked control 에사용한다. 시험결과는 positive control 과비교하여 spiked control 에서저해현상이관찰되지않아야하며, 합성유전자가포함된시료에서는 negative control 의 background level 과차이가있어야한다 (SG: Synthetic gene in plasmid, MCB: Master Cell Bank, qrt-pcr: quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, HTLV-1: Human T-lymphotropic Virus-1). - 이렇게각바이러스에대한 qrt-pcr 방법의검출법이개발되면아래그림 14 와같은시험법밸리데이션과정을거쳐각시험법에대한검증된 SOP 를개발하게된다. 그림 14. 외래성바이러스오염분석법개발후시험법밸리데이션 (AMV) 과정

30 ( 나 ) Detection of Reverse Transcriptase Activity by FPERT Assay (Retrovirus 검출 ) - 역전사효소 (reverse transcriptase) 활성은 retrovirus 의존재와연관이있으며, 중간공정의생물의약품또는최종생산품의 retrovirus 오염판정에사용할수있다. - 역전사효소활성은 fluorescent product enhanced reverse transcriptase (FPERT) assay 방법을이용하여측정되며, exogenous RNA template 은 brome mosaic virus (BMV) 를사용한다. 이때사용되는프라이머는 forward 5'-TCT TGA GTT AGA CCA CAA CGT TCC T-3' 과 reverse 5'-TGC GCT TGT CTC TGT GTG AGA-3' 이며, probe 는 5 -FAM-TCT GCT CGA GGA GAG CCC TGT-TCC-TAMRA-3' 를사용한다. - 시험결과는세포유래 polymerase 와 retrovirus 유래 reverse transcriptase 의구별이가능하여 false positive 가발생하면않도록한다. 본시험법에서밸리데이션프로토콜을확립하여검증해야하는것은 sensitivity, repeatability 와 linearity 이다. ( 다 ) Detection of Simian Spumavirus (Simian foamy virus) by PCR - Standard 로사용될주형 DNA 는 Simian foamy virus (SFV, ATCC VR-276 또는 VR-277) 인데, 이를구입하여유전체일부를 PCR 로증폭한후, 플라스미드에클로닝하여주형플라스미드 DNA 로사용한다. - qrt-pcr 시험용프라이머는 gag 유전자중 highly conserved region 을증폭하여사용하며, 염기서열은 gag1759f, 5 -ACG AAC ATC TGG TGC GGG, gag1835r, 5 -CTG CGT TTC CAC CAG CTG A-3 과 probe 는 gag FAM -AGG AAG AGG GAA CCA AAA CCG AAA CCA TAMRA-3 이다. SFV가감염된세포의 genomic DNA를분리하여 PCR 로검출할수있는최소검출량을결정한다. ( 라 ) Detection of Adventitious Virus Contaminants by I n Vitro Tests - 일반적인외래성바이러스오염검출을위해 MRC-5 세포 ( 사람이배체세포 ), Vero 세포 ( 원숭이신장세포 ) 및생산세포주를이용하여세포병변효과 (CPE), 혈구흡착 (hemadsorption) 및혈구응집 (hemagglutination) 을통한시험법을확립한다. - 세종류지표세포를 6-well culture plates 에준비하고, 각 well 에검체혹은대조군샘플 0.5 ml 를 70 분정도처리한후새로운배지로교환하고, 14 일간 1주에 3번이상 CPE 생성여부를현미경관찰한다. 14 일째배양관찰종료후세포병변효과를보이지않는바이러스를검출하기위래혈구흡착및혈구응집시험을 chicken, guinea pig 그리고 rhesus monkey erythrocytes 를이용하여 5 C 혹은 36 C 에서실시한다. 한편, 14 일째관찰한세포배양상청액은새로준비한세종류

31 지표세포에동일한방식으로다시처리하고연이어 14 일간다시 CPE 생성여부를관찰하며, 28 일째배양관찰종료후상기와동일한방식으로혈구흡착및혈구응집시험을한번더실시한 다

32 4. 연구개발과제의당해연도연구결과및고찰 가. 당해연도연구결과 (1) EP, FDA 및 ICH 등외국공정서자료비교분석을통한사람유래생산세포주바이러스안전성평가지표항목설정 ( 가 ) 국내식품의약품안전청 (KFDA) 과식품의약품평가원 (NiFDS) 에서는 2010 년 12월 생물의약품생산에사용되는세포기질관리가이드라인 ( ) 을발표하면서생물의약품생산에사용되는세포기질의특성과그증식에관련하여제품의품질과안전성 (safety) 에중요한영향을주는부분에대한품질평가분석시험을실시하도록가이드라인에서제시하고있다. 안전성검증시험으로는외래성오염인자 ( 바이러스, 세균, 진균, 몰리큐트, 마이코플라스마및결핵균 ), 해면상뇌증인자등의유무를검출하는부정시험법에대한가이드라인을제시하였다. ( 나 ) 본연구개발사업에서는이중에서재조합아데노바이러스 (rad) 제조용사람유래생산세포주 (MCB, WCB) 의외래성바이러스 in vitro 부정시험법을개발하는것인데, 특히정량적인 qrt-pcr (Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법을다양한오염가능한바이러스를대상으로개발하였고, 특히기존의검출정도보다우수한검출성을가진방법을개발하고자하였다. ( 다 ) 이러한시험법을개발하기위해서는이미 1993 년미국 FDA (Food and Drug Administration) 에서제시한 Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (July 12, 1993), 1999 년 9월에개정된 ICH Q5A, "Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin", 그리고 2010 년최근에그내용을업데이트하여 FDA와 CBER (Center for Biologics Evaluation and Research) 에서제시한 "Guidance for Industry - Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications" 의내용을바이러스선정기준및시험법개발의기준으로참고하였다. ( 라 ) 한편, 시험법밸리데이션을확립하는방법으로는 ICH (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) Q2(R1), Validation of Analytical Procedures: Test and Methodology" 와 2009 년 11월 EMEA CHMP (Committee for Medicinal Products for Human Use)

33 에서제시한 Guideline on Validation of Bioanalytical Methods" 를기준들을근거로진행하였다. 또한 EP와 USP 공정서도함께고려하여진행하였다. 한편생물의약품생산용세포기질에대한규정 (Requirements) 에관한것은 21 CFR 을근거로하였다. ( 라 ) 백신등을포함한생물의약품을제조하는데있어서는생산용세포기질에서부터생산용 seed stocks, 그리고최종제품에포함되는원료물질들까지그특성과안전성에대한철저한분석을통해최종제품이안전하고효율적으로인간에게적용될수있다는것을검증하는품질평가분석방법확립이매우중요하다. 이미 EP, UPS 및대한약전등에서공표된공정서방법은 "Suitability" 를확인하면시험법밸리데이션까지는필요하지않지만, 새로운분석방법을개발하여확립할때는적절한기준에따른밸리데이션과정을거쳐시험법을확립하게된다. ( 마 ) Qualification of Cell Banks에서중요한요소는, 이미허가된제품의생산에사용되는생산세포주로서특성이철저히분석되어안전한것으로확인된것을사용하는것이매우중요하다. 예를들면 CHO, Vero, 293 등의세포주들이있는데, 이러한세포주들도최종제품에 host cell DNA 혹은 host cell proteins 의잔류량이허가기준보다적다는것을엄격하게검증하도록되어있다. Rodent cell lines 의경우는대부분어느정도의 endogenous retroviruses 가존재하므로 retrovirus 의존재여부및오염정도를 TEM (Transmission Electron Microscopy), Infectivity Tests, FPERT 등의시험법을통해검증하도록제시하고있다. 21CFR610.18(c)(1)(ii) 에서는세포주의 tumorigenicity 에관한상세한분석자료를요구하고있고, 세포주는 passage 가높아짐에따라 tumorigenic properties 를갖는경향이있으므로안전성이확보된생산가능한 passage number 를분석결과를근거로하여제한하는것이중요하다. 경우에따라서는암세포주를생산세포주로이용하는데, 특별히 transforming 및 oncogenic agents가없음을검증하여야하고, 우선적으로는규제기관과안전성을검증하기위한부가적인시험에대한논의가선행되어야한다. ( 바 ) 한편, Qualification of Cell Banks에서중요한것은 adventitious agents가없음을검증하기위해민감도높은분석방법을요구한다. Adventitious agents 로는 bacteria, fungi, mycoplasma, spiroplasma, mycobacteria, viruses 그리고 TSEs (transmissible spongiform encephalopathies) 를일으키는 agents 를포함하며, MCB 및 WCB에서이 들각각에대한오염이없음을증명하기위해각분석시험에서는 10 7 cells/ml 혹은 이에상응하는세포수로부터준비된 cell lysates 를이용하며, 각 agent 의오염정도를

34 민감하게검출하는시험법이확립되어이미공정서에있는방법들도있고, 일부는가 이드라인에서기준들이제시되고있으며민감도높고정확한검출법을개발하는작업 도활발히진행되고있다. 그림 15. I n vivo 및 in vitro 외래성바이러스부정시험법 상기그림 15에서와같이본연구개발사업에서는기존의검출방법보다민감도가높고정확한외래성바이러스검출시험방법을 qrt-pcr 방법을기준으로하여개발되었고, 시험법밸리데이션과정으로 Specificity, Detection Limit, Linearity, Accuracy, Quantitative Range, Quantitative Limit, Precision, Robustness 등을확인하여확립하였다. 한편, human diploid cells, monkey kidney cells 그리고제조에사용한생산세포주등세종류를포함하여수행하는 in vitro adventitious virus 분석법을확립하였다. 시험법을개발하려는바이러스의선정근거는아래그림 16과같다

35 그림 16. 시험법개발에선정된바이러스에대한선정기준 ( 사 ) ICH Q2(R1), EP Nucleic Acid Amplification Techniques 에서제시된방법 ( 그림 17) 에따라시험법밸리데이션이진행되었다. 그림 17. ICH Q2A 및 Q2B 의시험법밸리데이션항목 상기의밸리데이션항목중에서바이러스검출법특성에따라 Quantitative test impurity content 혹은 Limit test for impurities 중하나의기준에맞추어시험법밸리

36 데이션과정을수행하였다. 각항목에대한기준은아래와같이설정하여진행하였다. 1 Specificity - 각바이러스특이적인부분을 Blast search 등을통해선정하여 PCR 프라이머쌍을제작하였고, 여러쌍을제작하여특이적인증폭을보이는것을선정하여시험법개발에사용하였다. 특히생산세포주 MCB를 test article 로사용하여특이적인증폭을나타내는 PCR 조건으로진행하였다. 한편 PCR 조건을최적화하기위해서는 positive control DNA template를사용하였다. 2 Detection Limit (DL) - Positive control DNA template 의농도는 ICH Q2에서 5개이상의농도군을사용하는것으로제시하였고, 본연구에서는 10 8 ~ 10 2 (10 1 ) copies 로 7 ~ 8 농도군을포함하였다. 한번실험에 8 replica 반응으로최소 3번의독립적인시험결과를가지고분석하였으며, DL은 95% positive cut-off point를가지는가장낮은농도로정하였다. 3 Linearity - 바이러스오염정도에대한직선성은 10 8 ~ 10 2 (10 1 ) copies 로 7 ~ 8 농 도군을포함하여시험하였고, R 2 > 0.90, 즉 (R) value 가 0.95 정도되는것을허용기준 으로하였다. 4 Accuracy - Positive control DNA template 10 8 ~ 10 2 (10 1 ) copies 로 8 replicates 시험을통해농도를모르는 unknown의농도를예측하고 comparative standard 값과비교하여 + 2 배이내에들어오면 acceptable 한것으로판정한다. 5 Quantitative Range - Positive control DNA template 10 8 ~ 10 2 (10 1 ) copies 로 8 replicates 시험을통해결정하였다. 6 Quantitative Limit (QL) - DL 및 accuracy 의수행방법과동일하게수행하고, QL은 calculated unknown 값이상응하는 standard 값의 + 2 배이내에들어오는가장낮은농도값으로정한다. 7 Precision - Positive control DNA template 10 8 ~ 10 2 (10 1 ) copies 로 8 replicates 시험을통해 95% positive cut-off 의기준을가지고 assay repeatability 를정하였다. Intermediate precision 에대하여는다른작업자가다른시기에수행한동일한시험법으로얻은결과의 mean, standard deviation, % CV (coefficient of variation) 에대한값이다. Reproducibility 는다른실험실로시험법을이전하여동일한시험법을수행하였을때얻는결과값에대한평가인데본시험법밸리데이션에서는포함하지않았음. 8 Robustness - PCR primers 와 probe 농도의최적화과정을통해확인하였다

37 (2) 사람유래 virus (HIV-1, HIV-2, HTLV-1, -2 provirus, HAV, HBV, HCV 등 ) 오염의 qrt-pcr 검출법확립및검증을통한 SOP 확립 ( 아래에서통합하여보고하였음 ) (3) 세포유래 virus (Simian Spumavirus, Retrovirus, Proviral SIV 등 ) 오염의 in vitro 시험법확립및검증을통한 SOP 확립 ( 아래에서통합하여보고하였음 ) ( 가 ) Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction (qrt-pcr) 을통한외래성바이러스의검출 / ( 다 ) Detection of Simian Spumavirus (Simian foamy virus) by PCR 개요본사업에서 1차년도에개발하고자하는품질평가분석기술은아데노바이러스제조용생산세포주의 Master cell bank (MCB) 와 Working cell bank (WCB) 의안전성평가시험법중기존의 in vitro adventitious virus 검사법으로는검출하기어려운바이러스들의민감도높은검출법을개발하는것이다. 이렇게안전성검증에꼭필요하여오염여부에대한검출이요구되는바이러스로는 9 CFR 610, ICH Q5A, EMEA CHMP, FDA Guidance for Industry, EP 등에서설명하고있으며, 사람혹은세포유래바이러스들로 Quantitative real-time PCR 기반의분석시험법을개발하여시험법밸리데이션까지수행한후 SOP를확립하는데있다. 특히 ICH Q5A "Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived From Cell Lines of Human or Animal Origin (September, 1999)" 에서는사람또는동물유래 (i.e., mammalian, avian, insect) 의세포주를이용하여제조된생물의약품들은바이러스에대한안전성검증을위한품질평가시험이중요하다고강조하여설명하고있다. 바이러스오염은 MCB, WCB와생물의약품생산과정에서발생할가능성이높으며, cell bank 특성분석과생산과정에서 in vitro virus screening 을수행하도록권고하고있다. 본사업에서는각바이러스특이적인프라이머쌍과 probe 를제작하여 PCR 방법의 optimization 과정을수행하였고가장민감도높고반복성이있는조건으로시험법을개발하였다. 이렇게개발된 qrt-pcr 시험법은 ICH Q2(R1) 과 EMEA/CHMP (Committee for Medicinal Products for Human Use) 가이드라인을기준으로시험법밸리데이션과정을수행하여시험법과 SOP 확립을완료하였다. 재료및방법 Genomic DNA 의준비 Genomic DNA 추출은 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) 을이용하였다. HEK293 cell 을배양하여약 3 X 10 6 개의 cell 을 harvest 하여 1.5 ml tube에넣고 15,000 g에서 10초간원심분리하여 1차적으로배지성분을제거하였으며 2차로 PBS 200 μl를사용하여불순물을완전히제거하였다. Nuclei Lysis Soution을 600 μl와 RNase 3 μl를넣고 37 에

38 서 30분간반응하여 cell 완전히분해한뒤 200 μl의 protein precipitaion solution 을첨가하여 vortex 후 4분간 15,000 g에서원심분리하여단백질을완전히제거하였다. 상층액만새로운 tube로옮겨담고동일양의 isopropanol 을첨가하여 1,5000 g에서 10분간원심분리하였고상층액을제거하고, 다시동량의 70% 에탄올을넣고 15,000 g에서 10분간원심분리하여 DNA를제외한불순물을제거하였다. 마지막으로 1.5 ml tube에존재하는에탄올을모두제거한뒤 UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (Gibco, Invitrogen, USA) 를이용하여 DNA 를 elution 하였다. Standard template DNA (Reference DNA) 및 RNA 준비 HTLV-1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2, HAV, HBV, HCV, HBV, SIV, Simian Spuma virus의각유전체의일부분을합성 (Bioneer, Korea) 하여플라스미드에클로닝하였으며, TOP-10 competent cells 로부터증폭된 DNA를정제하여 (Maxi kit, Qiagen, USA) 실험에사용하였다. Reference DNA의농도및순도는 OD 260/280 을측정하여확인하였으며, 1회사용량씩분주하여 -80 에보관하였다. Oligonucleotide primers and probes 준비 HTLV-1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2, HAV, HBV, HCV, HBV, SIV, Simian Spuma virus에특이적으로반응하는 primer (Bioneer, Korea) 를제작하여사용하였다, 각바이러스의특이적프라이머쌍을다수제작하였고, PCR optimization 수행결과선정된최적의프라이머쌍에해당하는 Taq-man probe 를제작하였다아래표는각바이러스검출용최적의프라이머쌍과 Taq-man probe를정리한것이다. 인간유래바이러스 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 HTLV-I Forward primer Reverse primer Probe Reference 5'-CAA GGT CCT TAC CCC GCC AAT CA-3' 5'-CTG TTT GCC CAC CCT TTT CC-3' 5'-CCG ATG GCA CGC CTA TGA TTT CC-3' 5'-AGT CCG GGG TCT GGA AAA GAC AGG-3' 5'-AGG CGT GCC ATC GGT AAA TGT CC-3' 5'-AGG GGT GGT AGG CCT TGG TTT GA-3' 5'-[FAM] ATG GAT ACA TGG AAC CAA CCC TTG GGC A-[TAMRA]-3' 5'-[FAM] TTC CTC CAG GCC ATG CGC AAA TAC T-[TAMRA]-3' GenBank: NC_

39 sequence HTLV-II Forward primer Reverse primer Probe Reference sequence HIV-I Forward primer Reverse primer Probe Reference sequence HIV-II Forward primer Reverse primer Probe Reference sequence HAV Forward primer Reverse primer Probe Reference sequence HBV Forward primer Reverse primer Probe 5 -TGT TTG GCG ATT GTG TAC AGG CCG A-3 5'-GAG GCA CAC CAG ATG TCA GAC T-3' 5 -TTG AAA GAA GGC AGG TGG AAC CTT GGG-3 5'-GCG AGG GAT AAG GTA TTG GAG-3' 5'-[FAM]-ATC GAT GGA CGC GTT GTC AGC TCT-[TAMRA]-3' GenBank: AF '-ATC CAG TGC ATG CAG GGC CTA TT-3' 5 -TGC ACC AGG CCA GAT GAG AGA AC-3 5'-CCT GTG AAG CTT GCT CGG CTC TT-3' 5'-[FAM]-GGG GAA GTG ACA TAG CAG GA-[TAMRA]-3' GenBank: NC_ '-TTC GAG TGG CTA GAG AGG ACC ATA-3' 5'-CAG GAA ACA GTG GAG AAG AGA CCA-3' 5'-TGC CAA TAT CTC CAG GAC CTT TGC-3' 5'-CAG CAA GTG CAC CCT CTC TTG AAA-3' 5'-[FAM]-AAA CGA GGA GGC AGT GAA CCA TCT-[TAMRA]-3' GenBank: NC_ '-GAG CTT TGA ATC GCC TGG CAA CA-3' 5'-TCA ACT TTG GAA ATG GCA GGA CTG GTT AGG-3' 5'-CTG CTT GTG CCT TCC CAT GCT TA-3' 5'-CCT CCA GCA ACA TGG ATG CCC AAG A-3' 5'-CTG ACT TTC AAT TTT CTT ATC AAT ATT TTG GAA CAT-3' 5'-CCA GGA AGA CCT TCG CCT TTT CC-3' 5'-GAG CTT TGA ATC GCC TGG CAA CA-3' 5'-[FAM]-TGA GGG CCC ACT AAA GAT GGA AGA GA-[TAMRA]-3' GenBank: NC_ '-TGC CCC TAT CTT ATC AAC ACT TCC GG-3' 5'-ATT TGG TGT CTT TCG GAG TGT G-3' 5'-TTT GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT-3' 5'-GAG ATT GAG ATC TTC TGC GAC GCG GG-3' 5'-TGC GAG GCG AGG GAG TTC TTC TT-3' 5'-GGA CCT GCC TCG TCG TCT AA-3' 5'-[FAM]-AAC TAC TGT TGT TAG ACG ACG GGA CCG A-[TAMRA]-3'

40 Reference sequence HCV Forward primer Reverse primer Probe Reference sequence GenBank: NC_ '-TTC ACG CAG AAA GCG TCT AGC CAT-3' 5'-GCC ATG GCG TTA GTA TGA GT-3' 5'-GCA CCC TAT CAG GCA GTA CCA CAA-3' 5'-TGC GTC GTC TAC GAG ACC T-3' 5'-[FAM]-GGG AGA GCC ATA GTG GTC TGC GGA A-[TAMRA]-3' GenBank: NC_ 세포유래바이러스 Simian Spumavirus Forward primer Reverse primer Probe Reference sequence SIV Forward primer Reverse primer Probe Reference sequence 5'-TGA TCA ACC TCG TTC CCA GAG TCA-3' 5'-AGT CAC GAA CAT CTG GTG CTG-3' 5'-CAA AGA TAC GGA GGA GGA CGA G-3' 5'-AGG AGG AAG TTG TGG TTG CTG TCA-3' 5'-CCT TGA TTT CTG CTT CCA GAG G-3' 5'-GGC TGG AGG AGT TGT AGA GGA T-3' 5'-[FAM]-AGG AAG AGG GAA TCA AAA CCG AA-[TAMRA]-3' GenBank: NC_ '-CAG GGA GAA GCC TCG ACA CGT T-3' 5 -AGG CTA CGT CCG AAC GGG AAA A-3 5'-AAT GCA CCA AAT GAC GCA GCA C -3' 5 -TTA ACG TGC GCG GAG ACA AAG G-3 5'-[FAM]-TGG GCA GGA AAA GAA ATG GAA CG-[TAMRA]-3' GenBank: NC_ Standard curve 및 test sample (test article, 검체 ) 준비 Test material은 Reference DNA를희석하여 1 μl에 100 copies 의바이러스 gene을포함하도록희석한후 HEK293 genomic DNA를 0.5 μg 섞어사용하였다. Negative control 은 HEK293 alone sample과 water sample을사용하였으며, Standard curve는 Reference DNA를 serial dilution 하여 1 X 10 8 ~ 1 X 10 copies 까지측정하였다. Real-time PCR에사용한 DNA 중합효소는 Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems No ) 를사용하였다. Real-time PCR reaction mixture를하나의 tube당총 50 μl volume으로만들어사용하였

41 으며, 반응조건은 Amplitaq gold activation 분반응후에 Denature 초, Anneal/Extend 60 1 분을 1 cycle 로하여 40 cycles 반응하였다 ( 아래표참조 ). 표. Quantitative Real-time PCR (qrt-pcr) 반응혼합액조성성분 ( 단위, μl) Standard sample Negative control Test sample Sample control gdna (0.5 μg/μl) HTLV Taqman Universial PCR Master Mix Primer (Forward) Primer (Reverse) Probe Total volume M ethod optimization & Sample suitability 외래성바이러스의유전체일부를포함하는플라스미드또는합성된핵산을주형으로시험법밸리데이션을진행하였다. 시험법밸리데이션을진행하기전에사용되는검체 (test article) 에의한저해효과, 즉간섭효과 (interference) 등이없는지를확인하는검체의적절성 (sample suitability) 을포함하여시험방법에대한최적화 (method optimization) 를수행하였다. Method optimization 에서는 1) 저해효과와비특이적인반응이적은 primer 와 probes 의선정, 2) PCR one-cycling 방법 (2-step cycle or 3-step cycle), 3) 증폭에필요한총 Cycles 수등을대상으로하였다. 일부외래성바이러스는 primer 와 probe 의농도에대한최적화도실시하였다. Method optimization 에사용되는 primers 는타겟바이러스유전체의 2 곳이상을선정하였고, 각유전체영역에대한최소 2쌍이상의프라이머쌍을제작하여가장효율적인부분을선별하였으며, 선정된타겟부위의 PCR 증폭영역내부에 probe 를제작하여, 시험법밸리데이션에적용하였다. PCR one-cycling 방법 (2-step cycle or 3-step cycle) 에서는 2-step cycling 방식 (denaturation annealing/polymerization) 이전통적인 3-step cycling 방식 (denaturation annealing polymerization) 보다더효율이좋았다. Real time PCR 반응에서증폭에필요한총 cycles 수는 background signal, amplification plot,

42 quantitation limit 등을고려하여결정하였다. 검체로는아데노바이러스생산에이용되는 293 세포의 genomic DNA를사용하였다. HEK293 genomic DNA에오염된외래성바이러스를검출할수있는최대의 genomic DNA양을결정하였으며, 0.5 μg genomic DNA가 interference ( 저해또는증폭 ) 영향을적게받으면서사용할수있는최대량임을확인하였다. 그림 18. M ethod optimization & Sample suitability Primer, Probe optimization 각각의외래성바이러스를특이적으로검출하기위해한바이러스당 2쌍이상의 primer 와 probe 를제작하였으며, 다양한조합으로반응을진행하여최적의가장반응성이좋은 1쌍의 primer 와 probe 를선정하였다. PCR 반응조건은 qrt-pcr 조건으로수행하였고, PCR 반응결과 standard curves를비교분석하여최적의조건을결정하였다 ( 아래그림 19 참조 )

43 그림 19. Primer, Probe optimization Real-time PCR condition optimization 외래성바이러스에특이적으로반응하는 Primer 와 Probe 쌍을이용하여 Real-time PCR 반응조건과 Cycle 수를결정하였다. 반응조건은 2-step 과 3-step 으로진행하여어느조건에서반응이더잘되는지확인하였으며, 40 cycles 혹은 50 cycles 씩반응시켜 back ground signal 의발생정도와결과값의해석이용이한 cycles 수를확인하였다 ( 아래그림 20 참고 )

44 그림. 20. Real-time PCR condition optimization Sample suitability Method optimization 과정을통해 qrt-pcr 반응이가장민감도높고반복성있게수행되는최적조건을확립하였고, 이를바탕으로다음단계인 Sample suitability 과정을수행하였다. 이실험을위해서는아데노바이러스생산세포주 293 세포의 cellular genomic DNA 0.5 μg을 Standard template DNA와섞어 qrt-pcr 반응을수행하였다. 한편, PCR 반응시험군중에서는 Standard template DNA만포함하는시험군도포함하여 Cellular genomic DNA의포함여부가 qrt-pcr 반응에영향을주는지등검체에의한 interference 정도를분석하였다. 즉, Standard template DNA 100 copies 에 cellular genomic DNA 0.5 μg을섞어 qrt-pcr 반응결과얻은 Standard curve 결과값과 Standard template DNA 100 copies alone 인경우얻은 Standard curve의결과값의차이를면밀히비교분석하여, 검체 cellular genomic DNA로인한 qrt-pcr 반응의 interference 가없으면시험법개발을완료하였고, 그다음으로는시험법밸리데이션과정을진행하였다 ( 아래그림 21 참조 )

45 그림 21. Sample suitability 외래성바이러스시험법밸리데이션 (A nalytical M ethod Validation) Method optimization & Sample suitability 를통해외래성바이러스검출을위한최적화된 qrt-pcr 시험법을개발하였고, 이를바탕으로 Analytical method validation 을통해 ICH Q2(R1) 에서제시하는 Limit testing for impurities" 의밸리데이션수행항목에따라 Detection Limit ( 검출한계 ) 와특이성 (Specificity) 을밸리데이션하였고, Standard template DNA를포함한 qrt-pcr 반응에서는직진성 (Linearity) 을확인하였다. 또한, 밸리데이션에서중요한 Precision 검증을위해 EP에서제시하는 95% positive cut off 등을확인하였다. Analytical method validation 방법은최소한 3 회의독립적인 Standard template DNA 희석과 test sample 준비를통한 qrt-pcr 반응을실시하였고, 각각의독립적인시험에서는각시험군당 8 replica 조건으로수행하여각시험군당최소 24회반복 qrt-pcr 시험결과를얻은후, 통계분석방법을통해평가하였다. 이러한 24회반복검사결과에대한기준은식품의약품안전청에서발행한핵산증폭검사법검증가이드라인과 European Pharmacopoeia 을참고하였다. 즉, triplicate 조건으로 8회독립적인시험을반복하거나, 8 replica 조건으로 3회독립적인반복실험을실시하는밸리데이션방법을수행하였다

46 1 Real-time PCR assay for the detection of Human T-cell Lymphotropic Virus-1 (HTLV-1 provirus) in biological samples HTLV-1 개요 Human T-cell Lymphotrophic Virus (HTLV) 는레트로바이러스 (Retrovirus) 과 ( 科 ) 에속한다. 기원은에볼라바이러스에서시작된것으로그변종이발생하여지금의 HTLV라는새로운바이러스가나타난것으로알려져있다. Human T Lymphotrophic Virus 종류는 HTLV-1, HTLV-2, HTLV-3, HTLV-4의 4종류가있으며, 이중사람에게질환을유발하는것으로확인된것은 HTLV-1이며, HTLV-2는증명은되지않았지만질환을일으킬가능성이높으며 HTLV-3, HTLV-4는질환을일으키지않는것으로알려져있다. HTLV는감염된 T세포는감염후약 30~50 년후에 성인 T세포백혈병 (Adult T-cell Leukemia, ATL) 을일으키며, 발생빈도는 HTLV에감염자중약 2~5% 에서백혈병으로발전하는것으로알려져있다. HTLV의유전체는다양한유전자들을암호화하고있으며, 가장변이가적으면서특이적인부분은 rex/ tax 유전자이다. tax와 rex유전자는유전자발현에중요한역할을하는 nonvirion 단백질을암호화하고있다. HTLV-1의양성대조군으로사용하기위해 tax와 rex유전자를암호화하고있는 1,118-bp 를합성하여 pgem-t easy vecter (Promega, USA) 에삽입하였고 pgem-t-htlv-1 을제작하여 Standard template DNA (Reference DNA) 및양성대조군으로사용하였다

47 그림 22. HTLV-1의유전체지도와 pgem-t-htlv-1 standard template DNA 유전자지도 HTLV-1의유전체중유전자변이가가장작은부위로알려져있는 R ex, Tax 유전자부위를합성하여 pgem-t Easy Vector에클로닝하였다. A. HTLV-1의유전자지도. 붉은색박스는 R ex, Tax유전자부위를나타내고있다. B. pgem-t Easy Vector 의 R ex, Tax 유전자클로닝부위 Real-time PCR primer 및 probe 디자인 HTLV-1 유전체증폭에특이적인우수한프라이머를선택하기위해 tax와 rex유전자내부의가장특이적인부분을선별하여 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database 로분석하였다. 또한 Real-time PCR을이용하였을때 HTLV-1만을검출하도록특이성을높이기위해 5' 말단과 3 말단에각각 FAM과 TAMRA가붙어있는 probe 를제작하여사용하였다. probe 의염기서열은 5' -[FAM] ATG GAT ACA TGG AAC CAA CCC TTG GGC A-[TAMRA]-3' 이며 BLAST search homology database로분석을통해 HTLV-I 유전자의 rex/ tax 영역에만반응하는것을확인하였다. Standard curve 설정및 Sample suitability HTLV-1의 Standard template DNA (reference DNA, 양성대조군 ) 인 pgem-t-htlv-1 plasmid DNA를이용하여아보가드로의법칙에의거한분자수를계산하였고, serial dilution 으로 1 x 10 2 ~ 1 x 10 8 copies 까지주형 template 를포함한 Standard curve 시험을실시하였다. 3 번의반복시험을통해유사한결과값이나오는지확인하였으며이를통해 100 copies 까지검출가능한것으로확인되었다 ( 그림 23). 또한 reference DNA 100 copies 에 HEK293 cellular genomic DNA 0.5 μg을혼합하여검체에의한 qrt-pcr 반응에저해효과가없음을확인하였고그결과는아래그림 24와같다

48 그림 23. HTLV-I 의 Standard curve optimization 그림 24. HTLV-I Sample suitability

49 HTLV-1 시험법밸리데이션 Method optimization & Sample suitability 을통하여 HTLV-I 검출법을최적화하였다. 이를 바탕으로 3 replica 씩 8회독립적인실험을수행하여아래그림 25와같은검증결과를얻었다. qrt-pcr 시험군중에서는아데노바이러스생산세포주가 HTLV-1 virus에오염된상황과같이 pgem-t-htlv-1 양성대조군을 spiking 하는, 즉 cellular genomic DNA 0.5 μg에 HTLV-1 Reference DNA 100 copies 와혼합한시험군도포함하였다. 총 24회반복실험을통해얻은 data 값을이용하여통계분석하였고, 아래그림과같은검출한계 (Detection Limit), 직선성 (Linearity), 특이성 (Specificity), 95% positive cut off 등을검증하였다. 그림 25. HTLV-1 시험법밸리데이션결과 LOQ 는 standard curve 의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD 는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive 로증폭되는최소농도로결정하였으며, HTLV-1 검출법의 LOD 는 100 copies 이며, 이때 C T 값은 ± 0.50 으로측정되었다 ( 그 림 25 참조 )

50 2 Real-time PCR assay for the detection of Human T-cell Lymphotropic Virus-2 (HTLV-2 provirus) in biological samples HTLV-2 개요 HTLV의유전체는다양한유전자들을암호화하고있으며, 가장변이가적으면서특이적인부분은 rex/ tax 유전자이다. tax와 rex유전자는유전자발현에중요한역할을하는 nonvirion 단백질을암호화하고있다. HTLV-2의양성대조군으로사용하기위해 tax와 rex유전자를암호화하고있는유전자부분을 HTLV-2의검출을위해 HTLV-2 gp5 tax 암호화부위 3,034-bp 부위를 TAKARA Ex Taq polymerase (Hot start Version) 를사용하여증폭하였으며, 사용한 PCR 프라이머의염기서열은 F: 5 -GGC CGA GCT CGT TAA ACA GAC CAC CAA CAC CAT GGG TAA-3, R: 5 -ATC TCC CGG GCG ATC CCA TTG TCA TCC GCC TCT TCT TT-3 이다. DNA 증폭후 Invitorogen 사의 pcdna3.1 TOPO TA Expression Kit를사용하여 HTLV-2 gp5 tax region 을삽입시킨뒤 pcdna3.1-htlv-2 를제작하여 Standard template DNA (Reference DNA) 및양성대조군으로사용하였다. 그림 26. HTLV-2 의 HTLV-2 gp5 tax 암호화부위

51 Standard template DNA 제작을위한 HTLV-2 gp5 tax PCR 증폭및 subcloning PCR product 확인 HTLV-2 gp5 증폭증폭된 DNA 분리 그림 27. Standard template DNA 제작을위한 HTLV-2 gp5 tax 부위증폭 (3,066-bp) Invitrogen 사의 pcdna3.1 V5-His TOPO TA Expression Kit 의 DNA 를가지고 PCR 증폭 한 HTLV-2 gp5 tax region 을삽입시켜, pcdna3.1-htlv-2 Standard template DNA 를아 래그림과같이준비하였다. 그림 28. Invitrogen 사의 pcdna 3.1 plasmid vector

52 그림 27에서와같이 TA 클로닝과정에서얻은 12개의클론을 BstXI 으로절단하여스크리닝하였으며, 클론 No. 3과 No. 6번에서원하는크기의 DNA 절편 (5,520-bp 와 3066-bp) 을확인할수있었다. 클론 No. 3과 No.6 은추가적으로 NcoI으로절단하여원하는크기의 DNA 절편 (358-bp, 738-bp, 1,491-bp, 2,627-bp, 3,347-bp) 을확인할수있었다. 그림 29. pcdna 3.1-HTLV-2 Standard template DNA subcloning 의스크리닝 A: 12 개의클론을 BstXI 으로절단한후전기영동한사진. B: A 의 3 과 6 번의클론을 B stx I 또는 N coi 으로절단하고재확인한전기영동사진. 그림 30. pcdna-htlv-2 Standard template DNA 유전자지도및 HTLV-2 gp5 tax 암호화부위

53 Primers 및 probe의선정 HTLV-2 바이러스를검출하기위한 HTLV-2 특이적인프라이머를 gp5 tax 암호화부위중선정하여 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database로분석하였다. Real time PCR에적용될 primers 는타겟인 HTLV-2 proviral DNA (pcdna3.1-htlv2) 를주형으로 gradient PCR법을통해선정하였다. 아래그림은선정된프라이머의 PCR 증폭효율성을보여주고있다. 아래왼쪽그림에서처럼 HTLV-2 proviral DNA를주형으로 PCR을수행하였을때, 55 ~ 65.8 전범위에서효율적으로타겟부위가증폭됨을확인할수있었고, 검체인 HEK 293 genomic DNA (0.5 μg) 를사용하였을때는 55 이상에서비특이적인 PCR 산물을거의관찰할수없었다. 타겟부위내부에서 probe를제작하여 real time PCR에적용하였다. 그림 31. 선정된프라이머의 HTLV-2 proviral DNA (pcdna3.1-htlv2) 증폭효율성 HTLV-2 시험법밸리데이션 pcdna3.1-htlv2 를주형으로, 2반복독립적인 3회를통해직선성에대한시험법을검증하였다. pgem-t-hiv-1 의 10 1 ~ 10 7 copies 를사용하였으며, 직선성이관찰되는구간은 10 2 ~ 10 7 copies 였다

54 그림 32. HTLV-2 proviral DNA (pcdna 3.1-HTLV2) 의직선성 A: 1 차시험, B: 2 차시험, C: 3 차시험 다음으로특이성 (specificity) 에대한밸리데이션을위해각시험군당 8 replica, 그리고 3회의독립적인시험을진행하여검증하였다. 검체 alone (293 genomic DNA, 0.5 μg) 과 spiked control ( 검체 293 genomic DNA 0.5 μg + pcdna3.1-htlv2, 100 copies) 을비교하여저해효과를관찰하였다. 뚜렷한저해효과는관찰되지않았으며, 본시험법검증파라미터에대한상세한내용은아래그림 33과같다. 즉, LOQ는 standard curve의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD 는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive 로증폭되는최소농도로결정하였으며, HTLV-2 검출법의 LOD는 100 copies 이며, 이때 C T 값은 ± 0.81 으로측정되었다 ( 그림 33 참조 )

55 그림 33. HTLV-2 시험법밸리데이션결과

56 3 Real-time PCR assay for the detection of Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) in biological samples HIV-1 개요 Human immunodeficiency virus (HIV) 는바이러스분류상레트로바이러스 (Retrovirus) 과 ( 科 ) 에속하며 HIV-1과 HIV-2로구분된다. HIV-1은침팬지의 SIVcpz에서기원되었고 HIV-2보다감염력과독성이강하여매우널리퍼져있다. HIV-2는푸른원숭이에게서기원하여아프리카일부지역에주로분포한다. 특히 HIV-1은 A, B, C형등총 9가지의유형으로존재하며 2001 년 2월 10번째새로운유형이발견되었으나 A형과 B형에비해각각 16% 와 20% 이상다른것으로확인되어져 HIV-1 유형의바이러스가아닌신종바이러스로등록되기도하였다. 이처럼변이가많이생기는이유는 HIV Virus가 RNA 바이러스이고 HIV capsid내부에존재하는 proofreading 기능이없는 reverse transcriptase 때문이다. 그림 34. HIV-1 의구조 HIV의구조는그림 34와같이가장안쪽부터 RNA, Capsid, Matrix, Lipid membrane 으로구성되어져있으며매우단순한형태를가진다. 숙주세포내부로 RNA가삽입되면역전사효소에의해 cdna가합성되고, 숙주내의 DNA에삽입되어단백질을생성한다. 생성된단백질은면역세포인 CD4 양성을가진 T세포를파괴하며, 그결과면역력이떨어져여러가지다른질병에걸릴가능성이높아진다. 결국에는이차적으로발생한질병에의해사망에이르게된다. HIV-1 Standard template DNA 제작 HIV-1 바이러스의 capsid 단백질을암호화하는 gag 유전자는바이러스특이적인부분으로 capsid 단백질의구조적인역할을하며 HIV-1 virion 의 core 를형성하는것으로알려져있다

57 HIV-1 특이적인 gag 유전자부분을 PCR 방법으로증폭한후 pgem-t easy vector 에삽입하여 pgem-t-hiv-1 을제작하였고, Standard template DNA (Reference DNA) 및 spiked control 으 로사용하였다. 그림 35. HIV-1의유전체구조및 pgem-t-hiv-1의지도위쪽그림은 HIV-1의유전체구조이며, 붉은박스영역은 gag 유전자의일부를나타내고있다. gag 유전자의일부는 PCR로증폭되어아래그림처럼 pgem -T Easy vector (pgem-t-hiv-1) 에클로닝되었다. Real-time PCR primer 및 probe 디자인 HIV-1 유전체증폭에특이적인우수한프라이머를선택하기위해 gag 유전자내부의가장특이적인부분을선별하여 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database 로분석하였다. 이러한프라이머및 probe 를선정한부분을 HIV-1 proviral DNA (pgem-t-hiv-1) 인 Standard template DNA가포함하고있다. Standard curve 설정및 Sample suitability 검체는아데노바이러스생산세포주인 293 cells 인데숙주세포의 cellular genomic DNA 를순수하 게분리하여 Standard template DNA 와함께 PCR 반응을진행할때검체에의한저해효과가없

58 는 HIV-1 바이러스특이적인증폭만을하는최적의 PCR 조건을연구하였다. 아래왼쪽그림에서처럼 pgem-t-hiv-1 을주형으로 PCR을수행하였을때, 55 ~ 65.8 전범위에서효율적으로타겟부위가증폭됨을확인할수있었고, 검체인 HEK 293 genomic DNA (0.5 μg) 를사용하였을때는 55 이상에서비특이적인 PCR 산물을거의관찰할수없었다. 그림 36. 선정된프라이머의 HIV-1 proviral DNA 증폭효율성특이적인 PCR반응조건을선정하기위해서는 gradient PCR방법을통해최적의 annealing조건을분석하였다. PCR 주형으로는 0.5 µg의 293 genomic DNA (HIV-1 negative) 또는 pgem-hiv-1 (10ng) 을사용하였으며, annealing 온도범위는 55 ~ 65.8 C 이다. 한편, 선정된프라이머의증폭부위내부에위치하는 probe 를설정하고, PCR의조건을최적화하기위해프라이머와 probe 농도의최적화를진행하였다. 프라이머농도최적화를위하여아래표에서처럼, 각각의 forward 와 reverse primer 를 900 nm, 300 nm, 50 nm을조합하여 real time PCR을수행하였을때, forward primer 50 nm/reverse primer 900 nm이가장낮은 Ct 값을나타내었다. 표. 프라이머농도에따른 PCR 효율성 ( 단위 : Ct) Forward Reverse 900 nm 300 nm 50 nm 900 nm nm nm 아래표는 forward primer 50 nm/reverse primer 900 nm 을사용하여, 여러 probe 농도를사용하 여가장낮은 Ct 값을선정하였다. Probe 는 300 nm 에서가장낮은 Ct 값을보였다

59 표. Probe 농도에따른 PCR 효율성 Probe 농도 300 nm 250 nm 200 nm 150 nm 100 nm 50 nm Ct 선정된 primer 농도 (forward primer 50 nm/reverse primer 900 nm) 와 probe 농도 (300 nm) 의 조건을이용하여직선성 (linearity), 검출한계 (detection limit), 특이성 (specificity) 에대한시험 법밸리데이션을진행하였다. HIV-1 시험법밸리데이션 pgem-t-hiv-1 을주형으로, 2반복독립적인 3회를통해직선성에대한시험법을검증하였 다. pgem-t-hiv-1 의 10 1 ~ 10 7 copies 를사용하였으며, 직선성이관찰되는구간은 10 2 ~ 10 7 copies 였다. 그림 37. HIV-1 proviral DNA (pgem-t-hiv-1) 의직선성 A: 1 차시험, B: 2 차시험, C: 3 차시험

60 다음으로특이성 (specificity) 에대한밸리데이션을위해각시험군당 8 replica, 그리고독립적인 3회반복시험을진행하였다. 검체 alone (293 genomic DNA, 0.5 μg) 과 spiked control ( 검체 + pgem-t-hiv 또는 10 3 분자 ) 을비교하여저해효과를비교하였을때, spiked control (100 copies) 에서는저해효과가강해검출이잘되지않았다. spiked control (1,000 copies) 에서는약간의저해효과가관찰되어 HIV-1검출은 1,000 copies 를정량한계와검출한계로설정하였다. 이러한검증결과는아래그림에서정리하였다. 즉, LOQ는 standard curve의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive 로증폭되는최소농도로결정하였으며, HIV-1 검출법의 LOD는 1,000 copies 이며, 이때 C T 값은 ± 0.88 으로측정되었다 ( 그림 38 참조 ). 그림 38. HIV-1 시험법밸리데이션결과

61 4 Real-time PCR assay for the detection of Human Immunodeficiency Virus-2 (HIV-2) in biological samples HIV-2 개요 Human immunodeficiency virus (HIV) 는바이러스분류상레트로바이러스 (Retrovirus) 과 ( 科 ) 에속하며 HIV-1과 HIV-2로구분된다. HIV는주로 Helper T lymphocytes (T-cell, CD4 + ), Macrophage, denritic cells 등면역세포들을감염시키고, HIV에감염되면 CD4 + 를가진 T lymphocytes 가급격히감소하면서우선 Cellular immunity가상실되어 AIDS로진행된다. HIV-1은침팬지의 SIVcpz에서기원되었고 HIV-2보다감염력과독성이강하여매우널리퍼져있다. HIV-2는푸른원숭이에게서기원하여아프리카일부지역에주로분포한다. HIV는 single strand RNA virus 인데, 세포에감염되면바이러스입자가가지고있는 reverse transcriptase 에의해 DNA가생성되고이렇게생성된바이러스 DNA는 integrase 를암호화하여바이러스유전체를숙주세포염색체에삽입시킨다. 삽입된바이러스유전체에서새로운바이러스가생산된다. HIV-1은 A, B, C형등총 9가지의유형으로존재하며 2001 년 2월 10번째새로운유형이발견되었으나 A형과 B형에비해각각 16% 와 20% 이상다른것으로확인되고, HIV-1 유형의바이러스가아닌신종바이러스로등록되기도하였다. 이처럼변이가많이생기는이유는 HIV Virus가 RNA 바이러스이기때문인데이는내부에존재하는 reverse transcriptase 에의해숙주세포에서 cdna를합성되는데이때 proofreading 기능을가지고있지않아수많은변이가만들어진다. 그림 39. HIV 의구조

62 HIV-2 Standard template DNA 제작 HIV-2의검출을위해 HIV-1에는존재하지않는 vpx 유전자를암호화하는부위중 300-bp 를합성하여 pgem-t easy vector 에삽입하였다. 그결과 pgem-t-hiv-2 vector 를만들었으며, 이를 HIV-2 검출에필요한 Standard template DNA (Reference DNA) 및양성대조군으로사용하였다. ( 아래그림 40 참조 ) 그림 40. HIV-2 의유전체지도및 pgem-t-hiv-2 의지도 HIV-2 에는 HIV-1 에존재하지않는붉은색박스의 vpx 유전자의일부를합성하여 pgem-t Easy vector 에클로닝하여 pgem-t-hiv-2 를제작하였다. Real-time PCR primer 및 probe 디자인 HIV-2 유전체증폭에특이적인우수한프라이머를선택하기위해 HIV-1에는존재하지않는가장특이적인부분인 vpx 유전자를선별하여 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database 로분석하였다. 또한 Real-time PCR을이용하였을때 HIV-2만을검출가능하도록특이성을높이기위해 5' -말단과 3 - 말단에각각 FAM과 TAMRA가붙어있는 probe 를제작하여사용하였다. probe 의염기서열은 5' -[FAM]-AAA CGA GGA GGC AGT GAA CCA TCT-[TAMRA]-3' 이며 BLAST search homology database 로분석을통해 HIV-2 유전자의 vpx 유전자영역에만반응하는것을확인하였다

63 Standard curve 설정및 Sample suitability HIV-2의 Standard template DNA ( 양성대조군 ) 인 pgem-t-hiv-2 (total 3,315-bp) 를이용하여 serial dilution 하여 1 X 10 2 ~ 1 X 10 8 copies 까지주형 template 를준비하였고, Standard curve를 3회에걸쳐반복시험을수행하여 100 copies 까지검출가능한것으로확인되었다 ( 아래그림 41 참조 ). 또한 Standard template DNA (reference DNA) 100 copies 에검체인 HEK293 cellular genomic DNA 0.5 μg을혼합하여 PCR 반응에의 interference ( 저해효과, 간섭효과 ) 여부를분석하는과정으로 Sample suitability를확인하였다 ( 아래그림 42 참조 ). 그림 41. HIV-2 의 Standard curve optimization

64 그림 42. HIV-2 Sample suitability HIV-2 시험법밸리데이션 Method optimization & Sample suitability을통하여 HIV-2 검출법을최적화하였다. 이를바탕으로시험법밸리데이션을위해각시험군당 8 replica 조건으로시험을실시하였고, 독립적인 3회반복시험을통해시험법을밸리데이션하였다. Spiking control 시험군, 즉아데노바이러스생산세포주 MCB의 cellular genomic DNA 0.5 μg에 HIV-2 Standard template DNA (pgem-t-hiv-2) 100 copies 를혼합하여 qreal-time PCR을수행하였다. 총 24회반복실험을통해얻은 data 값을이용하여통계분석하여검출한계 (Detection Limit), 직선성 (Linearity), 특이성 (Specificity), 95% positive cut off 등을검증하였다. LOQ는 standard curve의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive 로증폭되는최소농도로결정하였으며, HIV-2 검출법의 LOD는 100 copies 이며, 이때 C T 값은 ± 1.65 으로측정되었다 ( 그림 43 참조 )

65 그림 43. HIV-2 시험법밸리데이션결과

66 5 Real-time PCR assay for the detection of Hepatitis A Virus (HAV) in biological samples HAV 개요 A형간염바이러스 (hepatitis A virus, HAV) 는 Picornaviridae 과, Hepatovirus 속에있는 non-enveloped 단일쇠사슬모양의 RNA 바이러스 (ssrna) 이며, 기존의 B형간염이나 C형간염과는달리바이러스에오염된음식이나물을섭취함으로써전염되는 A형간염을일으키는바이러스다. HAV는한가지혈청형만존재하고, 캡시드유전자부위가특징적인구성으로되어있는데 antigenic variability 가낮은코돈들로구성된 conserved clusters 로이루어져있다는것이다. 질병관리본부에따르면, 2007 년 A형간염환자수는 2,233 명이었으나, 2008 년에 7,895 명으로세배이상증가하였으며, 2009 년에는 5 월 26 일까지 5,202 명발생하여작년같은기 간 (1,990 명 ) 보다 2.6 배나증가되었다. 개인위생관리가좋지못한저개발국가에서많이발병한다는 A형간염은위생수준이열악했던 60~70 년대에는소아기감염으로자연면역이형성되어대부분의성인은 HAV에대한면역력을가지고있어발생빈도가매우낮았다. 그러나사회경제적위생수준의향상으로소아기감염은현저하게줄어들었고, 오히려최근 10년간 대성인층에서발병률이급증하는양상을보였다. 국내한보고에의하면연령별로 20대와 30대가 85% 를차지하고 ( 평균 29세 ), 20세이하는 10% 였다. 이는 "20~30 대가깨끗한위생환경에서자란탓에 A형간염항체를보유하지못하여면역력이현저히떨어진다 " 는 ' 부유 ( 富裕 ) 의역설 ' 로설명하고있다. HAV에감염된환자와접촉한경우에감염될수있는데, 직접적인원인은아니지만 A형간염을가지고있는모체가출산하는과정에서태아에게전염시킬수있고, 수혈이나동성애자등에서비경구적인감염으로도전파될수도있다. 그림 44. Hepatitis A Virus 의구조

67 전신증상이나타난후일주일이내에황달이나타나는특징적인임상양상을통해 A형간염을의심할수있고, A형간염항체검사를통해확진할수있다. 항A형간염바이러스 (anti-hav) 항체검사를통해 A형간염을진단할수있는데, 시간과비용이많이소모되는단점을가진다. 이러한단점을해소하고감염초기부터빠르고저렴한비용으로 Hepatitis A Virus를검출하기위해 Real-time PCR을이용한검출방법을연구하게되었다. Hepatitis A Virus Standard template DNA 제작 Hepatitis A Virus의검출을위해 HAV gp2 polyprotein b 유전자를암호화하는부위중에서특이적으로존재하는 657-bp 을선별하여합성한후 pgem-t easy vector 에삽입하였으며, 그결과 pgem-t-hav vector (3,672-bp) 를만들었다. 이를 Hepatitis A Virus 검출에필요한 Standard template DNA (Reference DNA) 및양성대조군으로사용하였다. 그림 45. A. Hepatitis A Virus 의유전적구조. B. pgem-t-ha C 유전자지도

68 Real-time PCR primer 및 probe 디자인 HAV 유전체증폭에특이적인우수한프라이머를선택하기위해변형이적으며가장특이적인부분으로생각되는 polyprotein b유전자의일부분을선별하여 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database 로분석하였다. 또한 Real-time PCR을이용하였을때 HAV만을검출가능하도록특이성을높이기위해 5' 말단과 3 말단에각각 FAM과 TAMRA가붙어있는 probe 를제작하여사용하였다. probe 의염기서열은 5' -[FAM]-TGA GGG CCC ACT AAA GAT GGA AGA GA-[TAMRA]-3' 이며 BLAST search homology database 로분석을통해 Hepatitis A Virus 유전자의 polyprotein b 영역에만반응하는것을확인하였다. Standard curve 설정및 Sample suitability Hepatitis A Virus의정량적인 Real-time PCR검출법을확립하기위해우선 Standard curve를앞서제작한 pgem-t-hav 양성대조군 Standard template DNA를이용하여수행하였다. HAV 유전체중에서특이적인 npolyprotein b 유전자의일부 (657-bp) 를포함하는 pgem-t-hav 플라스미드크기가 3,672-bp 이므로아보가드로의법칙에의한분자수를계산하여, serial dilution 을 1 x 10 2 ~ 1 x 10 8 copies 까지주형 template 로사용하였다. 3번의반복시험을통해유사한결과값이나오는지확인하였으며이를통해 100 copies 까지검출가능한것으로확인되었다 ( 그림 46 참조 ). 또한 reference DNA 100 copies 에 HEK293 cellular genomic DNA 0.5 μg을혼합하여 PCR 반응간의 interference 와 Sample suitability 를확인하였다. 그결과 Real-time PCR 반응이상없이이루어지는것을확인하였다 ( 그림 47 참조 )

69 그림 46. Hepatitis A Virus Standard curve optimization

70 그림 47. Hepatitis A Virus Sample suitability. Hepatitis A Virus 시험법밸리데이션 Method optimization & Sample suitability 을통하여 Hepatitis A Virus 검출법을최적화하 였다. 이를바탕으로시험법밸리데이션을수행하였는데, 8 replica/ 시험군조건으로검출법을실시하였고, 동일한실험을 3회독립적으로희석에서부터전과정을실시하여개발한시험법의 Detection Limit, Specificity, Precision 으로 95% positive cut-off 평가를하였다. qrt-pcr 은실제세포가 virus에감염된경우와비슷한환경을만들어주기위해 cellular genomic DNA 0.5 μg에 HAV Reference DNA 100 copies 와섞어 Real-time PCR을수행하 였다. 총 24 회반복실험을통해얻은 data 값을이용하여통계분석하여검출한계 (Detection Limit), 직선성 (Linearity), 특이성 (Specificity), 95% positive cut off등을검증하였다. LOQ는 standard curve의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive 로증폭되는최소농도로결정하였으며, HAV 검출법의 LOD는 100 copies 이며, 이때 C T 값은 ± 2.44 으로측정되었다 ( 그림 48 참조 )

71 그림 48. Hepatitis A Virus 시험법밸리데이션결과

72 6 Real-time PCR assay for the detection of Hepatitis B Virus (HBV) in biological samples HBV 개요 B형간염의원인이고 cirrhosis 와간암으로발전가능한질병의원인인 Hepatitis B virus (HBV) 는 H epadnaviridae family에속하는 Orthohepadnavirus genes 에속하는 dsdna 바이러스종이다. HBV는아래그림과같은유전체구조를가지며, 직경 42 nm 정도크기의 enveloped animal virus이고바이러스입자는 lipid envelope 와 icosahedral nucleocapsid 를갖는구조를갖는다 년미국의 S. 블럼버그가오스트레일리아원주민의혈청에서발견하여당초에는항원성이있는물질이라고보고, HB항원또는오스트레일리아항원이라고불렀다. 그후의학기술이발달됨에따라 DNA형바이러스로간세포내에서자기증식한다는사실이확인되었다. HBV의감염의대부분은불현성감염이지만, 일부는초기감염후 45 ~ 180 일의잠복기를거쳐황달, 전신권태, 구토, 간기능장애등급성간염의증상을보인다. 만성화되는일은거의없으며예후가일반적으로좋다. 면역능이충분하지않은신생아나유아 (3세이하), 면역부전환자의경우는지속감염을일으키고, HBV 운반체가된다. 대부분은무증후성이지만, 그중에서만성간염이나간경변으로이행하거나원발성간암을일으키는경우가있다. 감염상태나병기진단에는혈청내의 HBV 항원 항체를조사한다. HBs 항원양성, HBc항체의고항체값은감염을의미하고, 특히 HBe항원양성에서는감염성이강하고, HBe항체가양성이면감염성은저하한다. 바이러스는혈액, 침, 정액등에포함되어있고이들이경피혹은경점막적으로체내에들어가면감염이성립된다. 또한대부분의 HBV 감염은서양인보다는아시아 아프리카인에게많이발생되며, 가장흔하게발병되는질병으로빠르고정확한진단이중요하며, 본실험을통해약 100 copies 까지검출민감도를가질수있도록연구하였다

73 그림 49. Hepatitis B Virus (HBV) 의구조 Hepatitis B Virus 양성대조군 Standard template DNA Hepatitis B Virus의검출을위해 ATCC에서판매되는 pam6 (catalog No D) 를구입하여 Standard template DNA (Reference DNA) 및양성대조군으로사용하였다. pam6는 Hepatitis B Virus genome 전체가 pbr322 vector 내에삽입되어있는형태이며 total 7,563-bp 크기를가진다. Real-time PCR primer 및 probe 디자인 HBV 유전체증폭에특이적인우수한프라이머를선택하기위해변형이적으며가장특이적인부분으로생각되는 HBV gp4 core protein 유전자의일부분을선별하여 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database로분석하였다. 또한 Real-time PCR을이용하였을때 HAV만을검출가능하도록특이성을높이기위해 5' 말단과 3 말단에각각 FAM과 TAMRA가붙어있는 probe 를제작하여사용하였다. probe 의염기서열은 5' -[FAM]-AAC TAC TGT TGT TAG ACG ACG GGA CCG A-[TAMRA]-3' 이며 BLAST search homology database로분석을통해 Hepatitis B Virus 유전자의 core protein 영역에만반응하는것을확인하였다

74 Standard curve 설정및 Sample suitability Hepatitis B Virus 검출법을확립하기위해우선 Standard template DNA인 pam6로 serial dilution 을통해하여 1 x 10 2 ~ 1 x 10 8 copies 까지주형 template 로사용하였다. 3번의반복시험을통해유사한결과값이나오는지확인하였으며이를통해 100 copies 까지검출가능한것으로확인되었다 ( 그림 50). 또한검체인아데노바이러스생산세포주 cellular genomic DNA의저해효과가없음을확인하기위해 reference DNA 100 copies 에 HEK293 cellular genomic DNA 0.5 μg을혼합하여 PCR 반응간의 interference 와 Sample suitability를확인하였다. 그결과 HBV 오염검출방법인 qrt PCR 방법이바이러스특이적으로매우민감도높게그리고반복성있게수행됨을확인하였다 ( 그림 51). 그림 50. Hepatitis B Virus Standard curve optimization

75 그림 51. Hepatitis B Virus Sample suitability Hepatitis B Virus 시험법밸리데이션 Method optimization & Sample suitability을통하여 Hepatitis B Virus 검출법을최적화하였다. 이를바탕으로시험법밸리데이션을수행하였으며, 8 replica/ 시험군조건으로검출법을수행하였고, 이러한동일한조건의실험을 3회독립적으로실시하여시험법을검증하였다. Real-time PCR은실제세포가 virus에감염된경우와비슷한환경을만들어주기위해아데노바이러스생산세포주 cellular genomic DNA 0.5 μg에 HBV Reference DNA 100 copies 와혼합하여 Real-time PCR을수행하였다. 총 24회반복실험을통해얻은 data 값을이용하여통계분석하여검출한계 (Detection Limit), 직선성 (Linearity), 특이성 (Specificity), 95% positive cut-off 등을검증하였다. LOQ는 standard curve의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive로증폭되는최소농도로결정하였으며, HBV 검출법의 LOD는 100 copies 이며, 이때 C T 값은 ± 0.80 으로측정되었다 ( 그림 52 참조 )

76 그림 52. Hepatitis B Virus 시험법밸리데이션결과

77 7 Real-time PCR assay for the detection of Hepatitis C Virus (HCV) in biological samples HCV 개요 Hepatitis C virus는 Flaviviridae에속하며약 9.5kb 사이즈의단일가닥 RNA를게놈으로가지는 single positive RNA virus이며크게 6개의 major genotype 과 50개이상의 subtype으로구분된다. 맨처음약 3,000 개의아미노산으로구성된하나의긴단백질이생성되고이어서, 3,000 개의단백질분해효소에의해 3개의 structural proteins 와 7개의 non-structural protein 으로나누어진다. 그림 53. Structure of Hepatitis C virus Hepatitis C virus는대개오염된혈액제제나주사바늘등을통하여감염되며일단감염되면급성 C형간염이유발된후 20 ~ 40% 의환자는저절로회복하지만나머지 60 ~ 80% 환자는 HCV를체내에서완전히제거하지못하고만성 C형간염상태로이행된다. 만성C형간염상태가지속되면간경변증또는간암으로발전한다. 흔히국내의경우 HBV에대한감염은문제

78 가되지만아직 HCV에대해서는거의문제되지않고있는것으로오해하지만실제로 40세이상국민의약 1.3% 가 HCV에감염되어있다고보고된다. 이는결코다른나라들에비해감염율이낮다고볼수없는상황이다. Hepatitis C virus를검출하기위해서는우선 HCV 만이특이적으로가지고있는유전자부위를찾아야한다. HCV의경우 RNA 바이러스이므로상당히많은변이가일어나는특성을가지며그로인해특정영역을찾는작업에상당한시간이소요되었다. 이부분을찾기위해각종논문과 Biolience 사의데이터를검토하였으며, 그결과 282-bp 가크기의 5' UTR 영역이최종적으로선택되었다. 이부분은지금까지연구결과다른부위에비해변이가매우적게일어나기때문에여러 type의 HCV를한번에검출함에있어최적의위치로알려져있다. 그림 54. Hepatitis C virus 유전체지도및 pgem-t-hcv standard template DNA 유전자지도

79 Hepatitis C Virus Standard template DNA 제작 Hepatitis C Virus의검출을위해 5' UTR 유전자를암호화하는부위중에서특이적으로존재하는 180-bp 을따로선별하여합성하였다. 합성된 DNA는 pgem-t easy vector 에삽입하였으며, 그결과 pgem-t-hcv vector ( 크기 3,195-bp) 를만들었다. 이를 Hepatitis C Virus 검출에필요한 Standard template DNA (Reference DNA) 및양성대조군으로사용하였다 ( 그림 54). Real-time PCR primer 및 probe 디자인 Hepatitis C virus 유전체증폭에특이적인우수한프라이머를선택하기위해 5 UTR 영역을 선정하였으며, 그중에서도가장특이적이며변형이적은부분을선별하여 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database 로분석하였다. 또한 Real-time PCR을이용하였을때 HCV 만을검출가능하도록특이성을높이기위해 5' 말단과 3 말단에각각 FAM과 TAMRA가붙어있는 probe 를제작하여사용하였다. probe 의염기서열은 5' -[FAM]-GGG AGA GCC ATA GTG GTC TGC GGA A-[TAMRA]-3' 이며 BLAST search homology database 로분석을통해 HCV 유전자의 5' UTR 영역에만반응하는것을확인하였다. Standard curve 설정및 Sample suitability Hepatitis C Virus 오염여부를검출하기위해 qrt-pcr 방법을개발하였다. 우선적으로는 Standard curve를확인하고자앞서제작한 pgem-t-hcv Standard template DNA를이용하여 serial dilution 을 1 x 10 2 ~ 1 x 10 8 copies 까지실시하였고이들희석된주형 template 로 PCR 반응을수행하였다. 3번의반복시험을통해유사한결과값이나오는지확인하였으며이를통해 100 copies 까지검출가능한것으로확인되었다 ( 그림 55). 또한 Standard template DNA (reference DNA) 100 copies 에아데노바이러스생산세포주 cellular genomic DNA를검체로 0.5 μg을혼합하여 PCR 반응간의 interference 와 Sample suitability 를확인하였다. 그결과검체에의한저해효과없이 HCV 특이적으로 Real-time PCR 반응이수행되는것을확인하였다 ( 그림 56)

80 그림 55. Hepatitis C Virus Standard curve optimization 그림 56. Hepatitis C Virus Sample suitability

81 Hepatitis C Virus 시험법밸리데이션 Method optimization & Sample suitability을통하여 Hepatitis C Virus 검출법을최적화하였다. 이를바탕으로 8 replica/ 시험군조건으로 qrt-pcr 시험을수행하였으며, 이러한동일한시험을 3회독립적으로실시하여개발한시험법을밸리데이션하였다. Real-time PCR은실제세포가 virus에감염된경우와비슷한환경을만들어주기위해 cellular genomic DNA 0.5 μg에 HCV Reference DNA 100 copies 와섞어 Real-time PCR을수행하였다. 총 24회반복실험을통해얻은 data 값을이용하여통계분석하여검출한계 (Detection Limit), 직선성 (Linearity), 특이성 (Specificity), 95% positive cut-off 등을검증하였다. LOQ는 standard curve의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive 로증폭되는최소농도로결정하였으며, HCV 검출법의 LOD는 100 copies 이며, 이때 C T 값은 ± 1.25 로측정되었다 ( 그림 57 참조 ). 그림 57. Hepatitis C Virus 시험법밸리데이션결과

82 8 Real-time PCR assay for the detection of Simian Immunodeficiency Virus (SIV) in biological samples SIV 개요 Simian immunodeficiency virus (SIV) 는 Retroviridae 과, Lentivirus 속인단일가닥 RNA 바이러스이다 년미국에서처음으로보고가된이후 1985 년 SIV 바이러스가분리되었고 African Green Monkey 바이러스라고도불리우는데, 이바이러스는아프리카 33종의영장류에감염될수있으며, sooty mangabeys 에서분리된 SIVsmm과침팬지에서분리된 SIVcpz의두종의 SIV가인간에게도감염이가능할것으로간주되고그결과가 HIV-2와 HIV-1일것으로추측된다. HIV-1이인간에게감염된경로를추축할때아프리카에서침팬지사냥시침팬지혈액으로부터가아닌가추측하고있다. HIV-1 및 HIV-2와는달리 SIV가자연적인숙주에감염되었을때는비병원성인경우가많다. 즉, SIVsmm 경우다양한동물에감염되었을때순환되는바이러스양은많았지만비병원성이었다. 반면, 이바이러스가 Asian or Indian rhesus macaque 에게감염되면 simian AIDS (SAIDS) 병증으로진행되었다. SIVcpz 경우도 SIVcpz에감염된침팬지가 AIDS 유사병증마치인간이 HIV-1에감염되었을때보이는병증과유사한병증을보였다. 따라서 SIV 감염의 later stage에 SAIDS가진행되는것이 HIV 감염후 AIDS로진행되는것과매우유사하다. 이러한위험성때문에, 세포기질과세포기질을사용하여생산되는백신또는생물학적제제는 SIV에감염이되어있지않는것을검증하는시험법개발이필요하고본사업에서는 qrt-pcr 방법을기반으로하는검출법을개발하고자하였다 (Guidance for industry; characterization and qualification of cell substrates and other biological materials used in the production of viral vaccines for infectious disease indications, 2010). SIV Standard template DNA 의제작 아래그림의 SIV 의 genome 에암호화되어있는유전자중 gag-pol 유전자는가장돌연변이가적 고, conserved 된영역이다. 그림 58. SIV 의 proviral DNA 구조 Gag, Pol, Vif, Env 영역이 SIV strains 중가장돌연변이가적은영역이다

83 SIV 의검출을용이하게하기위해 gag-pol 유전자의일부영역을아래그림 59 처럼합성하여 pgem-t Easy vector 에클로닝하여 SIV 검출을위한주형으로사용하였다. 그림 59. SIV 의유전체지도와 pgem-t-siv Standard template DNA 유전자지도 Real-time PCR primer 및 probe 디자인 SIV proviral DNA의증폭을위해 BLAST 프로그램을이용하여, 검체인동물세포와의유사성을비교하여 gag-pol 영역에만특이적인프라이머를 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database로재분석하였다. 가장효율적인프라이머를선택하기위해 real time PCR에적용전시료증폭에대한효율성을우선확인하였다. 네종류의프라이머를조합하여 (F1/R1, F1/R2, F2/R1, F2/R2) 사용하였을때, F2/R1이검체인 HEK293 genomic DNA (0.5 μg) 를사용하였을때, 약 60 이상에서비특이적인 PCR 반응이관

84 찰되지않았으며, pgem-t-siv 에서는 50 ~ 68.5 전범위에서모두 PCR 이잘이루어지는것 을관찰하였다. Standard curve 설정및 Sample suitability 검체로사용되는 293 세포의 genomic DNA로인해 PCR primers 는 SIV 특이적인증폭뿐아니라, 293 세포 genomic DNA 와의비특이적인증폭도가능하므로, PCR반응에검체가포함되어도 SIV 특이적인증폭만하는프라이머쌍과반응조건을선정하는것이필요하다. 따라서이러한최적프라이머쌍은최적의 PCR 반응조건에서검체인 293 genomic DNA (SIV negative) 만포함된 PCR 반응에서는비특이적인반응이일어나지않아야하며, 양성대조군인 pgem-t-siv 이포함된 PCR반응에서는 SIV 특이적인증폭만일어나야한다. 특이적인 PCR 반응조건을선정하기위해서는 gradient PCR방법을통해최적의 annealing 조건을분석하였다. PCR 주형으로는 0.5 µg의 293 genomic DNA (SIV negative) 또는 pgem-t-siv 10 ng을사용하였으며, 특이적인 PCR반응조건을선정하기위해서는 gradient PCR방법을통해최적의 annealing조건을분석하였다. PCR 주형으로는 0.5 μg의 293 genomic DNA (SIV negative) 또는 pgem-t-siv 10 ng을사용하였으며, annealing 온도범위는 55~66 C 이다. 그림 60. SIV의 proviral DNA 의최적 annealing 온도의설정왼쪽패널의사진은 HEK293 genomic DNA (0.5 μg) 을주형으로사용하였으며, 오른쪽패널은 pgem -T-SIV (10 ng) 을주형으로사용하였다. HEK293 genomic DNA 는약 60 C 이상에서비특이적인 DNA 증폭이관찰되지않았으며, pge-t-siv는 55 ~ 65.8 C까지의범위에서고른 PCR 증폭효율을나타내었다

85 primer 별 PCR 반응재확인 ( 그림 61) 그림 61. SIV의 PCR 검출조건재확인특이적인 PCR반응조건을선정하기위해서는 PCR방법을통해 Taqman Universial PCR Master M ix(a pplied Biosystems, ) 를사용하므로 annealing 조건인 60 를재분석하였다. PCR 주형으로는 0.5 µg의 293 genomic DNA (SIV negative) 또는 pgem-siv (10ng) 을사용하였다. (B : blank, G : 293 genomic DNA, p : pgem-siv 10ng) SIV 시험법밸리데이션 SIV proviral DNA의 F2/R1 증폭영역에 probe 를제작하여, gel-based 로최적화한방법을 real time PCR법에적용하였다. 먼저직선성 (linearity) 을확립하기위해 pgem-t-siv 를 10 ~ 10 7 copies 로 real time PCR을독립적인 3회시험을수행하였을때 background (genomic DNA alone) 보다 Ct 값이 3배이상인범위인 100 copies 부터검출이가능하였다. R 2 는 로세계적인 CRO 업체의허용기준인 0.90 이상의값을만족하였다. Background level (genomic DNA alone) 은 Ct값이약 38이며, 이에해당하는정량값은약 14 copies 였다. 100 copies 를정량한계 (quantitation limit) 으로하여, 24회반복 (3번의독립적인시험 ) 을수행하였을때, 100% 모두검출되어 95% positive cut off value를 100 copies 로설정하였다. 시험법밸리데이션결과 SIV proviral DNA를주형으로 10 2 ~ 10 7 copies 까지범위에서직선성을검증할수있었다 ( 그림 62 및그림 63 참조 ). 즉, LOQ는 standard curve의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive 로증폭되는최소농도로결정하였으며, SIV 검출법의 LOD는 100 copies 이며, 이때 C T 값이 ± 1.44 로측정되었다 ( 그림 63 참조 )

86 그림 62. SIV 의시험법밸리데이션결과 음성대조군은 0.5 µg 의 293 genomic DNA (293 gdna) 를사용하였으며, 양성대조군으로 pgem-siv 분자를 10, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6, 10 7 개를사용하여 standard 로이용하였고, spiked control ( 검체 + 양성대조군 10, 10 2, 10 3 분자 ), 음성대조군 (no template) 형태로특이적인 primers 와 probe 를이용하여 60 cycles 로 Real-time PCR 반응을 Taqman universal M aster Mix, with UNG (Applied Biosystems) 로 detection 하였다

87 그림 63. SIV 시험법밸리데이션결과직선성은 0.992로허용기준인 0.98이상이었으며, LOQ와 LOD는 100 copies였다. 검체단독에 pgem-t-siv의 100 copies를 spike하여특이성을관찰하였을때는 153 copies로측정치에서약간의증가를관찰할수있었다

88 9 Real-time PCR assay for the detection of Simian Spumavirus (Simian Foamy Virus) in biological samples Simian Spumavirus 개요레트로바이러스과에속하는바이러스군으로사람포말바이러스 (human foamy virus; HFV), 사람포말레트로바이러스 (human spuma retrovirus; HSRV) 등이여기에속한다. 포유동물의배양세포에액포를형성하는형태 ( 거품 을일으키는 foaming ) 에따라분리하는데병원성은없다. 유전체 RNA는 염기보다크고, gag, pro, pol, env 이외에 bel1, bel2, bel3, bet 유전자가있다. bel1 은사람 T 세포백혈병바이러스 (HTLV-1) 의 tax 유전자에해당하며전사의트랜스활성화능력이있다. 그림 64. Structure of Simian Spumavirus Simian Spumavirus 유전자합성및클로닝 Simian Spumavirus의검출을위해 gag 유전자를암호화하는부위중에서특이적으로존재하는 360-bp 을따로선별하여합성하였다. 합성된 DNA는 pgem-b1 vector 에삽입하였으며, 그결과 pgem-b1-spumavirus vector 를만들었다. 이를 Simian Spumavirus 검출에필요한 Standard template DNA (Reference DNA) 및양성대조군으로사용하였다 ( 그림 65)

89 그림 65. Specific region of Simian Spumavirus Real-time PCR primer 및 probe 디자인 Simian Spumavirus 유전체증폭에특이적인우수한프라이머를선택하기위해 gag 영역을 선정하였으며, 그중에서도가장특이적이며변형이적은부분을선별하여 표. 각바이러스오염분석검출용프라이머쌍및 Probe 의염기서열 (39 ~ 41 쪽 ) 에나온것과같이디자인하여제작하였고, 잠재적인 annealing 특이성을결정하기위해 BLAST search homology database 로분석하였다. 또한 Real-time PCR을이용하였을때 Simian Spumavirus만을검출가능하도록특이성을높이기위해 5' 말단과 3 말단에각각 FAM과 TAMRA가붙어있는 probe 를제작하여사용하였다. probe 의염기서열은 5' -[FAM]-AGG AAG AGG GAA TCA AAA CCG AA-[TAMRA]-3' 이며 BLAST search homology database 로분석을통해 Spumavirus 유전자의 gag 영역에만반응하는것을확인하였다. Standard curve 설정및 Sample suitability Spumavirus 검출법의 Standard template DNA ( 양성대조군, pgem-b1-spumavirus) 를이용하여 standard curve 시험을위해아보가드로의법칙에따라 serial dilution 하여 1 x 10 2 ~ 1 x 10 8 copies 까지주형 template 로준비하였다. 3번의반복시험을통해유사한결과값이나오는지확인하였으며이를통해 100 copies 까지검출가능한것으로아래그림 66과같이확인하였다. 또한 reference DNA 100 copies 에 HEK293 cellular genomic DNA 0.5 μg을혼합하여

90 검체에의한 PCR 반응에의저해효과가없는지확인하는 Sample suitability 를수행하였고, 그 결과아래그림 67 과같이 Real-time PCR 반응이상없이이루어지는것을확인하였다. 그림 66. Simian Spumavirus Standard curve optimization 총 24 replicates로 3회독립적인시험을수행하여 R 2 값이 0.983을확인하였으며, 세계적인 CRO 기관에서채택하고있는허용기준인 0.90이상이었음. A: 시험 1, B: 시험 2, C: 시험

91 그림 67. Sample Suitability ( 검체에의한저해효과 ) 검체인 HEK293 genomic DNA (0.5 μg) 단독또는 pgem -B1-Spuma를 spike하여저해효과를관찰하였다. Cq (Ct) 값이검체단독일때약 33이며, spike하였을때 34로약 2 1 정도의차이를보였으며, 이는 PCR 반응에서약 1 cycle의차이로 Spumavirus 검출에는큰영향을주지않았다. Simian Spumavirus 시험법밸리데이션 Simian Spumavirus 검출에대한직선성과검체의최적화를확인한후, 시험법밸리데이션 (8 반복, 독립적인 3회시험 ) 을수행하였다. Real-time PCR은실제세포가 virus에감염된경우와비슷한환경을만들어주기위해 cellular genomic DNA 0.5 μg에 SpumaVirus Reference DNA 100 copies 와섞어 Real-time PCR을수행하였다. 24회반복실험을통해얻은 data 값을이용하여통계분석하여검출한계 (Detection Limit), 직선성 (Linearity), 특이성 (Specificity), 95% positive cut-off 등을검증하였다. LOQ는 standard curve의최소측정값인 100 copies 로나타났다. LOD는모든반복된시험 (95 positive cut off, 24 replicates) 에서 positive 로증폭되는최소농도로결정하였으며, Simian Spumavirus 검출법의 LOD는 100 copies 이며, 이때 C T 값이 ± 0.66 로측정되었다 ( 그림 68 참조 )

92 그림 68. Simian Spumavirus 시험법밸리데이션결과

93 ( 나 ) Detection of Reverse Transcriptase Activity by FPERT Assay (Retrovirus 검출 ) FPERT 개요본연구에서는생물의약품의안전성평가를위한여러가지접근측면에서인체에대한위험가능성이높은레트로바이러스의검출방법을확립하고자하였다. 현재레트로바이러스오염에대한검출법으로 ICH Q5A(R1) 에서는 TEM, infectivity assay를제시하고있으며 ( 아래표참조 ), 최근여러종류의감염성및위험성높은바이러스들에대한오염분석방법개발로민감도가우수한 Real-time PCR방법이이용되는데, 레트로바이러스도역시 1999 년 Archie Lovatt et al., 연구팀 (Journal of Virological Methods, 82: ) 에의해 Real Time Fluorescent Product Enhanced Reverse Transcriptase (FPERT) 방법이개발되었다. 본사업에서는이전에발표되었던방법을참조하여더우수한 qrt-pcr 방법을개발하고자하였으며, 시험법밸리데이션과정을통해시험법검증과 SOP 확립을하고자하였다

94 Regulatory guidance 에서는 Retrovirus 입자에존재하는 reverse transcriptase (RT) 효소활성을이용하여레트로바이러스가오염된정도를분석하도록제시하고있으며, RT 효소는 RNA template 를 cdna로전환하는활성이있으므로이러한것을시험법개발에이용하였다. 이렇게개발되었던방법은시험법밸리데이션이매우중요한데특히, Lower Limit of Detection (LOD) 에대한검증을하도록 FDA 가이드라인에서는권장하고있다 (FDA Guidance for Industry. (2010) Characterization and qualification of cell substrates and other biological starting materials used in the production of viral vaccines for the prevention and treatment of infectious diseases by CBER/FDA; Letter to Viral Vaccine Product Manufacturers (1998) by CBER/FDA)

95 그림 69. FPERT 시험법개발의전략 PERT 시험법개발의기본적인전략은그림 69와같이형광 probe를포함하여 real-time PCR 방법에의해증폭된 PCR product 를검출할수있도록하는것이다. 즉, 형광 probe 인 oligonucleotide 가 5 -reporter dye 및 3 -quencher dye로구성되어있어서, PCR 반응이진행될때 Taq DNA polymerase 의 5 -exonuclease 효소활성이형광 probe 를절단하여제거하고, 이때형광 probe 가가지고있던 5 -fluorescent reporter dye가유리되면서 PCR product 가검출장치에의해검출되는것이다. 본시험법개발에는여러가지논문이참조되었는데아래와같다. - Journal of Virological Methods, 82: (1999) - Journal of Vitological Methods, 157: (2009) - Cancer Research, 63: (2003) - Cytotechnology, 38: (2002) - Biologicals, 28: (2000) PCR primer, probe 디자인레트로바이러스오염을특이적으로검출할수있는프라이머쌍은상기의여러가지논문을참조하여합성되었고, 각프라이머쌍의특이적인반응을분석한결과최적의프라이머쌍와 probe를아래표와같이선정하여시험법확립에이용하였다

96 Forward primer 표. Primer and Probe sequence 5'-TCC TGC TCA ACT TCC TGT CGA G-3' Reverse primer 5'-CAC AGG TCA AAC CGC CTA GGA ATG-3' Probe 5'-FAM-TCT TTA GCG AGA CGC TAC CAT GGCTA-TAMRA-3' Standard curve RT-PCR 반응 Reverse transcriptase (RT 효소 ) 의기질로는 MS2 RNA (Roche, ) 를이용하였고, RT 효소는 AMV RT (Promega, M5108) 를가지고 10배씩 serial dilution (10 10 pu pu) 한후, RT 반응에의해 cdna 합성이정량적으로진행되어 standard curve가확립되는지아래와같이진행하였다. RT reaction cocktail (MS2 RNA, DEPC H 2 0, 10 RT reaction buffer, 2.5 mm dntp, 0.2 M DTT, R primer, RNasin) 을각 tube에 15 μl씩분주하고, 미리준비한 AMV RT 효소를각 tube에 10 μl씩분주하여 37 에서 2시간동안반응시켜 cdna를합성하였다. 각 RT reaction cocktail과 RT 반응액조성은아래표와같다. 표. RT cocktail ( 단위, μl) DEPC H 2 O X RT buffer mm dntp 2 (200 μm) 0.1 M DTT 0.5 (2 mm) Reverse primer (0.13 μm) RNasin 0.2 (8 U) MS2 RNA (0.3 µg) Total 15.0 표. Reverse Transcriptase 반응 RT cocktail 15 μl 희석된 AMVRT 효소 10 μl Total 25 μl RT 반응은 37, 2시간반응 RT-PCR 반응은합성된 cdna 25 μl, Forward primer, Reverse primer, TaqMan master mix II (Applied Biosystems No ), Probe 를첨가한후 50 에서 2분반응을하였고, 95 에서 10분, 95 에서 15초, 60 에서 1분을 PCR cycle 조건으로하여 60 cycles 증폭하였고 PCR 반응혼합액의조성은아래표와같다

97 표. RT-PCR 반응 mixture ( 단위, μl) Template 25 Forward primer 0.5 (1µM) Reverse primer 0.5 (1 µm) Taqman Probe 0.15 (0.3 µm) TaqMan master mix 25 H 2 O 8.85 Total 60 PCR 반응의음성대조군 (NTC, 아래표 ) 으로 MS2 RNA template를포함하지않고진행한대조군이고, NRT 대조군은 AMV RT 효소를넣지않고 cdna를합성한대조군이며, Negative control 대조군은 RT-PCR 반응수행시 cdna를넣지않고수행한대조군으로아래결과에서와같이포함하였다. 아래그림은 Standard curve 4번반복시험중대표적인결과를아래그림 70에서제시하였다. 그림 70. 레트로바이러스검출을위한 Reverse Transcriptase-PCR Standard curve 시험결과 Negative control은 cdna template를포함하지않은 RT-PCR 반응대조군, NTC는 RT 반응시 MS2 RNA template를포함하지않은대조군, 그리고 NRT는 RT 반응시 RT 효소를넣지않은대조군

98 시험결과의반복성을확인하기위해 Standard curve 시험을 4 회반복하였고, R 2 > 0.90 인결 과를얻어반복성을확인하였다 ( 그림 71). 그림 71. FPERT 레트로바이러스검출법 Standard curve 의 4 반복시험결과정리 RT-PCR을이용한검체의레트로바이러스오염분석방법, FPERT 시험법개발레트로바이러스에존재하는 Reverse transcriptase 효소활성을이용하여오염을분석하는방법으로 AMV-RT 효소를가지고 RT-PCR 시험법을개발하여 standard curve를확립하였다. 그방법을기반으로아데노바이러스제조용생산세포주 MCB가레트로바이러스에오염되어있는지여부를아래와같이개발하였다. 이러한검체를분석하기위해서는 test article 인검체가 DNA polymerase 에오염되어있지않도록준비하는것이중요한데, 만일검체가 DNA polymerase 에오염되어있으며 RT-PCR 반응에영향을주어 false positive" 결과로나올수있으므로검체를 purify 하는과정이선행되어야한다. 검체를 purify 하는방법으로는원심분리방법을통해 11,000 g, 4 에서 10분간 centrifuge 한후상층액을 0.45 μm filter를통과시켜여과하는방법까지포함하며이러한과정으로오염원 DNA polymerase 를제거하였다. 한편, 검체로인한 RT-PCR 반응에간섭효과, 즉저해효과 (interference) 가있을수있으므로검체의적절한희석을통해저해효과가없는상태에서레트로바이러스오염여부를분석하도록준비하였다

99 본연구를위해검체로는아데노바이러스생산세포주 293F 의 MCB를분석하였고, 293F 세포주 MCBsms 2 x 10 6 cells 을접종한뒤총 4일배양하여 supernatant 배양액을회수하여검체처리과정 ( 원심분리방법 & 여과방법 ) 을통해준비하였고, 양성대조군으로는레트로바이러스생산세포주 K-Balb 세포 (ATCC, CCL-163.3) 를구입하여사용하였다. 음성대조군으로는 MS2 RNA template 를포함하지않는 NTC 대조군, RT 효소를포함하지않는 NRT 대조군, PCR 반응에 cdna template를포함하지않는 Negative control, 그리고세포주배양배지만을포함하는배양배지대조군을시험에포함하였다. 양성대조군으로는 K-Balb 세포배양액및 Spike positive control 을포함하였는데, 각검체에 AMV-RT 효수 pu를 spike 하는대조군이다. 양성대조군으로는 K-Balb 세포는접종후 24시간이경과하면 IDU (5-iodo-2-deoxyuridine; Sigma, I7125) 를배양액속에 20 μg/ml의농도로세포에처리하고, 첨가후 3일뒤에그 Supernatant 배양액을모아검체처리방법으로원심분리방법및여과법을통해 DNA polymerase 오염을제거한후레트로바이러스를 FPERT 시험법으로검출하였다. 이러한실험을 2회반복하여아래와같은결과그림으로정리하였다. 그림 72. FPERT 시험법을이용한검체의레트로바이러스오염여부분석결과 생산세포주의레트로바이러스오염여부를분석해본결과, 검체와배양배지는 1/10 희석하는것이저해효과가없었고, IDU를처리한 K-Balb 세포의배양액에서레트로바이러스의 RT-activity 가있는것을확인하였다. 또한 293F MCB 배양액과배양배지에서는레트로바이러스오염이없는것으로아래그림과같이평가되었다

100 그림 73. FPERT 시험법을이용한검체분석결과정리

101 ( 라 ) Detection of Adventitious Virus Contaminants by I n Vitro Tests I n Vitro A dventitious Virus 시험개요생물체에서기원한모든원료등을포함한물질들은세균, 바이러스, 마이코플라스마등 infectious agents 에감염되어있을수있다. 따라서, 생물의약품생산시스템에서사용하는생물유래세포기질 (Cell substrates) 들이미생물과바이러스같은오염인자에감염되어이들오염인자의증식을허용하기도하고, 일부동물세포는내인성레트로바이러스를증식시키기도한다. 이런오염된세포기질을사용하였을때, 사용목적에따라불활화또는정제과정을거쳐최종제품으로사용할수도있으며, 이에대한오염수준을설정하고적합한기준에맞게생산하여야한다. 따라서마스터세포은행 (MCB), 제조용세포은행 (WCB), 생산종결세포 (EOPC) 같은세포기질은각종외래성오염인자부정시험을수행하여서 infectious agents 에의한오염이없음을검증하는품질평가분석을실시하도록권고하고있다. 세포기질에존재할가능성이있는바이러스는세포기질이유래된종과조직, 병력, 배양중사용한원료물질 ( 혈청, 트립신, 동물 / 사람유래성분등 ) 에서유래할수있는바이러스, 작업자나다른세포배양액에의한오염등을고려하여야한다. 외래성바이러스에대한시험은체내시험 (in vivo test) 과체외시험 (in vitro test) 로나누며, 본과제에서는체외시험에대한적합성을평가하여표준화된방법을확립하고자하였다. 외래성바이러스 in vitro test 에대하여는국제가이드라인에서많이설명하고있는데, ICH Q5A 는인간유래바이러스에민감한 human cells 이나 non-human primate cells 을 indicator cell lines 으로사용할것을권고하고 CPE (Cytopathic effect) 와 Haemadsoption 과 Haemagglutination 으로분석할것을제시한다. 한편, FDA의 PTC (1993, 1997) 에서는최소 3 종의 cell lines ( 생산세포주, human diploid cells, monkey kidney cells 등 ) 을사용하도록권고하고있으며, in vitro assay 시작후최소 2주간세포를관찰하고, 관찰완료시 Haemadsoption 을실시하도록제시하였다. 또한 FDA의 PTC (1993) 에서강조하는것은만일생산세포주가 Human cytomegalovirus 에대한허용성이있으면, human diploid cells ( 주로 MRC5) 은최소 4주간관찰하여야한다고권고한다. 이러한권고기준에따라아래그림74와같은시험법개발전략을만들어시험법을확립하였다

102 그림 74. I n vitro adventitious virus assay 방법개발에대한전략 이러한외래성바이러스체외시험법은특정바이러스를검출하기보다는아래표와같이광범 위한범위의바이러스를검출하는시험법이다. 아래표는 생명공학의약품표준시험서 ( 박순 희저 ) 에서참고하였다. 표. In vitro 시험법에의해검출할수있는바이러스와검출용세포주 바이러스 Poliovirus Coxsackie A,B Echovirus Rhinovirus Parainfluenza Mumps Measles Herpesvirus Adenovirus Reovirus SV5 SV40 Sendai Vaccinia Cytomegalovirus 바이러스검출용세포주 Vero, MRC-5 Vero, Hela Vero, MRC-5 MRC-5 Vero, Hela, MDCK MRC-5 Vero, MRC-5 Vero, RK13 MRC-5 Vero, MRC-5 CHO Vero NIH 3T3 Vero, MRC-5 MRC

103 Arboviruses Rbella Bovine virus BHK RK BT 최소 3개세포유형의단층세포를사용하여야하며, 세포배양액의최소 80% 가관찰기간말기에바이러스오염이관찰되지않을경우에적합으로판단한다. 관찰기간의말기에는혈구흡착및혈구응집반응을통해혈구흡착바이러스 (haemadsorbing virus) 부정시험을실시하여야한다. 외래성바이러스검출에는 1) 생산에사용된종및조직의단층배양, 2) 사람이배체세포의단층배양, 3) 원숭이신장세포의단층배양된세포를사용한다. 시험방법외래성바이러스검출에사용된세포는 1) 생물의약품중아데노바이러스생산에사용된 HEK293 세포 (SCT, Pre MCB), 2) 사람이배체세포인 MRC-5 (ATCC, CCL-171), 3) 원숭이신장세포인 Vero (ATCC, CCL-81) 를사용하였으며, 10% FBS와 penicillin (100 units/ml), streptomycin (100 μg/ml) 을포함하는 EMEM (Eagle' s Minimal Essential Medium) 을사용하여배양하였다. CPE 시험을위해서, 각세포에대한양성대조군바이러스를구매하였는데, Parainfluenza virus type 3 (ATCC, VR-93), Measles (ATCC, VR-24), Poliovirus-2 (ATCC, VR-301) 등세종류이다. 바이러스감염전날 2 x 10 5 cells/plate 로 seeding 하였으며, plate당 10 TCID 50, 1 TCID 50, 0.1 TCID 50 로감염하였다. 검체는세포은행제조에사용된 HEK293 Pre MCB로 1 x 10 7 cells 로증식시킨다음, 원심분리한상층액 5 ml에포함된세포를 3번의 freeze/thaw 과정을거친후 cell lysate를검체로사용하였다. 검체또는대조군은 well 당 0.5 ml을접종하고, 10분간격으로 plate를잘 swirling 하여감염이잘되도록하였으며, 감염 2시간후접종한배양액에세포배양액 2 ml를첨가하였다. Cell lysate는 0.5 ml씩 10개의 well (6-well plate) 에접종하여 14일후까지매일관찰하였고 ( 아래표 ), 이들중 80% 이하에서 CPE가보일때, 적합으로판정하게된다. CPE 관찰결과는 4일째 ( 그림 75 및그림 76) 와 14일째결과 ( 그림 77) 를포함하였고, 모든양성대조군은뚜렷한 CPE를나타내었고, 음성대조군은 14일째에서도건강한세포형상을보였다 ( 그림 77). 해당대조군이시험에대한기준을만족하면서 ( 음성대조군 : No CPE, 양성대조군 : CPE), 검체 에서 CPE 를보였을때양성으로판정하였다. 만약, CPE 로인해바닥에서완전분리된세포는

104 혈구응집과혈구흡착시험에서제외하였다. 배양 14일후의검체또는대조군의세포배양액은회수하여혈구흡착과혈구응집시험을수행하였다. 검체또는대조군으로적절한처리를한세포는닭과기니픽의적혈구를사용하여 5 ± 3 혹은 36 ± 2 에서혈구응집과혈구흡착시험을하였다. 혈구흡착반응은양성대조군인 Poliovirus 에감염된 MRC-5 세포에서 Chicken RBC ( 그림 78) 혹은 Guinea pig RBC ( 그림 79) 로뚜렷이관찰되었다. 한편, Parainfluenza virus에감염된 Vero 세포에 Guinea pig RBC ( 그림 80) 혹은 Chicken RBC ( 그림 81) 를처리하면역시뚜렷한혈구흡착을보였다. 혈구응집시험에서헤마글루티닌을갖고있는바이러스는해당동물의적혈구를응집시킬수있는능력이있다. 이반응은적혈구표면에있는수용체와바이러스의헤마글루티닌이결합해만들어지는반응이다. 바이러스가적혈구에결합되어적혈구덩어리를만들어내는데이를혈구응집반응이라고한다. 이혈구응집반응은육안으로관찰될수있으며이반응이일어난다는것은바이러스가존재함을의미한다. 혈구응집시험을위해서검체, 양성대조액, 음성대조액을 96-well (U-bottom) 에각각 50 μl를넣고, 각 well 당 5% (v/v) 닭또는기니픽의적혈구용액을 50 μl씩넣고잘흔들어섞어준후, 5 ± 3 그리고 36 ± 2 에서 30분간두고, 응집반응여부를기록하였다. 혈구흡착시험을위해서는각세포에 5% 적혈구액을 0.2 ml씩 plate에넣고, 5 ± 3 혹은 36 ± 2 에서 30분간두고, 흡착여부를현미경으로관찰하였다 ( 그림 82). 그림 75. 바이러스감염후 CPE 관찰 Indicator 세포인 MRC-5 세포가 seeding 된 plate 에 10, 1, 0.1 TCID 50 의 poliovirus 바이러스를감염하여, 4 일째 CPE 를관찰하였다. (200 배배율 )

105 그림 76. 바이러스감염후 CPE 관찰 Indicator 세포인 Vero 세포가 seeding 된 plate 에 10, 1, 0.1 TCID 50 의 parainfluenza virus 를감염하여, 4 일째 CPE 를관찰하였다. (200 배배율 ) 그림 77. 바이러스감염 14 일째 CPE 관찰 HEK293, M RC-5, Vero 세포가 seeding 된 plate 에 1TCID 50 의 parainfluenza virus 혹은 poliovirus 를감염하여 14 일째에 CPE 관찰 (40 배배율 )

106 표. CPE 관찰시기아래표는 indicator세포와 test article (TA) 이감염된각 well에서 CPE가나타나는시기를관찰하였다. 바이러스가감염된 indicator 세포모두에서 CPE 가관찰되었다. TCID 50 3 days 4 days 5 days 293 Pa 10 3/8 5/8 8/8 Po 10 4/8 6/8 8/8 MRC- 5 Pa 10 8/8 8/8 8/8 1 1/8 4/8 5/ /8 1/8 1/8 Vero Po 10 6/8 8/8 8/8 1 2/8 6/8 7/ /8 3/8 5/8 TA N/ A N/A 0/8 0/8 0/8 Pa: parainfluenza virus, Po: poliovirus, TA: Test article

107 그림 78. Poliovirus가감염된 M RC-5에서의혈구흡착시험 (Chicken RBC) Indicator세포인 M RC-5 세포에 poliovirus를 10, 1, 0.1 TCID 50 로감염한후, 5일째혈구흡착시험을수행하였다. 10과 1 TCID 50 가감염된세포에서는뚜렷한 Chicken RBC의혈구흡착이관찰되었으며, CPE가관찰되지않는 0.1 TCID 50 에서는혈구흡착이관찰되지않았다

108 그림 79. Poliovirus가감염된 M RC-5에서의혈구흡착시험 (Guinea pig RBC) Indicator세포인 M RC-5 세포에 poliovirus를 10, 1, 0.1 TCID 50 로감염한후, 5일째혈구흡착시험을수행하였다. 10과 1 TCID 50 가감염된세포에서는기니픽의 RBC 의뚜렷한혈구흡착이관찰되었으며, CPE가관찰되지않는 0.1 TCID 50 에서는혈구흡착이관찰되지않았다

109 그림 80. Parainfluenza virus가감염된 Vero 세포에서의혈구흡착시험 Indicator세포인 Vero 세포에 parainfluenza virus를 10, 1, 0.1 TCID 50 로감염한후, 5일째혈구흡착시험을수행하였다. 10과 1 TCID 50 가감염된세포에서는뚜렷한기니픽 RBC의혈구흡착이관찰되었으며, CPE가관찰되지않는 0.1 TCID 50 에서는혈구흡착이관찰되지않았다

110 그림 81. Parainfluenza virus가감염된 Vero 세포에서의혈구흡착시험 Indicator세포인 Vero 세포에 parainfluenza virus를 10, 1, 0.1 TCID 50 로감염한후, 5일째혈구흡착시험을수행하였다. 10과 1 TCID 50 가감염된세포에서는뚜렷한 chicken RBC의혈구흡착이관찰되었으며, CPE가관찰되지않는 0.1 TCID 50 에서는혈구흡착이관찰되지않았다

111 그림 82. 혈구응집반응 상기에서설명한대로혈구응집반응을실시한결과, 그림82와같이 Poliovirus 또는 parainfluenza virus를감염한후, CPE가관찰된 HEK293 세포의 cell lysate를양성대조군 (2 열, poliovirus 와 3열, parainfluenza virus) 으로사용하였으며, test article인 HEK293 Pre MCB 를시험하였다. 양성대조군 (poliovirus, parainfluenza) 에서 4 에서는응집이뚜렷이관찰되었으며, 37 에서는응집이관찰되지않았다. 이는 37 에서 poliovirus 또는 parainfluenza virus 가응집을방해하는효소 ( 예, neuraminidase) 의활성이있음을의미한다. 사용된검체는외래성바이러스오염음성으로판정되었다

112 (4) 외래성바이러스오염검출시험법확립및검증을통한 SOP 확립 ( 일례 ) : 그림 83 그림 83. HTLV-2 오염검출시험법 SOP ( 일례 )

113 그림 83. HTLV-2 오염검출시험법 SOP ( 일례 )

114 (5) 시험법밸리데이션을통해구축되는 SOP 리스트 ( 그림 84) 그림 84. 시험법밸리데이션후구축되는 SOP 리스트

115 5. 연구개발과제의당해연도연구성과 본사업의계획서에서연구성과목표로책정하였던연구논문 4 건, 특허출원을통한지 적재산권 3 건은 2013 년결과로포함할계획임. 학술대회는 1 건 ( , KSGCT 발 표 ) 은예정되어있고, 나머지 3 건의학술대회발표도 2013 년에완료할계획임. 가. 성과내용 (1) 총괄연구개발과제 총괄과제명바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구 총괄과제책임자 박기랑 / 충북보건과학대학교 / 생화학 가 ) 정책활용본과제를통해달성한성과와자료는 KGMP의약사법, 약사법시행규칙및가이드라인등에활용할수있음. 따라서본사업의결과는첨단바이오제품과에서계획하고있는아데노바이러스기반유전자치료제의품질평가핸드북제작에활용할계획임. 나 ) 언론홍보및대국민교육해당없음 다 ) 연구논문 번호저서명발행연도출판사또는발행처

116 라 ) 학술발표 번호발표제목발표형태발표자학회명 국내 / 국제 마 ) 지식재산권 출원된특허의경우 등록된특허의경우 출원년도특허명출원인출원국출원번호등록년도특허명등록인등록국등록번호 6. 연구수행에따른문제점및대책 해당없음

117 7. 실적요약문 총괄연구과제요약 과제번호 바약안 304 단위과제명과제명주관연구책임자 2) 바이오의약품안전관리연구바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구성명박기랑생년월일소속기관명충북보건과학대학교전자우편전화번호 연구목표 (400~600자 ) - 연구최종목표는유전자치료제개발시가장많이사용되는재조합아데노바이러스 (rad) 의생산세포주 (MCB, WCB) 및마스터세포주로부터최종제품까지의안전성평가지표제시및품질평가시험법확립임. - 1차년도연구목표는재조합아데노바이러스 (rad) 벡터제조용사람유래생산세포주 (MCB, WCB) 의안전성평가시험법확립인데, 첫번째는외래성바이러스오염여부를검출할수있는민감도높고, 바이러스특이성이탁월한 Quantitative Real-Time PCR 기반의시험법을개발하는것이고, 다른시험법은광범위한외래성바이러스들을 indicator cell lines을이용하여배양법으로검출하는 in vitro adventitious virus 시험법을개발하는것임. 시험법이개발되면 ICH Q2 (R1) 의기준에따라 Impurities 검출법으로검증해야하는항목들을시험법밸리데이션하고검증된시험법은 SOP로작성함. - Quantitative Real-Time PCR방법을이용하여오염여부검출시험법확립의대상이되는바이러스는사람유래 virus (HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2 provirus, HAV, HBV, HCV) 7종과세포유래 virus (Simian Spumavirus, Retrovirus, Proviral SIV) 3종임

118 연구내용 (1000~1200 자 ) 1차년도연구개발내용은재조합아데노바이러스 (rad) 벡터제조용사람유래생산세포주 (MCB, WCB) 의안전성평가시험법확립하는것임. ( 가 ) EP, FDA 및 ICH 등외국공정서자료비교분석을통한사람유래생산세포주바이러스안전성평가지표항목설정 - 생물의약품생산세포주에오염가능한바이러스대상에대하여 ICH Q5A, FDA & CBER에서 2010년에제시한 "Guidance for Industry - Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Productions of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications" 등을참고하여선정기준을확립하였음. 오염검출시험법대상바이러스를선정하고, 시험법은바이러스특이적이고민감도가우수한 Quantitative Real-Time PCR 방법으로 Fluorescent probe를시험법에포함하여민감도를향상시켰다. 시험법이개발되면 ICH Q2 (R1) 의 Validation of Analytical Procedures", 2009년 EMEA Committee for Medicinal Products for Human Use에서제시한 Guidance on Validation of Bioanalytical Methods", 그리고 EP 7.0, "Nucleic acid amplification techniques" 을기준으로하여 Impurities 오염분석시험법 에서검증해야하는항목들을검증하고시험법을확립하였음. 한편, 일반외래성바이러스오염검출을위한 In vitro adventitious assay" 시험법개발은, ICH Q5A 와 FDA Point to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (1993, 1997), 그리고국내식약청에서 2010년발표한 생물의약품생산에사용되는세포기질관리가이드라인 을참고하여확립하였음. ( 나 ) 사람유래 virus (HIV-1, HIV-2, HTLV-1, 2 provirus, HAV, HBV, HCV) 및세포유래 virus (Simian Spumavirus, Retrovirus, Proviral SIV) 오염을검출하기위한 qrt-pcr 검출법확립및검증을통한 SOP 확립 - 각바이러스에대해가장특이성이우수하고 (BLAST search homology database로분석 ) 민감도가높은 PCR 프라이머쌍과 Taq-man Probe 를선정한후, ICH Q2 제시에따라 5개이상의농도군에서 Standard curve 와 Detection Limit 를확인하였고, Linearity 부분은 R 2 > 0.90, 즉 (R) value가 0.95정도되는것을허용기준으로수행하였음. 검체에의한저해효과가없는조건을 Sample suitability를통해확인한후, Precision 분석을시험군당 8 replica 조건에서독립적인 3회이상의반복시험을통해그결과가 95% positive cut-off 허용기준을만족하는지통계적으로분석하여검증하였다. 그결과대부분의바이러스가오염정도 100 copies에서검출되는것을확인하였음. 이러한결과는세계적인수준과유사한시험법이개발된것을의미함. ( 라 ) 일반적인외래성바이러스오염검출을위한 in vitro 시험법확립및검증을통한 SOP 확립 - ICH Q5A와 FDA PTC의권고에따라 3 indicator cell lines 을선정하여 Human diploid cells 은 MRC5, Monkey kidney cells은 Vero, 아데노바이러스생산세포주인 293을선정하였고, 세포주에바이러스혹은검체를처리한후최소 2주간이상의관찰을하면서, CPE (Cytopathic effect) 분석하였고, 시험완료후 Haemadsoption과 Haemagglutination 분석을통해시험법을개발완료하였음

119 연구성과 ( 응용분야및활용범위포함 ) (400~600 자 ) 연구결과기대성과 ( 응용분야 ) - 바이러스벡터유래유전자치료제의안전성평가에필요한 SOP 확립통한안전성평가기반구축 - 바이러스벡터유래유전자치료제가글로벌급신약으로산업화하는기간단축및시장진입촉진 - 생물학적제제등최종의약품의안전성평가시험기반마련 - 생물학적제제등최종의약품의안전성품질평가시험법 SOP 확립연구결과활용범위 - 본사업의연구결과는식약청가이드라인으로발표될예정이므로, 생물의약품기반의신약개발을하는기관에서생산세포주로부터생물의약품최종단계물질까지각단계공정에서나오는물질들의외래성바이러스오염여부를분석하고자할때바로이용할수있는매우요용한시험법임. Quantitative Real-Time PCR 방법을기반으로하는시험법은오염되어있는바이러스의동정및오염정도까지분석할수있는시험법이고, 일반적인 In vitro assay는광범위한바이러스가검출대상이되는유용한방법임. - 한편, 관련시험장비가밸리데이션이되어있는 CRO (Contract Research Organization) 에서는본사업의결과발표되는바이러스오염검출시험법을이용하여위탁기관의생산세포주와최종산물들을분석할수있는사업화도가능한검출시험법과 SOP 임. 총괄참여연구원 성명생년월일성명생년월일 박기랑 조영화 황현지 김혜림 최영국박선례추숙진강예진이솔권혁인강송이 Keywords (5 개내외 ) 한글 영문 유전자치료제, 재조합아데노바이러스, 안전성평가시험 gene therapy, recombinant adenovirus, biosafety testing

120 주 1) 연구목표, 연구내용, 연구성과를서술형으로기재 2) 연구성과는그간의연구결과및기대성과를서술 3) 세부과제별로작성 ( 세부과제가없을시작성하지않음 ) 주관연구책임자의견 1 차년도연구개발내용 : 재조합아데노바이러스 (rad) 벡터제조용사람유래생산세포주 (MCB, WCB) 의안전성평가시험법확립 - EP, FDA 및 ICH 등외국공정서자료비교분석을통한사람유래생산세포주바이러스안전성평가지표항목설정 연구의범위 - 사람유래 virus (HIV1, HIV2, HTLV1, 2 provirus, HAV, HBV, HCV 등 ) 오염의 qrt-pcr 검출법확립및검증을통한 SOP 확립 - 세포유래 virus (Simian Spumavirus, Retrovirus, Proviral SIV 등 ) 오염의 in vitro 시험법확립및검증을통한 SOP 확립 - 일반적인외래성바이러스오염검출을위한 in vitro 시험법확립및검증을통한 SOP 확립 연구의한계점해당없음 인용시 주의사항 해당없음 주관부서연락처 식품의약품안전청 / 식품의약품안전평가원첨단바이오제품과 ( )

121 차기연도연구과제계획 간지

122 총괄연구개발과제 1. 총괄요약문 과제번호 바약안 304 과제명 바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구 주관연구책임자 성명박기랑생년월일 전공생화학및분자생물학소속주성대학산학협력단 색인단어 국문유전자치료제재조합아데노바이러스안전성평가시험 영문 gene therapy recombinant adenovirus biosafety testing 연구목표 유전자치료제개발시가장많이사용되는재조합아데노바이러스 (rad) 의생산세포주 (MCB, WCB) 및마스터세포주로부터최종제품까지의안전성평가지표제시및품질평가시험법확립 연구내용 [2 차년도 ] 1. 연구개발내용 : 재조합아데노바이러스 (rad) 의제조공정중마스터세포주로부터최종제품까지의안전성평가시험법확립 1) 외국 CRO 등의안전성평가시험관련자료비교분석을통한제조공정중바이러스안전성평가지표항목설정 2) 생산공정물질유래 bovine virus, porcine virus 및 AAV 오염분석을위한시험법확립및검증을통한 SOP 확립 3) 제조공정에기인한오염물질 ( 잔류 DNA 및단백질등 ) 검출시험법확립및검증을통한 SOP 확립 4) Replication competent adenovirus(rca) 검출시험법확립및검증을통한 SOP 확립 2. 연구개발방법 1) In vitro assay for the presence of bovine viruses 2) In vitro assay for the presence of porcine viruses 3) Detection for the presence of Adeno-associated viruses in Adenovirus stock 4) Detection and quantification of residual 293 DNA in biological samples 5) Detection and quantification of residual 293 protein in biological samples 6) Replication competent adenovirus (RCA) 검출시험법확립 7) 분석방법검증및 SOP 의개발 기대성과 1) 바이러스벡터유래유전자치료제의안전성평가에필요한 SOP 확립을통한안전성평가기반구축 2) 바이러스벡터유래유전자치료제가글로벌급신약으로산업화하는기간단축및시장진입촉진 3) 바이러스벡터유래유전자치료제의안전성평가시험기반마련 4) 바이러스벡터유래유전자치료제의안전성품질평가시험법 SOP 확립

123 2. 총괄차기연도연구개발비총괄표 가. 총괄용역연구개발비산출내역서 비 목 구 분 금액구성비비고 책임연구원 0 원 0 % 연구원 0 원 0 % 인건비 연구보조원 49,800,000 원 33.2 % 보조원 0 원 0 % 인건비소계 49,800,000 원 33.2 % 국내여비 0 원 0 % 여비 국외여비 9,680,000 원 6.45 % 여비소계 9,680,000 원 6.45 % 경 유인물비 2,350,000 원 1.57 % 전산처리비 500,000 원 0.33 % 시약및재료비 78,670,000 원 % 비 회의비 2,000,000 원 1.33 % 임차료 0 원 0 % 교통통신비 0 원 0 % 감가상각비 0 원 0 % 경비소계 93,200,000 원 % 일반관리비 7,000,000 원 4.67 % 합계 150,000,000 원 100 % * 일반관리비는 ( 인건비 + 경비 ) 의 5% 미만으로책정할것 * 첨부 : 비목별산출내역

124 첨부 : 비목별산출내역 ( 단독과제일경우에만본표를작성하며, 세부연구기관이포함된과제일경우는각각의세부연구과제에비목별산출내역을작성함 ) (1) 인건비원 등급인건비단가참여개월 ( 월 ) 인원 ( 명 ) 참여율 (%) 계 ( 원 ) (2) 경비 * 1$ : 작성당시매매기준환율

125

126 ( 라 ) 시약및재료비 78,670,000 원 ( 내구연수가 1년이하의시약 재료구입비 ) 항목 수량 횟수 단가 ( 원 ) 금액 ( 원 ) 비고 Competent cell ,000 1,000,000 동물세포주 ,000 5,000,000 Virus ,000 5,000,000 ELISA kit ,000 4,800,000 Referencegenomic DNA ,000 3,000,000 T-75 flask ,000 2,250,000 T-175 flask ,000 2,250,000 24well plate ,000 1,500,000 96well plate ,000 1,500,000 PBS(1X) ,000 1,800,000 FBS ,000 9,000,000 DMEM ,000 4,000,000 Trypsin-EDTA , ,000 Antibiotics , ,000 Trypan blue ,000 80,000 25ml pipette , ,000 10ml pipette ,000 1,000,000 PCR cap+tube (real timepcr) ,000 1,200,000 Taq polymerase (hot start) ,000 4,000, ml microtube , ,000 Plasmid DNA maxiprep kit ,000 2,400,000 Plasmid DNA miniprep kit , ,000 Gel purification kit , ,000 Agarose ,000 1,600,000 Ultrapure low melting Agarose , ,000 DNA size marker , ,000 Protein marker , ,000 Restriction Enzyme ,000 3,000,000 소계 60,025,

127 항목 수량 횟수 단가 ( 원 ) 금액 ( 원 ) 비고 Latex glove , ,000 50ml tube ,000 1,500,000 15ml tube , ,000 Blue tip , ,000 Yellow tip , ,000 W hite tip , ,000 Filter tip(1000 ul) , ,000 Filter tip(200 ul) , ,000 Filter tip(10 ul) , ,000 RNA extraction kit ,000 2,100,000 Sequencing Service , ,000 Primer 및 Probe 합성 ,000 2,500,000 Gene 합성 ,000 1,500,000 Real-time PCR kit ,000 3,000,000 CO2, LN2 gas , ,000 phenol , ,000 chloroform , ,000 Alcohol , ,000 2-propanol , ,000 EtBr , ,000 gdna purification kit , ,000 Cell staining reagent , ,000 소계 18,645,000 합계 78,670,

128 (

129 나. 국외출장계획서 ( 국외출장이포함된단독과제일경우에만본표를작성하며, 세부연구과제에국외출장이포함된경우는각각의세부연구과제에포함하여작성함 ) 단위과제명 2) 바이오의약품안전관리연구 주관연구기관충북보건과학대학교산학협력단주관연구책임자 박기랑 과제명 바이러스유래유전자치료제의안전성평가기반연구 세부과제번호 1 세부과제연구기관 충북보건과학대학교산학협력단 세부과제연구책임자 박기랑 세부과제연구개발비 ( 당해년도 ) 출 장 자 경 비 150,000,000 원 성명소속등급 박기랑 조영화 충북보건과학대학교 충북보건과학대학교 국외여비총액 ( 당해년도 ) 부터 출장기간 9,680,000 원 까지 책임연구원 연구원 출장장소 영국런던, 스코틀랜드영국런던, 스코틀랜드 구분성명등급단가횟수총액 항공료 체제비 박기랑책임연구원 4,000,000 원 1 회 4,000,000 원 조영화연구원 2,500,000 원 1 회 2,500,000 원 박기랑책임연구원 1,750,000 원 1 회 1,750,000 원 조영화연구원 1,430,000 원 1 회 1,430,000 원 출장사유 ( 목적및 필요성 ) 선진국유전자치료제전문 CDMO (BioReliance) 에서안전성평가및품 질평가시험법정보교류 2 인이내로함 출장장소는도시명으로작성해야함 해당연구목표와관련있는국외출장만인정함

130 3. 총괄차기연도연구목표및내용가. 총괄연구개발목표 (1) 총괄연구개발목표 유전자치료제개발시가장많이사용되는재조합아데노바이러스 (rad) 의생산세포주 (MCB, W CB) 및마스터세포주로부터최종제품까지의안전성평가지표제시및품질평가시험법확립 (2) 총괄연구개발내용 재조합아데노바이러스 (rad) 를포함하는생물의약품생산에사용되는동물세포주는 the EMA Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP), the FDA's Center for Drug Evaluation and Research (CDER), the International Conference on Harmonisation (ICH) 등에따라안전성평가분석시험이수행되어야하고, 공정서에나오는시헙법으로수행되는것이아니면시험분석법이밸리데이션프로토콜에따라검증되어야함. 본사업팀은외래성바이러스오염시험개발을위해 PCR 시험법을상당부분개발하였으나, 민감도가낮고 (500~1000 copies 이상검출가능 ), 정량적으로분석하기어려운단점이있다. 이러한문제점을해결하기위해서, 본과제의 1차년도에서는재조합아데노바이러스생산세포주 (MCB, WCB) 를이용하여외래성바이러스를검출하기위해 quantitative real-time PCR (qrt-pcr) 법과 in vitro 시험법을확립하여검증하고, 2차년도에는제조공정중마스터세포에서부터최종제품까지의외래성바이러스및기타오염물질의검출법을개발하여, 검증후 SOP 확립까지수행할계획임. 나. 총괄연구개발내용 (1) 2차연도연구개발내용 재조합아데노바이러스 (rad) 의제조공정중마스터세포주로부터최종제품까지의안전성평가시험법확립 - 외국 CRO 등의안전성평가시험관련자료비교분석을통한제조공정중바이러스안전성평가지표항목설정 - 생산공정물질유래 bovine virus, porcine virus 및 AAV 오염분석을위한시험법확립및검증을통한 SOP 확립 - 제조공정에기인한오염물질 ( 잔류 DNA 및단백질등 ) 검출시험법확립및검증을통한 SOP 확

131 립 - Replication competent adenovirus(rca) 검출시험법확립및검증을통한 SOP 확립 (2) 2차연도연구개발방법 ( 가 ) I n vitro assay for the presence of bovine viruses - 본시험법은소 (bovine) 유래원료물질과이를이용하여생산된생물의약품의안전성테스트를위해사용되며, 9 CFR 에따라수행되어야한다. - 소 (bovine) 유래바이러스의검출은검체또는대조군을 BT와 Vero 세포배양액에첨가한후, 약 3주이상배양하면서, 아래그림 85 와같이 4가지방법 (cytopathic effect, hemadsortion, Giemsa stain, fluorescent observation) 을통해평가한다. 그림 85. I n vitro assay for the presence of bovine viruses - 양성대조군에는 8종의 bovine 유래바이러스 (bovine viral diarrhea virus, bovine adenovirus type 5, bovine parvovirus, bluetongue virus, bovine parainfluenza virus type3, bovine respiratory syncytial virus, infectious bovine rhinotracheitis virus, reovirus type 3) 가사용된다. - Bovine turbinate (BT) 와 African green monkey kidney (Vero) 세포를바이러스검출에이용하며 BT세포는광범위한 bovine viruses, Vero 세포는 reovirus type 3를검출하는데용이하다. ( 나 ) I n vitro assay for the presence of porcine viruses - 생물의약품생산에사용된돼지 (porcine) 유래원료물질또는이에노출된세포등은 modified 9 CFR 에따라돼지 (porcine) 유래바이러스가감염되지않았음을증명해야한다

132 - 본시험은아래그림 86 처럼 porcine testis (PT-1) 세포에검체또는대조군을세포배양액에첨가한후, 약 3주동안배양하여 cytopathic effect (CPE) 를관찰한다. 약 3주의과정중에일부세포는 haemadsoption 과형광표지하여 porcine 유래바이러스의오염을판정한다. - 양성대조군은 porcine parvovirus, transmissible gastroenteritis virus, porcine adenovirus, bovine parainfluenza virus 를사용한다. 그림 86. I n vitro assay for the presence of porcine viruses ( 다 ) Detection for the presence of Adeno-associated viruses in Adenovirus stock - Adeno-associated virus (AAV) 는아데노바이러스또는허피스바이러스같은 helper virus 의존재하에서복제를할수있으며, 임상시험용또는허가품목인바이러스제제를사람에사용하기위해서는 replication competent AAV가존재하지않음을증명하여야한다. - 본연구과제에서는아래그림 87 처럼최종생산품인재조합아데노바이러스 (rad) 에존재할수있는 replication competent AAV를 end point PCR 을통해검출하고자한다. 그림 87. 아데노바이러스에서복제가능 AAV 의검출 - 그림 87 에서처럼아데노바이러스에 wild type AAV 를다양한농도로첨가한후, 293 세포

133 에감염하여두종류의바이러스를증폭시킨다. 증폭된두종류의바이러스에열을가하 여열에약한아데노바이러스만제거하고, Replication competent AAV 를 A549 세포에감 염하여증폭시킨후, 다양한시간에수확하여검출최소농도를설정한다. ( 라 ) Detection and quantification of residual 293 DNA in biological samples - 동물유래생산세포주에서제조되는최종생물의약품에는숙주 DNA가오염될가능성이크다. - 따라서, 각국의규제기관은안전성을확보하기위해, 최종생물의약품에 immortalized cell 에서유래된 DNA의오염정도를분석하여품질평가한후 release 적합여부를판정하는데, WHO에서는 10 ng 이하 /dose 를기준으로하고있다. - 본시험법확립에는 standard genomic DNA와아데노바이러스가필요하며, 18S rrna gene 증폭을위한프라이머 (HPLC grade) 는 5 -CCA TCG AAC GTC TGC CCT A-3, 5'-TCA CCC GTG GTC ACC ATG-3' 와 probe 5'-FAM-CGA TGG TGG TCG CCG TGC CTA-TAMRA-3' 를사용한다. ( 마 ) Detection and quantification of residual 293 protein in biological samples - Cygnus Technologies (Cat. #F650) 사의 HEK293 HCP ELISA kit을이용하여 host cell proteins 을정량할수있는데, 이러한경우에는 ICH Q2A 와 Q2B 는분석법에따라아래표처럼시험법밸리데이션을확립하여야한다. - 본시험법에서고려되어야할항목은 specificity, linearity, quantitation limit, detection limit, range, accuracy, precision 이다. 본과제를통해서시험법밸리데이션프로토콜을개발하고전반적인시험법밸리데이션을통해시험법 SOP를확립할계획이다. 표. ICH Q2A 및 Q2B 의시험법밸리데이션분석항목 ( 바 ) Replication competent adenovirus (RCA) 검출시험법확립 - 유전자치료제의복제가능바이러스시험법에관한가이드 (2005 KFDA) 와 guidance for human

134 somatic cell therapy and gene therapy (US FDA, 1998) 에서는재조합아데노바이러스는 3 x virus particles (VP) 당 1 RCA 미만을사용하게규정하고있다. 그림 88. RCA 검출시험법확립과정 - RCA 검출시험법확립과정은 A549 세포를이용하여전체 3단계로세포독성시험 (cytotoxicity) 간섭효과시험 (interference assay) RCA 검출시험으로진행된다. - 세포독성시험에서는재조합아데노바이러스가 A549 세포에감염되었을때, 세포독성이보이지않는바이러스농도를결정한다. - 이후, 간섭효과시험에서재조합아데노바이러스와 RCA가동시에감염이되었을때 RCA의복제가저해되지않는조건을결정한다. - 이후 A549 세포에재조합아데노바이러스제제를 3 x VP 만큼처리하고 CPE 를분석하면서 RCA를검출한다. ( 사 ) 분석방법검증및 SOP의개발 - 본사업의 1, 2차년도를통해개발하는품질평가분석법은상기표에있는 ICH Q2A 및 Q2B 의분석항목에따라시험법밸리데이션이수행될예정이고, 이를바탕으로검증된 SOP가확립되도록수행할계획이다