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1 발간등록번호 식품중사용원료진위판별지침서 유전자분석법활용

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3 - 유전자분석법활용 - 발간사 최근부당이익을얻기위하여값싼원료를사용하거나표시사항을허위로기재하는등의불량식품 가짜식품 제조 유통사례가증가하고있는실정입니다. 특히고추양념을혼합한불량고춧가루 다진마늘에양파혼합 홍삼분말에마분말혼합등의사례가언론등을통하여보도되면서식품에대한불안감이있는실정입니다. 이에소비자를기만하는행위근절을위하여불량식품판별을위한검사지침마련이요구되어 식품의약품안전처에서는불량식품유통사례에대한정보를바탕으로시급히마련되어야할 판별목록을선정하여불량식품판별법을마련한것입니다. 본지침서에수록되어있는판별법은불량식품등의식품원료를확인하는방법으로는이화학적인분석법도있으나더정밀한판단을위하여유전자분석법을마련하여추가보정하였습니다. 원료농산물또는단순가공식품에는일반프라이머또는종특이프라이머를사용하는방법모두적용이가능하나가공식품의경우에는제조시가열 압력등에의하여식품중유전자의손상이발생하고유전자분석과정에서추출되는유전자의크기가작아지기때문에종특이프라이머를사용하는방법을선택하였습니다. 동물성과식물성원료총 119 종에대한판별법이수록되었으며불량식품판별및식품중이물 동정등에유용하게활용되기를기대합니다 식품의약품안전평가원장왕진호

4 Contents 지침서에사용된동물성 식물성원료목록과학명 6 Chapter Ⅰ 시료전처리및유전자추출 1. 시료전처리 유전자추출 추출유전자확인 15 Chapter Ⅱ 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR Ⅱ-Ⅰ. 동물성원료 1. 가축류 가금류 민물어류 해양어류 회유어류 다랑어류및새치류 심해성어류 갑각류 패류 두족류 77 Ⅱ-Ⅱ. 식물성원료 1. 곡류 서류 콩류 견과종실류 과실류 채소류 근채류 버섯류 기타 133

5 - 유전자분석법활용 - Chapter Ⅲ 일반 universal 프라이머를이용한유전자증폭 PCR Ⅲ-Ⅰ. 동물성원료 1. LCO1490/HCO2198 프라이머를이용한방법 VF2/FISH R2 프라이머를이용한방법 L14724/H15915 프라이머를이용한방법 146 Ⅲ-Ⅱ. 식물성원료 1. trnh/psba 프라이머를이용한방법 rpob 프라이머를이용한방법 rbcl 프라이머를이용한방법 152 Chapter Ⅳ 유전자증폭산물의확인 1. 전기영동에따른결과의판정 156 Chapter Ⅴ 유전자증폭산물의결과판정 1. 결과판정 160 Chapter Ⅵ 참고문헌 164 Chapter Ⅶ 부록 176

6 - 유전자분석법활용 - 지침서에사용된동물성 식물성원료목록과학명 동물성시료 분류 원료명 학명 비고 소 Bos taurus 돼지 Sus scrofa 염소 Capra hircus 가축류 가금류 민물어류 사슴 Cervus elaphus Cervus nippon 양 Ovis aries 말 Equus caballus 캥거루 Macropus fuliginosus Macropus giganteus 토끼 Oryctolagus cuniculus 여우 Silurus asotus 닭 Gallus gallus 오리 Anas platyrhynchos 칠면조 Meleagris gallopago 타조 Struthio camelus 거위 Anser anser 꿩 Phasianus colchicus 집비둘기 Columba livia 멧비둘기 Columba rupestris 메추리 Coturnix coturnix 참새 Passer montanus 제비 Hirundo rustica 잉어및향어 Cyprinus carpio Cyprinus carpio nudus 붕어 Carassius auratus 미꾸라지 Misgurnus mizolepis 미꾸리 Misgurnus anguillicaudatus 가물치 Channa argus 메기 Silurus asotus 쏘가리 Siniperca scherzeri p18 p25 p26 p35 p36 p42 6

7 지침서에사용된동물성 식물성원료목록과학명 분류원료명 학명 비고 해양어류회유어류다랑어류및새치류심해성어류갑각류패류두족류 대구 Gadus macrocephalus 청대구 Micromesistius poutassou 명태 Theragra chalcogramma 틸라피아 Oreochromis niloticus 꽁치 Cololabis saira 고등어 Scomber japonicus 다금바리 Niphon spinosus 자바리 Epinephelus bruneus 능성어 Epinephelus septemfasciatus 날치 Cheilopogon agoo 열빙어 Mallotus villosus 청어 Clupea pallasii 까나리 Ammodytes hexapterus 멸치 Engraulis japonicus 참조기 Larimichthys polyactis 광어 Paralichthys olivaceus 조피볼락 우럭 Sebastes schlegelii 홍어 Okamejei kenojei 가오리 Urolophus aurantiacus 말쥐치 Thamnaconus modestus 농어 Lateolabrax japonicus 성게 Strongylocentrotus intermedius 연어 Salmo salar 송어 Oncorhynchus mykiss 다랑어류 Thunnus albacares Thunnus tonggol Thunnus obesus Thunnus atlanticus Thunnus thynnus 새치류 Makaira mazara Tetrapturus angustirostris Istiophorus platypterus Tetrapturus audax Xiphias gladius Makaira indica 기름갈치꼬치 Ruvettus pretiosus 흑갈치꼬치 Lepidocybirium flavobrunneum 게 Portunus trituberculatus 새우 Marsupenaeus japonicus Penaeus monodo 바닷가재 Homarus americanus 전복 Haliotis discus Haliotis madaka Haliotis gigantea 백합 Meretrix petechialis 소라 Turbo cornutus 오징어 Sepia esculenta 한치 Loligo bleekeri 주꾸미 Octopus ocellatus 낙지 Octopus minor p43 p59 p60 p62 p63 p65 p66 p68 p69 p72 p73 p76 p77 p81 7

8 - 유전자분석법활용 - 식물성시료목록 분류원료명 학명 비고 곡류서류콩류견과종실류과실류채소류 쌀 Oryza sativa 밀 Triticum aestivum 메밀 Fagopyrum esculentum 고구마 Ipomoea batatas 타피오카 Manihot esculenta 검정콩 Glycine max MERR. 녹두 Vigna radiatu 팥 Vigna angularis 땅콩 Arachis hypogaea L. 참깨 Sesamum indicum L. 들깨 Perilla frutescens var. japonica Hassk. Hara 올리브 Olea europaes L. 아몬드 Prunus dulcis Miel Wedd. 해바라기 Helianthus annuus L. 밤 Castanea crenata Sieb 잣 Pinus koraiensis 호두 Juglans regi 복숭아 Prunus persica Batch var. vulgaris 딸기 Fragaria ananassa Duch 앵두 Prunus tomentosa Thunb 포도 Vitis vinifera L. 대추 Ziziphus jujuba 배추 Brassica campestris L. 파및쪽파 Allium fistulosum L. & Allium ascalonicum 토마토 Lycopersicon esculentum 호박 Cucurbita moschata Duch 알로에 Aloe vera 미나리 Oenanthe javanica 부추 Allium tuberosum 오이 Cucumis sativus 고추냉이 Eutrema wasabi 겨자 Brassica juncea p84 p88 p89 p91 p92 p95 p96 p104 p105 p110 p111 p119 8

9 지침서에사용된동물성 식물성원료목록과학명 분류원료명 학명 비고 근채류 버섯류 기타 인삼 Panax schinseng 도라지 Platycodon grandiflorum 더덕 Nopsis lanceolata 마 Dioscorea batatas 마늘 Allium sativum 양파 Allium cepa 무 Raphanus sativus L. 생강 Zingiber officinale ROSC. 당근 Daucus carota L. 팽이버섯 Flammulina velutipes 표고버섯 Lentinula edodes 양송이버섯 Agaricus bisporus 영지버섯 Ganoderma lucidum 새송이버섯 Pleurotus eryngii 느타리버섯 Pleurotus ostreatus 녹차 Camellia taliensis 시금치 Spinacia oleracea L 클로렐라 Chlorella spp. 태국칡 Pueraria mirifica 과라나 Paullinia cupana 흰민들레 Taraxacum coreanum 민들레 Taraxacum platycarpum p120 p127 p128 p132 p133 p139 9

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11 - 유전자분석법활용 - ⅠChapter 시료전처리및 유전자추출

12 - 유전자분석법활용 - Ⅰ 시료전처리및유전자추출 1. 시료전처리 1-1 시료이미지촬영 필요시의뢰된시료는디지털카메라등의영상처리장치를이용하여사진을촬영한다. 육안으로 구분이어려운경우실체현미경 광학현미경등을통하여사진을촬영할수있다. 1-2 식품유형별전처리가 건어포류 식품중어육 패육등의판별법을적용하기위한북어채등의경우에는소량의혼입량도확인하여야하기때문에가급적많은양을이용하여유전자추출에사용한다. 또한염농도가높은제품은일정시간동안멸균증류수에침지하여탈염과정을반복하면효율적이다. 나 떡류 식품중곡류등의판별법을적용하기위한떡국떡등의경우에는유전자추출의효율을높이기위하여아밀라제 α-amylase 등의효소를이용할수있다. 다 분말류 원료중근채류등의판별법을적용하기위한홍삼분말등의경우에는모든내용물을시료로선택하여야한다. 라 전류 식품중어류판별법을적용하기위한대구전 동태전등의경우밀가루부분을제거하고내부의어육부분만을시료로선택할수있다. 마 젓갈류 원료중어류 패류등의판별법을적용하는경우젓갈류에사용된고춧가루등의양념류는증류수로세척하여내용물만을시료로선택할수있다. 바 죽류 전복죽중패류등의판별법을적용하는경우육안판별이가능한경우전복등의내용물만을시료로선택할수있다. 다만 육안판별이어렵거나미세하게분쇄된경우에는전체를시료로선택하여야한다. 사 수분함량이많은검체 건조기등을이용하여수분을제거한다. 아 당분또는염농도가높은검체 멸균증류수로희석후원심분리하여침전물을검체로사용한다. 자 액상제품 원심분리후침전물을검체로사용한다. 차 기타유전자추출효율을높이기위하여식품유형별전처리조건을다양하게할수있다. 12

13 Ⅱ. Ⅰ. 시료전처리및유전자추출 제 1 장 2. 유전자추출 2-1 유전자추출 Ⅰ CTAB 완충용액사용법 가 균질하게분쇄된검체 2g 을폴리프로필렌튜브 50 ml용 에넣고 CTAB 완충액 15 ml를가하여 교반기 vortex mixer 로잘섞은후추가로 CTAB 완충액 30 ml를가하고 55 에서 30 분간 반응시킨다 10 분마다 10 초간교반기를사용하여충분히혼합한다. 나 균질화한용액 600 μl를 1.5 ml튜브에넣고 P C I 용액 500 μl를가하여잘혼합한후 원심분리 rpm 15 분 실온 한다. 다 상층액을새로운 1.5 ml튜브에옮긴후 C I 용액 500 μl를가하여교반기를이용하여잘혼합한 후원심분리 rpm 15 분 실온 한다. 라 상층액을새로운 1.5 ml튜브에옮기고동량의이소프로판올을가하여혼합후원심분리 rpm 10 분 실온 한다. 마 상층액을버리고 침전물에 500 μl의 70% 에탄올을벽면으로천천히가한후원심분리 rpm 1 분 실온 하여상층액을제거한후건조시킨다. 바 TE 완충액 ph μl를가하여잘녹인다. 단 추출된 DNA 를정제하기위하여바 의용액에 RNase A 10 mg / ml 1 μl를가하여 37 에서 30 분간정치한경우에는나 ~ 바 항을반복할수있다. 2-2 유전자추출 Ⅱ Lysis 완충용액사용법 가 시료를액체질소나드라이아이스를이용하여잘갈아준다 파쇄입자가적을수록 DNA 추출수율이좋다. 나 DNA Extraction buffer를첨가 1 g 1 ml 하여잘섞어준다. 다 65 항온수조에서 60분간처리한다 5분간격으로흔들어준다. 라 튜브를항온수조에서꺼내어첨가한 DNA Extraction buffer와동량의 P C I 용액을넣고잘섞어준후원심분리 rpm 20분 4 한다. 13

14 - 유전자분석법활용 - 마 상층액을새튜브에옮긴후동량의 C I 용액을넣고원심분리 rpm 15분 4 한다. 바 상층액을새튜브에옮겨준후동량의이소프로판올을첨가한후잘섞어원심분리 rpm 15분 4 한다. 사 상층액을버리고 1 ml 70% 에탄올을넣고 10~15초동안잘섞고원심분리 rpm 10분 한다. 아 상층액은버리고침전물 pellet 을상온에서하룻밤방치하거나건조기기를이용하여완전히건조시킨다 Pellet에알코올이완전히제거될때까지건조시킨다. 자 건조가끝나면 100 μl의 TE buffer를첨가후 pellet을완전히녹인다. 차 RNase A 10 mg / ml 1 μl를첨가하여잘섞어준후 37 배양기에서 30분반응시킨다 필요시. 2-3 상업용추출키트사용 실리카겔막법 Silica gel membrane method 마그네틱비드법 Magnetic bead method 등을 이용한시중에유통되는상용화된키트를사용할수있다. 용액조성 - CTAB 완충액 0.5 M EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ph ml 1 M Tris-Cl ph ml 5 M NaCl 56 ml를넣고증류수로약 150 ml가되도록한후 CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide 4 g 을가하여완전히용해시킨다. 그리고증류수를넣어전체양을 200 ml로조정한후멸균한다. - DNA Extraction buffer 100 mm Tris ph mm NaCl 50 mm EDTA 1.2% SDS w/v β-mercaptoethanol 0.2% w/v 단 β-mercaptoethanol 은사용하기전에첨가. - TE buffer 10 mm Tris ph mm EDTA - P C I 용액 Phenol Chloroform Isoamylalcohol = C I 용액 Chloroform Isoamylalcohol =

15 Ⅱ. Ⅰ. 시료전처리및유전자추출 3. 추출유전자확인 제 1 장 3-1 DNA의농도및순도확인 DNA 원액의농도는 TE 완충액 ph 8.0 또는멸균증류수로적절히희석한후분광광도계를사용하여 260 nm에서흡광도 Absorbance A 를측정하고 그값이 1일때 DNA 농도가 50 ng/ μl인것으로하여계산한다. 한편 추출된 DNA의순도를확인하기위하여 nm에서흡광도를각각측정한다. A 260 /A 280 과 A 260 /A230이 1.7~2.0일경우 PCR에적합한 DNA로판단한다. 다만 가공식품의경우이러한순도적용이어려운경우가있으므로반드시적용되는것은아니다. 만일 A 260 /A 280 이낮아단백질유래불순물의혼입이우려되는경우단백질분해효소 protease 로처리한후 DNA를회수하며 A 260 /A 230 이낮을경우전분분해효소 amylase 로처리한후 DNA를회수하여 PCR에 사용할수있다. DNA 원액에대한 DNA 농도로부터 PCR에필요한 DNA 농도가되도록 TE 완충액 ph 8.0 또는멸균증류수로희석하여 PCR용 DNA로하고 20 μl씩 0.5 ml튜브에분주하여 -20 이하에서냉동보존한다. 소분보관중인 PCR용 DNA는사용전실온에서서서히녹여사용한다 추출 DNA의농축 DNA 원액의농도가 PCR에필요한농도보다낮을경우재추출하고 그래도 PCR에필요한농도보다낮을경우원액을 PCR용 DNA로사용하거나아래와같은농축과정을실시하여사용할수있다. 추출 DNA 원액의농축은시중에판매되고있는 DNA 농축키트를사용하거나 다음과같은방법에의한다. 3M 초산나트륨 ph 5.2 을 DNA 용액량의 1/10배 10 M 초산암모늄을사용할경우에는 1/5배를첨가 를첨가하고차게한에탄올을 2배량가한후 rpm에서 15분간원심분리한다 이소프로판올을사용할경우에는 1배량을첨가한후상온에서원심분리한다. 원심분리후상층액은버리고염 salt 을제거하기위하여침전물을 70% 에탄올로세척하고 TE 완충액 ph 8.0 또는멸균증류수적당량으로녹인후사용한다 최초의 DNA 원액이소량일경우에는멸균증류수를사용하여시작하는양을 300~400 μl로한후농축할수있다. 15

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17 - 유전자분석법활용 - ⅡChapter 종특이프라이머를 이용한유전자증폭 (PCR) Ⅱ Ⅰ. 동물성원료

18 - 유전자분석법활용 - Ⅱ 종특이프라이머를이용한유전자증폭 (PCR) Ⅱ Ⅰ. 동물성원료 1 가축류 소 돼지 양 염소 사슴 말 캥거루 토끼 여우 1.1. 종 種 특이프라이머서열 소등종특이프라이머는아래표 1 에명시된것과같다. 표 1. 소등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 소 SFI11-Cow-F SFI11-Cow-R TAT CTT GAA CTA GAC CTA GCC CAA TG GGT ACT TTC TCT ATA GCG CCG TAC S 1 돼지 SFI11-Pig-F SFI11-Pig-R CAA CCT TGA CTA GAG AGT AAA ACC GGT ATT GGG CTA GGA GTT TGT T S 양 SFI11-Lam-F SFI11-Lam-R GTA CAA CCT TCA CTA GAG AGT AAG ATC CCA GTA TTA AAT CTA GGA GTT GGC TAA TG S 염소 SFI11-Goa-F SFI11-Goa-R CAA CCT TCA CTA GAG AGT AAG ACT CT ATT GCT TCT ATT TAA TAA TAG AGC G S 사슴 SFI11-Dee-F SFI11-Dee-R TCA AGC ACA CAT CCG TAG CTC A CTT TAA CAC ACT TTA CGC CGT ATG S 2 말 SFI11-Hor-F SFI11-Hor-R TAC AAC CTT CAT TAG AGA GTA AGA ACA AG CAG TAT GAG ATT AGG AGT TAG TT S 캥거루 SFI12-Kanga-F SFI12-Kanga-R CAA CAA CCC ATC AGG AAT CAA CCC C GTG GGT TGG CAG GAG AGA AGT TGT C 170 Cytb 3 토끼 SFI13-Rabbit-F SFI13-Rabbit-R CAA CTT TAG TCT TAA TTC ACC TCC TC AAA TAA GGA GGA GAA GAA TGG CTA CA 156 Cytb 여우 SFI13-Fox-F SFI13-Fox-R CTT CCC GCA CCA TCA AAT ATT T AGA TGC TCC GTT TGC ATG TAT GTA 204 Cytb S 16S rdna 2 12S 12S rdna 3 Cytb Cytochrome b

19 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 PCR 반응액의조성 PCR 을위한반응액의조성은아래표 2 와같다. 표 2. PCR 반응액의조성 성분 Stock 용액농도 최종농도 튜브 1회분량 Taq DNA polymerase 5 U/ μl 1.0 U 0.2 μl 완충액 10 x 1 x 2.0 μl MgCl 2 25 mm 2.0 mm 1.6 μl dntps 2.5 mm 200 μm 1.6 μl 프라이머 각 10 pmol 각 10 pmol 각 1.0 μl 주형DNA 50 ng/ μl 50 ng 1.0 μl 멸균증류수 전체량 11.6 μl 20.0 μl 반응액의조성은모든항목에공통으로적용되며경우에따라 MgCl 2 의농도를 1.0~2.5 mm 로조정할수있다 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 3 ~ 표 6 와같다. 표 3. PCR 반응조건 소 돼지 양 염소 사슴 말 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

20 - 유전자분석법활용 - 표 4. PCR 반응조건 캥거루 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 5. PCR 반응조건 토끼 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 6. PCR 반응조건 여우 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

21 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 1. 소프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 소 lane 2 돼지 lane 3 양 lane 4 염소 lane 5 사슴 lane 6 말 S 그림 2. 돼지프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 소 lane 2 돼지 lane 3 양 lane 4 염소 lane 5 사슴 lane 6 말 21

22 - 유전자분석법활용 - S 그림 3. 양프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 소 lane 2 돼지 lane 3 양 lane 4 염소 lane 5 사슴 lane 6 말 S 그림 4. 염소프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 소 lane 2 돼지 lane 3 양 lane 4 염소 lane 5 사슴 lane 6 말 22

23 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 5. 사슴프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 소 lane 2 돼지 lane 3 양 lane 4 염소 lane 5 사슴 lane 6 말 S 그림 6. 말프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 소 lane 2 돼지 lane 3 양 lane 4 염소 lane 5 사슴 lane 6 말 23

24 - 유전자분석법활용 - S 그림 7. 캥거루프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 캥거루 lane 2 소 lane 3 돼지 S 그림 8. 토끼프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 토끼 lane 2 닭 lane 3 오리 lane 4 칠면조 24

25 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 9. 여우프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 여우 lane 2 돼지 lane 3 개 lane 4 토끼 lane 5 소 25

26 - 유전자분석법활용 - 2 가금류 닭 오리 칠면조 타조 거위 꿩 집비둘기 멧비둘기 메추리 참새 제비 2.1. 종 種 특이프라이머서열 닭등종특이프라이머는아래표 7 에명시된것과같다. 표 7. 닭등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 닭 SFI11-Chi-F SFI11-Chi-R CCT AAA GAC ACC CAC CTT TGT CCG TAG GAG GAT AGG TTC CAG A S 오리 SFI11-Duc-F SFI11-Duc-R CCC AGA ACC ACA ATG AGA TGA TTA AG GTA AGG GAT TCA TCT TGT TTT GGC S 칠면조 SFI11-Tur-F SFI11-Tur-R TGC CCT AAC CCC TTA AGA AAA GAA GGC ACA AGA TTT ACC AAC CCT AAA G S 타조 SFI11-Ost-F SFI11-Ost-R CCT CTA GCT CAT CCA CCC ACT TG CGG GAT GGC AAG CTT AAA TTC S 거위 SFI12-Goose-F SFI12-Goose-R GGT CAA GGT ATA GCC TAT GGA GTG GAA GA CTG CTA AAT CCG CCT TCC AGA AGT G S 꿩 SFI13-Pheasant-F SFI13-Pheasant-R CGT AAT CAC AGG CAT CAC CAT CAC T GGG TGA GTA TCA GTG CTA AGC CTA GG 152 Cytb 집비둘기 SFI13-Domestic-F SFI13-Domestic-R TTA TAG CCA CTG CAT TCG TAG GA GTT AAT GTA GGG TTA TCT ACG GAA 160 Cytb 멧비둘기 SFI13-Rufous-F SFI13-Rufous-R ATA ACC CGC TCG GTA TTT C AGC TAG GGT TAT TAG AGG AAG GAA 113 Cytb 메추리 SFI13-Quail-F SFI13-Quail-R CAC TAA TAG CCA CTG CTT TCG TAG GA GTT AGG GTA GGA TTG TCA ACT GAA 163 Cytb 참새 SFI13-Passer-F SFI13-Passer-R ATT CCT CAT CGT AGG CCT CAC ACT A GGG AGA CTA GTA GGG AGA GTA TTA ATA 167 Cytb 제비 SFI13-Barn-F SFI13-Barn-R ACT GAC CCT AGT ACA CTT AAC CCT A GGG AAG CTA GAT CGA TGA GTA GTA TA 152 Cytb 26

27 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 8 표 15 와같다. 제 2 장 표 8. PCR 반응조건 닭 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 62 5 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 9. PCR 반응조건 오리 칠면조 타조 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 63 7 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 10. PCR 반응조건 거위 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

28 - 유전자분석법활용 - 표 11. PCR 반응조건 꿩 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 68 5 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 12. PCR 반응조건 집비둘기 참새 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 13. PCR 반응조건 멧비둘기 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

29 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 표 14. PCR 반응조건 메추리 제 2 장 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 62 5 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 15. PCR 반응조건 제비 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

30 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 10. 닭프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 닭 lane 2 오리 lane 3 칠면조 lane 4 타조 S 그림 11. 오리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 닭 lane 2 오리 lane 3 칠면조 lane 4 타조 30

31 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 12. 칠면조프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 닭 lane 2 오리 lane 3 칠면조 lane 4 타조 S 그림 13. 타조프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 닭 lane 2 오리 lane 3 칠면조 lane 4 타조 31

32 - 유전자분석법활용 - S 그림 14. 거위프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 거위 lane 2 오리 lane 3 닭 lane 4 칠면조 S 그림 15. 꿩프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 꿩 lane 2 닭 lane 3 오리 lane 4 칠면조 lane 5 메추리 lane 6 집비둘기 lane 7 멧비둘기 32

33 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 16. 집비둘기프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 집비둘기 lane 2 멧비둘기 lane 3 닭 lane 4 오리 lane 5 칠면조 lane 6 메추리 lane 7 꿩 S 그림 17. 멧비둘기프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 멧비둘기 lane 2 집비둘기 lane 3 닭 lane 4 오리 lane 5 칠면조 lane 6 메추리 lane 7 꿩 33

34 - 유전자분석법활용 - S 그림 18. 메추리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 메추리 lane 2 닭 lane 3 오리 lane 4 칠면조 lane 5 꿩 lane 6 집비둘기 lane 7 멧비둘기 S 그림 19. 참새프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 참새 lane 2 메추리 lane 3 닭 lane 4 집비둘기 lane 5 멧비둘기 lane 6 꿩 lane 7 칠면조 34

35 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 20. 제비프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 제비 lane 2 메추리 lane 3 닭 lane 4 집비둘기 lane 5 멧비둘기 lane 6 참새 lane 7 오리 35

36 - 유전자분석법활용 - 3 민물어류 잉어 향어 붕어 미꾸라지 미꾸리 가물치 메기 쏘가리 3.1. 종 種 특이프라이머서열 잉어등종특이프라이머는아래표 16 에명시된것과같다. 표 16. 잉어등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 향어 SFI12-Carpio-R GTG CTA GTA GTG TAA GAG CTA GGA G 잉어및 SFI12-Carpio-F ATT TGT TAT TGC CGC CGC AAC CAT CAT 173 Cytb 붕어 SFI12-Crucian-F SFI12-Crucian-R CAA TGT AAT TGT TAC CGC CCA CGC CTT C GTA GTA ACA GGA ATG ATG GGG GAA GA 176 COI 4 미꾸라지 SFI12-Mozo-F SFI12-Mizo-R TCG GAG TTG TTC TCC TAC TTT TAG T TCC CCA GAT TCA TTG AAC CAG GGT A 155 Cytb 미꾸리 SFI12-Angui-F SFI12-Angui-R TTG GGG TAG TCC TTC TCC TGC TTG T GCC TCA AAT TCA TTG AAC TAA AGT G 155 Cytb 가물치 SFI12-Snakeh-F SFI12-Snakeh-R CCC TAT TAG GAC TCT GCC TAA TAG CAC GAG GCC TCG CCC AAT GTG TAG GTA GA 203 Cytb 메기 SFI13-Catfish-F SFI13-Catfish-R ATT CGC CAT TGT AGC CGC TAC ATT A GCC GTA AGG GCT GTG AGT AAA ACA A 165 Cytb 쏘가리 SFI13-Mandarin-F SFI13-Mandarin-R ATA CAT CGG AAA CAC CCT CGT CCA A CAC TGT TGC AGC TGC AAT GAT GAA C 121 Cytb 잉어와향어는동시검출용프라이머임. 4 COI Cytochrome Oxidase Subunit 1 36

37 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 17 표 22 와같다. 제 2 장 표 17. PCR 반응조건 잉어및향어 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 18. PCR 반응조건 붕어 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 19. PCR 반응조건 미꾸라지및미꾸리 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

38 - 유전자분석법활용 - 표 20. PCR 반응조건 가물치 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 21. PCR 반응조건 메기 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 22. PCR 반응조건 쏘가리 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

39 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 21. 잉어및향어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 잉어 lane 2 향어 lane 3 붕어 lane 4 가물치 lane 5 메기 lane 6 송어 lane 7 쏘가리 S 그림 22. 붕어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 붕어 lane 2 잉어 lane 3 가물치 lane 4 향어 lane 5 연어 lane 6 메기 39

40 - 유전자분석법활용 - S 그림 23. 미꾸라지프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 미꾸라지 lane 2 미꾸리 lane 3 꽁치 lane 4 고등어 lane 5 뱀장어 lane 6 갈치 S 그림 24. 미꾸리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 미꾸리 lane 2 미꾸라지 lane 3 꽁치 lane 4 고등어 lane 5 뱀장어 lane 6 갈치 40

41 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 25. 가물치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 가물치 lane 2 향어 lane 3 잉어 lane 4 붕어 lane 5 송어 lane 6 쏘가리 S 그림 26. 메기프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 메기 lane 2 붕어 lane 3 잉어 lane 4 가물치 lane 5 향어 lane 6 송어 lane 7 쏘가리 lane 8 동자개 41

42 - 유전자분석법활용 - S 그림 27. 쏘가리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 쏘가리 lane 2 붕어 lane 3 잉어 lane 4 송어 lane 5 향어 lane 6 메기 lane 7 동자개 42

43 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 4 해양어류 대구 청대구 명태 틸라피아 꽁치 고등어 다금바리 자바리 능성어 날치 열빙어 청어 까나리 멸치 참조기 광어 조피볼락 홍어 가오리 말쥐치 농어 성게 제 2 장 4.1. 종 種 특이프라이머서열 대구등종특이프라이머는아래표 23 에명시된것과같다. 표 23. 대구등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 대구 SFI10-D-F SFI10-D-R AAA ATA TGA GAG GTC CCG CC TAT CAC TAA GTT TTC GCT GTT ATC A S 청대구 SFI10-D-F SFI10-BD-R AAA ATA TGA GAG GTC CCG CC TAT CAC TAA GTT TTT ACT ATT ATC GT S 명태 SFI10-D-F SFI10-M-R AAA ATA TGA GAG GTC CCG CC TAT CAC TAA GTT TTC GCT GTT ATT T S 틸라피아 SFI11-Til-F SFI11-Til-R TTT AAA TTC TTT ACC CCC ATT GGC CTG CTT TTA GGC CCA CTA GAA CAT TAG S 꽁치 SFI12-Saury-F SFI12-Saury-R CTG AGG GGC AAC CGT GAT TA CTG CAA TGA TGA AGG GAA AT 152 Cytb 고등어 SFI12-Masaba-F SFI12-Masaba-R CTG CTC CTG TCT TCT TCG GCA TTT GGT ATT GGG ACA CAC CTG 211 COI 다금바리 SFI12-Spino-F SFI12-Spino-R GGA CCA AAC CAA ATG AGT GGT CAG AAA TTC TGT TGA C S 자바리 SFI12-Brune-F SFI12-Brune-R GCG CAA TCA CTT GTC TTT TAA ATA ATG TTC AGG GTA TTA ATG C S 능성어 SFI12-Septem-F SFI12-Septem-R CAT CCC CAA CAA CAG GAC AT TCG CTC TTG GTT GTG AAT GTT S 43

44 - 유전자분석법활용 - 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 날치 SFI13-Flying-F SFI13-Flying-R CTG CAA GCA GAC CAT GCT AAT TAG A TTC TGG GAG AAA AGT TCT CCT GCT S 열빙어 SFI13-Mallotus-F SFI13-Mallotus-R ATT GTG ACT CCT GTC TCT CCT GTC T TAA TCG GCA TGT GCC GGA TCA TTT S 청어 SFI13-Clupea-F SFI13-Clupea-R TTA TGC CTA GCG GCA CAA ATC TTA A TAT GTG CAT AAA TGC AGA TGA AGA A 178 Cytb 까나리 SFI13-Ammody-F SFI13-Ammody-R CTC TGT CTT ATC GCA CAA ATT CTT A TGT GCA TGT AAA GGC AAA TAA AGA A 178 Cytb 멸치 SFI13-Anchovy-F SFI13-Anchovy-R ACT AGC CAA CTG TGA ATA AGC GAC T GTT GCA ACT CTC GGC TTA AGG GTT T S 참조기 SFI13-Larimic-F SFI13-Larimic-R TGC TTT CAT TAT GCT CGC AGC CTC A TAA GAA TCG TTG TGA TGA AGT TGA T 188 COI 광어 SFI13-Halibut-F SFI13-Halibut-R ATG TTT AAT CAC CCA GAT TTT AAC C ATG TGG AGG TAA ATG CAG ATA AAG A 177 Cytb 조피볼락 SFI13-Sebastes-F SFI13-Sebastes-R ACC AAA GAA GAT CCT GTC AAG TAA C AGA TAT TCT GTT AAT TAG AGC TGC G S 홍어 SFI13-Raja-F SFI13-Raja-R CTC CAT TAA CTT CAT CAC CAC AAT T AGA AAG TTG TGT TGA GAT TAC GAT C 179 COI 가오리 SFI13-Ray-F SFI13-Ray-R CAT CGT TAT ATA TGA ATT ACC CC GGA GGG AAC CCA TTT GGC TTA CT 218 COI 말쥐치 SFI13-File-F SFI13-File-R CAC TAA AAC TGA TCA TGT AAA AGA C TAA CGC CGG ATC AGT AAG GTC AGA A S 농어 SFI13-SeaBass-F SFI13-SeaBass-R TGC TTG ATT ACT CAA ATC CTC ACA G CCC CGC CCA ATA TGT ATG TAA ATG C 185 Cytb 성게 SFI13-SeaUrchin-F SFI13-SeaUrchin-R GCA GGG ATA ACA GCG TTA TCT TT GAC TTT AAT GGT CGA ACA GAC C S 44

45 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 24 표 36 과같다. 제 2 장 표 24. PCR 반응조건 대구 청대구 명태 초기변성 Initial denaturation 94 4 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 3 분 1 보존 표 25. PCR 반응조건 틸라피아 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 26. PCR 반응조건 꽁치 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

46 - 유전자분석법활용 - 표 27. PCR 반응조건 고등어 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 28. PCR 반응조건 다금바리 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 29. 반응조건 자바리및능성어 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

47 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 표 30. PCR 반응조건 날치 청어 까나리 멸치 홍어 말쥐치 제 2 장 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 31. PCR 반응조건 열빙어 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 32. PCR 반응조건 참조기 조피볼락 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

48 - 유전자분석법활용 - 표 33. PCR 반응조건 광어 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 34 PCR 반응조건 가오리 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 35. PCR 반응조건 점농어 초기변성 Initial denaturation 95 3 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

49 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 표 36. PCR 반응조건 성게 제 2 장 초기변성 Initial denaturation 95 3 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

50 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 A B C S 그림 28. 대구 A 청대구 B 및명태 C 프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 대구 lane 2 청대구 lane 3 명태 S 그림 29. 틸라피아프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 2 틸라피아 lane 3 옥돔 lane 4 참도미 lane 5 뱀꼬돔 lane 6 고등어 50

51 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 30. 꽁치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 꽁치 lane 2 미꾸라지 lane 3 미꾸리 lane 4 고등어 lane 5 갈치 S 그림 31. 고등어특이프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 고등어 lane 2 미꾸라지 lane 3 미꾸리 lane 4 꽁치 lane 5 갈치 51

52 - 유전자분석법활용 - S 그림 32. 다금바리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 다금바리 lane 2 자바리 lane 3 능성어 lane 4 우럭 lane 5 도미 S 그림 33. 자바리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 자바리 lane 2 다금바리 lane 3 능성어 lane 4 우럭 lane 5 도미 52

53 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 34. 능성어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 능성어 lane 2 다금바리 lane 3 자바리 lane 4 우럭 lane 5 도미 S 그림 35. 날치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 날치 lane 2 청어 lane 3 열빙어 lane 4 명태 lane 5 연어 lane 6 은연어 lane 7 멸치 lane 8 성게 53

54 - 유전자분석법활용 - S 그림 36. 열빙어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 열빙어 lane 2 날치 lane 3 청어 lane 4 멸치 lane 5 까나리 S 그림 37. 청어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 청어 lane 2 날치 lane 3 열빙어 lane 4 멸치 lane 5 까나리 54

55 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 38. 까나리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 까나리 lane 2 날치 lane 3 열빙어 lane 4 멸치 lane 5 청어 S 그림 39. 멸치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 멸치 lane 2 날치 lane 3 열빙어 lane 4 까나리 lane 5 청어 55

56 - 유전자분석법활용 - S 그림 40. 참조기프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 참조기 lane 2 청어 lane 3 가자미 lane 4 보구치 백조기 lane 5 부세 조구 S 그림 41. 광어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 광어 lane 2 조피볼락 우럭 lane 3 도다리 lane 4 말쥐치 lane 5 가자미 56

57 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 42. 조피볼락프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 조피볼락 lane 2 광어 lane 3 도다리 lane 4 말쥐치 S 그림 43. 홍어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 홍어 미국산 lane 2 홍어 중국산 lane 3 홍어 칠레산 lane 4 흰가오리 lane 5 전기가오리 57

58 - 유전자분석법활용 - S 그림 44. 가오리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 흰가오리 lane 2 전기가오리 lane 3 홍어 S 그림 45. 말쥐치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 말쥐치 lane 2 명태 lane 3 꽁치 lane 4 고등어 lane 5 도다리 lane 6 광어 lane 7 조피볼락 우럭 58

59 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 46. 농어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 농어 lane 2 가자미 lane 3 우럭 lane 4 광어 lane 5 도미 lane 6 민어 lane 7 숭어 S 그림 47. 성게프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 성게 lane 2 멍게 lane 3 연어 lane 4 날치 lane 5 열빙어 59

60 - 유전자분석법활용 - 5 회유어류 연어및송어 5.1. 종 種 특이프라이머서열 연어및송어종특이프라이머는아래표 37 에명시된것과같다. 표 37. 연어및송어종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 연어 SFI12-Salmon-F TTC GTA GGC TAC GTT CTT CCA TGA SFI12-Salmon-R TAA AAA TAG AAG ATG GAG TAC TGT G 219 Cytb 송어 SFI12-Trout-F SFI12-Trout-R GCC ATA CTC CTA GGC CTA ACA TCC TT AGA AGT GTG TAG GAT GGG GAC AAC C 231 Cytb 은연어 Onchorhynchus kisutch 에서는 band 확인이되지않음. 60

61 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 38 및표 39 와같다. 제 2 장 표 38. PCR 반응조건 연어 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 39. PCR 반응조건 송어 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

62 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 48. 연어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 연어 lane 2 송어 lane 3 향어 lane 4 잉어 lane 5 붕어 lane 6 쏘가리 S 그림 49. 송어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 송어 lane 2 연어 lane 3 향어 lane 4 잉어 lane 5 붕어 lane 6 쏘가리 62

63 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 6 다랑어류및새치류 제 2 장 6.1. 종 種 특이프라이머서열 다랑어류및새치류종특이프라이머는아래표 40 에명시된것과같다. 표 40. 다랑어류및새치류종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 다랑어류 SFI12-Tuna-F SFI12-Tuna-R TTG CCG GCA ATC TGG CCC ACG CAG G TGT TTG ATA CTG AGA AAT AGC TGC A 149 COI 새치류 SFI12-Marlin-F SFI12-Marlin-R GTC ACC AAT GAT ACT GAA GC GTT CAG TTT TCA AAG TGT TC 367 COII 5 5 COII Cytochrome Oxidase Subunit Ⅱ 63

64 - 유전자분석법활용 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 41 및표 42 와같다. 표 41. PCR 반응조건 다랑어류 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 63 5 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 42. PCR 반응조건 새치류 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

65 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 50. 다랑어류프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 참다랑어 lane 2 황다랑어 lane 3 황새치 lane 4 돛새치 lane 5 청새치 lane 6 고등어 lane 7 꽁치 S 그림 51. 새치류프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 돛새치 lane 2 녹새치 lane 3 청새치 lane 4 황새치 lane 5 황다랑어 lane 6 참다랑어 lane 7 꽁치 65

66 - 유전자분석법활용 - 7 심해성어류 기름갈치꼬치및흑갈치꼬치 7.1. 종 種 특이프라이머서열 기름갈치꼬치및흑갈치꼬치종특이프라이머는아래표 43 에명시된것과같다. 표 43. 기름갈치꼬치및흑갈치꼬치종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 기름갈치꼬치 SFI12-pretio-F SFI12-pretio-R GGG CTT AAC TGT CTC CTT TTT CA CCA AAG ACA TTA GGG CAT ACG S 흑갈치꼬치 SFI12-flavo-F SFI12-flavo-R TGC AAA AGC GGG GAT ACC C AGT TTG GTC AGA AAT TCT GTT TGC S 기름갈치꼬치및흑갈치꼬치는일반적으로기름치 Oilfish 로알려져있음. 66

67 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 44 및표 45 와같다. 제 2 장 표 44. PCR 반응조건 기름갈치꼬치 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 45. PCR 반응조건 흑갈치꼬치 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

68 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 52. 기름갈치꼬치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 기름갈치꼬치 lane 2 흑갈치꼬치 lane 3 참다랑어 lane 4 황다랑어 lane 5 눈다랑어 lane 6 청새치 lane 7 황새치 lane 8 녹새치 lane 9 돛새치 S 그림 53. 흑갈치꼬치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 흑갈치꼬치 lane 2 기름갈치꼬치 lane 3 참다랑어 lane 4 황다랑어 lane 5 눈다랑어 lane 6 청새치 lane 7 황새치 lane 8 녹새치 lane 9 돛새치 68

69 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 8 갑각류 게 새우 바닷가재 제 2 장 8.1. 종 種 특이프라이머서열 게등종특이프라이머는아래표 46 에명시된것과같다. 표 46. 게등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 게 SFI12-Crab-F SFI12-Crab-R TTA CAA TGT TGT AGT CAC AGC TCA T AGA GTT AAT GAA GGA GGA AGA AGT C 174 COI 새우 SFI12-Shrimp-F SFI12-Shrimp-R CAC ATT ATT GGA TCC TAA GTC CA GGT ATC CTT ATA ATG CAG CAG TT 231 NADH 6 바닷가재 SFI13-Lobster-F SFI13-Lobster-R AAG CCT CAT TGG TGA CGA TCA AAT AAA TCT TAT ATT GTT CAT ACG GGG 172 COI 6 NADH NADH Dehydrogenase Subunit 69

70 - 유전자분석법활용 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 47 ~ 표 49 와같다. 표 47. PCR 반응조건 게 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 48. PCR 반응조건 새우 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 49. PCR 반응조건 바닷가재 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

71 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 54. 게프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 게 lane 2 새우 lane 3 가재 lane 4 고등어 lane 5 꽁치 S 그림 55. 새우프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 새우 lane 2 게 lane 3 고등어 lane 4 꽁치 lane 5 가재 71

72 - 유전자분석법활용 - S 그림 56. 바닷가재프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 바닷가재 lane 2 게 lane 3 새우 lane 4 킹크랩 72

73 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 9 패류 전복 백합 소라 제 2 장 9.1. 종 種 특이프라이머서열 전복등종특이프라이머는아래표 50 에명시된것과같다. 표 50. 전복등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 전복 SFI12-Abalone-F SFI12-Abalone-R ACT CTG CTC TTA ACA TCA GGC GCA TGA GAT TCC GGC TAG GTG TAG GGA G 141 COI 백합 SFI12-Baekhap-F SFI12-Baekhap-R GGT GCT TCT TCT ATT ATG TCT GGT A TGT GTT AAA ATT ACG ATC TGT CAA A 192 COI 소라 SFI12-Sora-F SFI12-Sora-R GAG CTT TAG TGA TTT GAT AAA T CAT AAA TTA ATG GAT TGA CTT CCA S 73

74 - 유전자분석법활용 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 51 및표 52 와같다. 표 51. PCR 반응조건 전복및백합 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존 표 52. PCR 반응조건 소라 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

75 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 57. 전복프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 전복 lane 2 백합 lane 3 가리비 lane 4 키조개 lane 5 논우렁이 lane 6 백고동 lane 7 다슬기 lane 8 홍합 S 그림 58. 백합프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 백합 lane 2 전복 lane 3 가리비 lane 4 키조개 lane 5 논우렁이 lane 6 백고동 lane 7 다슬기 lane 8 홍합 75

76 - 유전자분석법활용 - S 그림 59. 소라프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 소라 lane 2 전복 lane 3 백합 lane 4 가리비 lane 5 키조개 76

77 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 10 두족류 오징어 한치 주꾸미 낙지 제 2 장 종 種 특이프라이머서열 오징어등종특이프라이머는아래표 53 에명시된것과같다. 표 53. 오징어등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 오징어 SFI13-Cuttle-F SFI13-Cuttle-R GTA GTT ACT GGC TCA CGG ATT CAT AAA TTC CTA GAT AAA GGG GGA TA 239 COI 한치 SFI10-S-F SFI10-H-R GCG GTA TTT TAA CTG TAC TAA GGT AGC ATA A CCC CAA TTA AAA TTT ATA GAA CAC A 234 COI 주꾸미 SFI12-Jjuccu-F SFI12-Jjuccu-R GCT CAT ATA GGA CCC TCC GTC G GTG ATT GCA CCA GCA AGT ACT GG 212 COI 낙지 SFI12-Minor-F SFI12-Minor-R CTG AAT TAG GTC AAC CAG GTT CAC AAG GTT AGG GAA GGA GGA AGA AGT C 217 COI 77

78 - 유전자분석법활용 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 54 표 57 과같다. 표 54. PCR 반응조건 오징어 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 55. PCR 반응조건 한치 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 56. PCR 반응조건 주꾸미 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

79 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 표 57. PCR 반응조건 낙지 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 분 1 보존

80 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 60. 오징어프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 오징어 lane 2 한치 lane 3 주꾸미 lane 4 낙지 lane 5 문어 S 그림 61. 한치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 2 한치 lane 3 4 오징어 80

81 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 62. 주꾸미프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 주꾸미 lane 2 오징어 lane 3 낙지 lane 4 한치 lane 5 꼴뚜기 lane 6 문어 S 그림 63. 낙지프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 낙지 lane 2 오징어 lane 3 주꾸미 lane 4 한치 lane 5 꼴뚜기 81

82

83 - 유전자분석법활용 - ⅡChapter 종특이프라이머를 이용한유전자증폭 (PCR) Ⅱ Ⅱ. 식물성원료

84 - 유전자분석법활용 - Ⅱ Ⅱ. 식물성원료 1 곡류 쌀 밀 메밀 1.1. 종 種 특이프라이머서열 쌀등종특이프라이머는아래표 58 에명시된것과같다. 표 58. 쌀등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 쌀 SFI11-Ric-F SFI11-Ric-R CAA CGC AAC GTC TTG TAT GG TGA ACC CTG AGT TCC TCT CG 123 센트로미어 밀 wheat-its-f wheat-its-r PRP8F PRPds6R TCG GGA TGC GGC A ATT GAT AAA GCG AGG A GCA CCC ATG ATG AGT ACT ACT ATT CTG TA TGC AAA CGA ATA AAA GCA TGT G 111 ITS 117 GMO 7 메밀 SFI11-Buc-F SFI11-Buc-R GAG CCC TCT CGT AGA GTC CG GGA GTA GGA AGG AAG CAA GAG 138 알러젠관련 7 논문참조밀종특이프라이머 target gene proline-rich protein PRP An Endogenous Reference Gene of Common and Durum Wheat for Detection of Genetically Modified Wheat Food Hyg. Saf. Sci. Vol. 53 No. 5 pp

85 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 59 표 62 와같다. 제 2 장 표 59. PCR 반응조건 쌀 초기변성 Initial denaturation 94 2 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 32 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 3 분 1 보존 표 60. PCR 반응조건 밀 -ITS 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 61. PCR 반응조건 밀 -GMO 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

86 - 유전자분석법활용 - 표 62. PCR 반응조건 메밀 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 2 분 1 보존

87 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 64. 쌀프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 쌀 lane 2 밀 lane 3 메밀 S 그림 65. 밀프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 밀 lane 2 찹쌀 lane 3 현미 Lane 4 점정현미 lane 5 찰현미 Lane 6 검정찰현미 lane 7 메밀 87

88 - 유전자분석법활용 - S 그림 66. 밀프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 밀 lane 2 찹쌀 lane 3 현미 Lane 4 점정현미 lane 5 찰현미 Lane 6 검정찰현미 lane 7 메밀 S 그림 67. 메밀프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 쌀 lane 2 밀 lane 3 메밀 88

89 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 2 서류 고구마및타피오카 제 2 장 2.1. 종 種 특이프라이머서열 고구마및타피오카종특이프라이머는아래표 63 에명시된것과같다. 표 63. 고구마및타피오카종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 고구마 ib-286-f ib-286-r AGC CAC TCC AAC AGC ACA TA GGT TTC CCA ATC AGC AAT TC 105 SSR 타피오카 SSRY26-F SSRY26-R TGC TAA TTG CAG GAA ATA GGA T GCA GCT TTT TAG CAT AAC AAT CAA 121 SSR 89

90 - 유전자분석법활용 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 64 및표 65 과같다. 표 64. PCR 반응조건 고구마 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 65. PCR 반응조건 타피오카 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 단 PCR 반응액조제시 MgCl 2 의농도는 2.5 mm 로함. 90

91 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 68. 고구마프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 고구마 lane 2 밀 lane 3 옥수수 lane 4 감자 lane 5 도토리 S 그림 69. 타피오카프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 타피오카 lane 2 고구마 lane 3 감자 lane 4 현미 lane 5 옥수수 91

92 - 유전자분석법활용 - 3 콩류 검정콩 3.1. 종 種 특이프라이머서열 검정콩등종특이프라이머는아래표 66 에명시된것과같다. 표 66. 검정콩등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 검정콩 SFI12-Blackbe-F SFI12-Blackbe-R CGT AAC TGC ACA GAG CTT AAG TTA TTA AGT CCA ATG TGG CTT AAC TTT TAG A 297 F3'H 8 녹두 SFI13-Mung bean-f SFI13-Mung bean-r KSG CAA CAA CTT GTG TGA GAT GCA AGA GCC GAG ATA 201 ITS 팥 SFI13-Red bean-f SFI13-Red bean-r TCA CCT CTC CAG GCA AAA C ACA CCA AGT ATC GCA TTT 202 ITS 8 F3'H Flavonoid 3'Hydroxylase 92

93 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 67 ~ 표 69 와같다. 제 2 장 표 67. PCR 반응조건 검정콩 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 68. PCR 반응조건 녹두 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 69. PCR 반응조건 팥 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

94 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 70. 검정콩프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 검정콩 lane 2 흰콩 lane 3 강남콩 lane 4 팥 lane 5 흑미 lane 6 찰흑미 S 그림 71. 녹두프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 녹두 lane 2 옥수수 lane 3 감자 lane 4 고구마 Lane 5 팥 lane 6 밀 lane 7 완두 94

95 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 72. 팥프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 팥 lane 2 옥수수 lane 3 감자 lane 4 고구마 Lane 5 녹두 lane 6 밀 lane 7 완두 95

96 - 유전자분석법활용 - 4 견과종실류 땅콩 참깨 들깨 올리브 아몬드 해바라기 밤 잣 호두 4.1. 종 種 특이프라이머서열 땅콩등종특이프라이머는아래표 70 에명시된것과같다. 표 70. 땅콩등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 땅콩 PM53-F PM53-R CCT ATC CTA TGG GTC ACT AGC C GCT TGT GCT CAT CTT GAG TTT T 120 SSR 참깨 ZM-25-F ZM-25-R CCT GAA CCT TCT CTC TCT CTC ACT GAC AGT ACG AAT TCA CCA 220 SSR 들깨 GBPFM75-F GBPFM75-R CAT AGT TCA TGG CTT CCA CC CCT GAG CAC AGA AAC AGA TCA 150 SSR 올리브 UD F UD R TTC CCC TTA TTC AAT GTG AAC C ACT GCA GTT TGG GAA TCA AA 103 SSR 아몬드 SFI12-Almond-F SFI12-Almond-R AAA GAA ACC ACT AAA GCA GCT ATG CAT AGA GGG TGT GCA CAT GG 103 CYP79D16 해바라기 SFI12-Sunflow-F SFI12-Sunflow-R GCC GGG ACC GAA GCA TTT GT ATT TTG TCA ACA TGA CAT CC 104 ITS2 9 밤 SFI13-Chestnut-F SFI13-Chestnut-R TAG AAC ATT TTG CCG AAG TC CAT TSC CAT AAA TTG ACA AGG 181 matk 잣 SFI13-Pine nut-f SFI13-Pine nut-r TTC TCG TCG AAA TTC ACT GA GGA TAA TTG ATG AGA ACA GAC 211 matk 호두 SFI13-Juglans-F SFI13-Juglans-R CTT TTT GAG CGA ATT TA TAT ATC TAA GAA GGG TT 245 matk 9 ITS2 Internal Transcribed Spacer 2 96

97 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 71 표 78 과같다. 제 2 장 표 71. PCR 반응조건 땅콩 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 72. PCR 반응조건 참깨 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 73. PCR 반응조건 들깨 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

98 - 유전자분석법활용 - 표 74. PCR 반응조건 올리브 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 75. PCR 반응조건 아몬드 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 76. PCR 반응조건 해바라기 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

99 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 표 77. PCR 반응조건 밤 제 2 장 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 78. PCR 반응조건 잣 호두 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

100 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 73. 땅콩프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 땅콩 lane 2 올리브 lane 3 포도 lane 4 옥수수 lane 5 들깨 lane 6 호박 lane 7 콩 lane 8 현미 lane 9 해바라기 lane 10 야자 lane 11 고추 lane 12 참깨 S 그림 74. 참깨프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 참깨 lane 2 고추 lane 3 호박 lane 4 올리브 lane 5 포도 lane 6 옥수수 lane 7 들깨 lane 8 콩 lane 9 현미 lane 10 해바라기 lane 11 야자 lane 12 땅콩 100

101 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 75. 들깨프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 들깨 lane 2 올리브 lane 3 포도 lane 4 옥수수 lane 5 참깨 lane 6 호박 lane 7 콩 lane 8 현미 lane 9 해바라기 lane 10 땅콩 lane 11 야자 lane 12 고추 S 그림 76. 올리브프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 올리브 lane 2 포도 lane 3 옥수수 lane 4 들깨 lane 5 참깨 lane 6 호박 lane 7 콩 lane 8 현미 lane 9 해바라기 lane 10 땅콩 lane 11 야자 lane 12 고추 101

102 - 유전자분석법활용 - S 그림 77. 아몬드프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 아몬드 lane 2 살구 lane 3 복숭아 lane 4 앵두 lane 5 땅콩 lane 6 올리브 lane 7 체리 lane 8 자두 lane 9 블루베리 lane 10 수박 lane 11 호박 S 그림 78. 해바라기프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 해바라기 lane 2 포도 lane 3 옥수수 lane 4 참깨 lane 5 들깨 lane 6 호박 lane 7 콩 lane 8 현미 lane 9 땅콩 lane 10 야자 lane 11 고추 102

103 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 79. 밤프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 밤 lane 2 고구마 lane 3 울금 lane 4 호두 lane 5 잣 lane 6 도토리 S 그림 80. 잣프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 잣 lane 2 호두 lane 3 포도 lane 4 호박 lane 5 해바라기 lane 6 땅콩 103

104 - 유전자분석법활용 - S 그림 81. 호두프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 호두 lane 2 잣 lane 3 아몬드 lane 4 땅콩 lane 5 밤 104

105 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 5 과실류 복숭아 딸기 앵두 포도 대추 제 2 장 5.1. 종 種 특이프라이머서열 복숭아등종특이프라이머는아래표 79 에명시된것과같다. 표 79. 복숭아등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 복숭아 UDP F UDP R CCT TGA CCT ATT TGT TCG TCA ACT AGT CAA ACA ATC CCC CG 174 SSR 딸기 ARSFL-27-F ARSFL-27-R GCG AAG CCC AGA CTC AAT TAC C GCG TAC CCG CCA TTG TTA C 164 SSR 앵두 SFI12-Sweetch-F SFI12-Sweetch-R ATC CTT GGC CAA CAC TTC AG GAG AGT CGT TTT AGA CTT TAC ATT G 236 ITS1 포도 SFI12-Grape-F SFI12-Grape-R ATG GAA GCT GTT CTA ACA AAA ACA TAG GTT TAT CCT TCA TCC TTT CTG G 104 trnltrnf 10 대추 SFI13-date-F SFI13-date-R AAA CCG CGC CAA GGA ACA CCT GAT GGT TCA CGG GAT TCT GC 196 ITS 10 trnl-trnf trna-leu trnl -trna-phe trnf 105

106 - 유전자분석법활용 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 80 표 84 와같다. 표 80. PCR 반응조건 복숭아 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 81. PCR 반응조건 딸기 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 82. PCR 반응조건 앵두 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

107 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 표 83. PCR 반응조건 포도 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 84. PCR 반응조건 대추 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

108 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 82. 복숭아프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 복숭아 lane 2 아몬드 lane 3 살구 lane 4 앵두 lane 5 땅콩 lane 6 올리브 lane 7 체리 lane 8 자두 lane 9 블루베리 S 그림 83. 딸기프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 딸기 lane 2 복분자 lane 3 블루베리 lane 4 포도 lane 5 체리 lane 6 당근 108

109 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 84. 앵두프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 앵두 lane 2 땅콩 lane 3 복숭아 lane 4 살구 lane 5 아몬드 lane 6 올리브 lane 7 체리 lane 8 자두 lane 9 블루베리 S 그림 85. 포도프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 포도 lane 2 땅콩 lane 3 올리브 lane 4 옥수수 lane 5 들깨 lane 6 참깨 lane 7 호박 lane 8 콩 lane 9 현미 lane 10 해바라기 lane 11 야자 lane 12 고추 lane 13 블루베리 109

110 - 유전자분석법활용 - S 그림 86. 대추프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 대추 lane 2 포도 lane 3 블루베리 110

111 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 6 채소류 배추 파 쪽파 토마토 호박 알로에 미나리 부추 오이 고추냉이 겨자 제 2 장 6.1. 종 種 특이프라이머서열 배추등종특이프라이머는아래표 85 에명시된것과같다. 표 85. 배추등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 배추 SFI12-Cabbage-F SFI12-Cabbage-R ATC CTT GGC CAA CAC TTC AG GAG AGT CGT TTT AGA CTT TAC ATT G 173 ITS1 쪽파 SFI12-Spronion-R TGT GTT AAC TCG ATA CAC CAT T 파및 SFI12-Spronion-F ACC CAC CTA CGG TAA ACT TAC AC 136 ITS1 토마토 TGS1543-F TGS1543-R GAG GTG GTT GGT AAG TGG TGG TTC AAG TTT CAA GGC TGG CT 132 SSR 호박 CMTm48-F CMTm48-R AAG CCT TTG GGG ACC TTT AC TTG AAA CCT TCA AAC AAG AAA TTG 101 SSR 알로에 SFI13-Aloe-F SFI13-Aloe-R AAG GAC GAC CGC GAA CCA TT CCT CCG ACC GWT GTG TTC CTT 175 ITS 미나리 SFI13-Water parsley-f SFI13-Water parsley-r ACG ACC CGC TAA CGT GTA AAC TAC AYG AAG CGC GCG YGC ATT 193 ITS 부추 SFI13-Chives-F SFI13-Chives-R TAT TGT TTA GAA GGG TTT CC AAG TGT CGC ATT TCG CTA 235 ITS 오이 SFI13-Cucumber-F SFI13-Cucumber-R TCG TAC CGG CCT CGG TGG TGC TTC AAA GAC TCG GTG GTT CAC 178 ITS 고추냉이 SFI13-Wasabi-F SFI13-Wasabi-R GTY TYG GTY GGA TCG TRC GCA TTG CCG AGA GTC GTT TTA GAC T 166 ITS 겨자 SFI13-Mustard-F SFI13-Mustard-R TAT CTC GGC TGG GTC ATG CGT G TTG CCG AGA GTC GTT TTA GAC T 167 ITS 파및쪽파는동시검출용프라이머임. 111

112 - 유전자분석법활용 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 86 표 94 와같다. 표 86. PCR 반응조건 배추 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 87. PCR 반응조건 파및쪽파 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 88. PCR 반응조건 토마토 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

113 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 표 89. PCR 반응조건 호박 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 90. PCR 반응조건 알로에 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 91. PCR 반응조건 미나리및부추 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

114 - 유전자분석법활용 - 표 92. PCR 반응조건 오이 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 53 5 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 93. PCR 반응조건 고추냉이 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 94. PCR 반응조건 겨자 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

115 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 87. 배추프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 배추 lane 2 무 lane 3 마늘 lane 4 양파 S 그림 88. 파및쪽파프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 파 lane 2 쪽파 lane 3 양파 lane 4 마늘 lane 5 생강 115

116 - 유전자분석법활용 - S 그림 89. 토마토프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 토마토 lane 2 고추 lane 3 적파프리카 lane 4 청피망 S 그림 90. 호박프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 호박 lane 2 당근 lane 3 현미 lane 4 옥수수 lane 5 밀 116

117 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 91. 알로에프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 알로에 lane 2 오이 lane 3 양파 lane 4 배추 lane 5 마늘 Lane 6 호박 lane 7 수박 lane 8 참외 S 그림 92. 미나리프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 미나리 lane 2 배추 lane 3 녹차 lane 4 시금치 lane 5 클로렐라 Lane 6 스피루리나 117

118 - 유전자분석법활용 - S 그림 93. 부추프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 부추 lane 2 파 lane 3 쪽파 S 그림 94. 오이프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 오이 lane 2 알로에 lane 3 양파 lane 4 배추 lane 5 마늘 Lane 6 호박 lane 7 수박 lane 8 참외 118

119 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 95. 고추냉이프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 고추냉이 lane 2 겨자 lane 3 후추 lane 4 무 S 그림 96. 겨자프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 겨자 lane 2 고추냉이 lane 3 후추 lane 4 무 119

120 - 유전자분석법활용 - 7 근채류 인삼 더덕 도라지 마 마늘 양파 무 생강 당근 7.1. 종 種 특이프라이머서열 인삼등종특이프라이머는아래표 95 에명시된것과같다. 표 95. 인삼등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 인삼 SFI11-Gin-F SFI11-Gin-R GAT CCC GGA CGT AAT CCT G TTT ATT TCT CTT TCA AAT TTC GCC 150 광합성관련 더덕 SFI11-Deo-F SFI10-Deo-R CCT GGA CGT GAA GAA TAA TCA AC AAT TTA GAA AAC CCC TTT TCC TAT T 113 광합성관련 도라지 SFI11-Bal-F SFI11-Bal-R GTA ATC CTG GAC GTG AAG AAT AAT AT AAT TTA GAA AAC CCC TTT TCC TAT T 137 광합성관련 마 SFI11-Hem-F SFI11-Hem-R GAT CCC GGA CGT AAT CCT G TGC TTA TGA TCA CTT GAT AGT TTT GAA 181 광합성관련 마늘 GB-ASM-080-F GB-ASM-080-R AAT CTC CCT CCA AAG TCC C CTG TAT TTT GTG TAA AGC ATC A 180 SSR 양파 API73-F API73-R GTT TCT TGG ATG CGA TTT TG GCA ACT GTA TAA TCA GCA TAT GC 280 SSR 무 A137-F A137-R GGG AGA GCT ATT CCC GAC TT CTC CCC AAG TCC AAC CAG TA 266 및 또는 333 생식관련 생강 SFI12-Ginger-F SFI12-Ginger-R CTC GGA ATC AAT CAA TCA ACC TCA CGA GAT TCT GCA ATT CAC AC 113 ITS1 당근 SFI12-Carrot-F SFI12-Carrot-R CTA GAT GCG CCA AGG AAG TAA AAC TTG CGT TCA AAG ACT CG 194 ITS1 120

121 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 96 표 101 과같다. 제 2 장 표 96. PCR 반응조건 인삼 마 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 3 분 1 보존 표 97. PCR 반응조건 더덕 도라지 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 3 분 1 보존 표 98. PCR 반응조건 마늘 양파 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 단 PCR 반응액조제시 MgCl 2 의농도는 1.5 mm 로함. 121

122 - 유전자분석법활용 - 표 99. PCR 반응조건 무 초기변성 Initial denaturation 95 4 분 1 변성 denaturation 결합 annealing 신장 extension 초 30초 2분 10 결합 cycle 은 0.8 씩감소 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 72 2 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 100. PCR 반응조건 생강 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 101. PCR 반응조건 당근 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 67 5 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

123 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 2 장 S 그림 97. 인삼프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 인삼 lane 2 더덕 lane 3 도라지 lane 4 마 S 그림 98. 더덕프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 인삼 lane 2 더덕 lane 3 도라지 lane 4 마 123

124 - 유전자분석법활용 - S 그림 99. 도라지프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 인삼 lane 2 더덕 lane 3 도라지 lane 4 마 S 그림 100. 마프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 인삼 lane 2 더덕 lane 3 도라지 lane 4 마 124

125 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 101. 마늘프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 2 마늘 lane 3 4 양파 lane 5 6 마늘및양파혼합물 S 그림 102. 양파프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 2 마늘 lane 3 4 양파 lane 5 6 마늘및양파혼합물 125

126 - 유전자분석법활용 - S 그림 103. 무프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 마늘 lane 2 양파 lane 3 무 S 그림 104. 생강프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 생강 lane 2 강황 lane 3 마늘 lane 4 양파 lane 5 파 126

127 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 105. 당근프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 당근 lane 2 적무 lane 3 고추 lane 4 토마토 lane 5 체리 lane 6 앵두 lane 7 적파프리카 lane 8 딸기 127

128 - 유전자분석법활용 - 8 버섯류 팽이버섯 표고버섯 양송이버섯 영지버섯 새송이버섯 느타리버섯 8.1. 종 種 특이프라이머서열 팽이버섯등종특이프라이머는아래표 102 에명시된것과같다. 표 102. 팽이버섯등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 팽이버섯 SFI13-Enokitake-F SFI13-Enokitake-R ATG TAA CGA ATG TCA TTG ATT A TGA CAC TCA AAC AGG CAT GC 210 ITS 표고버섯 SFI13-Shiitake-F SFI13-Shiitake-R ATA GAA TGW TCT KGT TAT TGGG TGA CAC TCA AAC AGG CAT GC 210 ITS 양송이버섯 SFI13-Agaricus-F SFI13-Agaricus-R CAT GGG CTA TGC CTA TGA AA TGA CAC TCA AAC AGG CAT GC 190 ITS 영지버섯 SFI13-Ganoderma-F SFI13-Ganoderma-R TTG CGA TGT AAC ACA TCT ATA T TGA CAC TCA AAC AGG CAT GC 188 ITS 새송이버섯 SFI13-King oyster-f SFI13-King oyster-r CTC AAA CTC ACT CTG GTT TTT CC GGT TAG AGA GCC AGA CTC TAT TC 198 ITS 느타리버섯 SFI13-oyster-F SFI13-oyster-R CTC AAA CTC ACT TTG GTT TCT TT TTG CGG ACG ATT RGA GAG CTG 206 ITS 128

129 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 103 및표 104 와같다. 표 103. PCR 반응조건 팽이버섯 표고버섯 양송이버섯 영지버섯및새송이버섯 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 104. PCR 반응조건 느타리버섯 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

130 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 106. 팽이버섯프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 팽이버섯 lane 2 목이버섯 lane 3 양송이버섯 lane 4 표고버섯 lane 5 새송이버섯 lane 6 느타리버섯 lane 7 영지버섯 S 그림 107. 표고버섯프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 표고버섯 lane 2 목이버섯 lane 3 양송이버섯 lane 4 팽이버섯 lane 5 새송이버섯 lane 6 느타리버섯 lane 7 영지버섯 130

131 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 108. 양송이버섯프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 양송이버섯 lane 2 목이버섯 lane 3 팽이버섯 lane 4 표고버섯 lane 5 새송이버섯 lane 6 느타리버섯 lane 7 영지버섯 S 그림 109. 영지버섯프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 영지버섯 Lane 2 꽃영지버섯 lane 3 목이버섯 lane 4 양송이버섯 lane 5 표고버섯 lane 6 새송이버섯 lane 7 느타리버섯 lane 8 팽이버섯 131

132 - 유전자분석법활용 - S 그림 110. 새송이버섯프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 새송이버섯 lane 2 목이버섯 lane 3 팽이버섯 lane 4 표고버섯 lane 5 양송이버섯 lane 6 느타리버섯 lane 7 영지버섯 S 그림 111. 느타리버섯프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 느타리버섯 lane 2 목이버섯 lane 3 팽이버섯 lane 4 표고버섯 lane 5 새송이버섯 lane 6 양송이버섯 lane 7 영지버섯 132

133 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 9 기타 녹차 시금치 클로렐라 태국칡 과라나 흰민들레 민들레 제 2 장 9.1. 종 種 특이프라이머서열 녹차등종특이프라이머는아래표 105 에명시된것과같다. 표 105. 녹차등종특이프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 녹차 SFI10-G-F SFI10-G-R CAT TAC CTC CAA TCT CCG CAC GCT CAT CTC CTC TTT 224 SSR 시금치 SFI10-SP-F SFI10-SP-R ACT AGT GAG GGG GCC AGT TTA CA CAG CTG AGG CTC TTC TTC TTC TTC 138 SSR 클로렐라 SFI10-CL-F SFI10-CL-R GGC GCA CCC GTA GGA T GCA GGT GGT AAA TCC CAT CT S 11 태국칡 SFI12-Miri-F SFI12-Miri-R TCT CAC ACG ACA CGT TCT G TCT CGT TGA GAG CGT CTC CCC GAA 216 ITS2 과라나 SFI13-Guarana-F SFI13-Guarana-R CAT CGT TGC CCC CAA ACC T CTC CCA GCC CTC GGA CCC TCT 219 ITS 흰민들레 SFI13-coreanum-F SFI13-coreanum-R TCA CGC ATC GCG TCG CTC CTG TCT TTT TTG AGG GCT TCC CTG G 196 ITS 민들레 SFI13-Platycarpum-F SFI13-Platycarpum-R CTG TGT GTC GTG AGC TGC A GAT TTT CAA GCT GGG CTA G 195 ITS 11 18S 18S rdna 133

134 - 유전자분석법활용 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 106 표 110 과같다. 표 106. PCR 반응조건 녹차및시금치 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 107. PCR 반응조건 클로렐라 초기변성 Initial denaturation 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 표 108. PCR 반응조건 태국칡 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 30 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존 단 PCR 반응액조제시 MgCl 2 의농도는 1.5 mm 로함. 134

135 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 표 109. PCR 반응조건 과라나 초기변성 Initial denaturation 94 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 40 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 표 110. PCR 반응조건 흰민들레및민들레 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 60 5 초 35 신장 extension 초 최종신장 elongation 72 5 분 1 보존

136 - 유전자분석법활용 PCR 반응결과 S 그림 112. 녹차프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 녹차 lane 2 시금치 lane 3 클로렐라 S 그림 113. 시금치프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 녹차 lane 2 시금치 lane 3 클로렐라 136

137 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 114. 클로렐라프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 녹차 lane 2 시금치 lane 3 클로렐라 S 그림 115. 태국칡프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 태국칡 Pueraria mirifica lane 2 국산칡 Pueraria lobata lane 3 태국칡 Butea superba 137

138 - 유전자분석법활용 - S 그림 116. 과라나프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 과라나 lane 2 커피 lane 3 카카오 lane 4 단풍나무 S 그림 117. 흰민들레프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 흰미들레 lane 2 민들레 lane 3 서양민들레 138

139 Ⅱ. 종특이프라이머를이용한유전자증폭 PCR 제 2 장 S 그림 118. 민들레프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 민들레 lane 2 흰민들레 lane 3 서양민들레 139

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141 - 유전자분석법활용 - ⅢChapter 일반 (universal) 프라이머를이용한 유전자증폭 (PCR)

142 - 유전자분석법활용 - Ⅲ 일반 (universal) 프라이머를이용한유전자증폭 (PCR) Ⅲ Ⅰ. 동물성원료 1 LCO1490/HCO2198 프라이머를이용한방법 본프라이머는일반적으로동물의미토콘드리아유전자 mtdna 에존재하는 Cytochrome c oxidase COI 에존재하는부위를증폭하기위한방법임 LCO1490/HCO2198 프라이머서열 COI 부위를증폭하기위한프라이머는아래표 111 에명시된것과같다. 표 111. COI 프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 미토콘드리아 COI LCO1490 HCO2198 GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 약 700 Folmer 등 PCR 반응액의조성 PCR을위한반응액의조성은아래표 112와같다. 표 112. PCR 반응액의조성 성분 Stock 용액농도 최종농도 튜브 1회분량 Taq DNA polymerase 5 U/ μl 1.0 U 0.2 μl 완충액 10 x 1 x 2.0 μl MgCl 2 25 mm 2.0 mm 1.6 μl dntps 2.5 mm 200 μm 1.6 μl 프라이머 각 10 pmol 각 10 pmol 각 1.0 μl 주형DNA 50 ng/ μl 50 ng 1.0 μl 멸균증류수 11.6 μl 전체량 20.0 μl 142 반응액의조성은모든항목에공통으로적용되며경우에따라 MgCl 2 의농도를 1.0~2.5 mm 로조정할수있다.

143 Ⅲ. 일반 universal Ⅱ. 프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 113 과같다. 제 3 장 표 113. PCR 반응조건 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 95 1 분 결합 annealing 40 1 분 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 PCR 반응결과 S 그림 119. LCO1490/HCO2198 프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 양 lane 2 염소 lane 3 소 lane 4 말 lane 5 사슴 lane 6 돼지 lane 7 오리 lane 8 닭 lane 9 타조 lane 10 칠면조 143

144 - 유전자분석법활용 - 2 VF2/FISH R2 프라이머를이용한방법 본프라이머는일반적으로동물의미토콘드리아에존재하는 Cytochrome c oxidase COI 에존재하는부위를증폭하기위한방법이며어류에주로이용된다 VF2/FISH R2 프라이머서열 COI 부위를증폭하기위한프라이머는아래표 114 에명시된것과같다. 표 114. COI 프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 미토콘드리아 COI VF2 FISH R2 TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA ATC AGA A 약 Zhang PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 115 와같다. 표 115. PCR 반응조건 초기변성 Initial denaturation 95 5 분 1 변성 denaturation 94 1 분 결합 annealing 1 분 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존 단 결합온도는종에따라최적의온도는달리하였음 청어 청대구및명태 이상 40 대구및우럭 55 다랑어 54 양 염소 소 말 사슴 돼지 오리 닭 타조및칠면조 이상

145 Ⅲ. 일반 universal Ⅱ. 프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 3 장 S 그림 120. VF2/FISH R2 프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 양 lane 2 염소 lane 3 소 lane 4 말 lane 5 사슴 lane 6 돼지 lane 7 오리 lane 8 닭 lane 9 타조 lane 10 칠면조 S 그림 121. VF2/FISH R2 프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 청어 lane 2 명태 lane 3 대구 lane 4 청대구 lane 5 송어 lane 6 다랑어 lane 7 우럭 145

146 - 유전자분석법활용 - 3 L14724/H15915 프라이머를이용한방법 본프라이머는일반적으로동물의미토콘드리아에존재하는 Cytochrome b Cytb 에존재하는부위를증폭하기위한방법임 L14724/H15915 프라이머서열 Cytb 부위를증폭하기위한프라이머는아래표 116 에명시된것과같다. 표 116. 프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 미토콘드리아 Cytb L14724 H15915 CGA AGC TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G AAC TGC AGT CAT CTC CGG TTT ACA AGA C 약 Irwin 등 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 117 과같다. 표 117. PCR 반응조건 초기변성 Initial denaturation 94 4 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 44 1 분 35 신장 extension 72 1 분 30 초 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

147 Ⅲ. 일반 universal Ⅱ. 프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 3 장 S 그림 122. L14724/H15915 프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 양 lane 2 염소 lane 3 소 lane 4 말 lane 5 사슴 lane 6 돼지 147

148 - 유전자분석법활용 - Ⅲ Ⅱ. 식물성원료 1 trnh/psba 프라이머를이용한방법 본프라이머는일반적으로식물의엽록체에존재하는부위를증폭하기위한방법임 trnh/psba 프라이머서열 엽록체에존재하는유전자의일부분을증폭하기위한프라이머는아래표 118 에명시된것과같다. 표 118. 프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 엽록체 trnh psba CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C 종에따라차이있음 Mattia 등 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 119 와같다. 표 119. PCR 반응조건 초기변성 Initial denaturation 94 7 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

149 Ⅲ. 일반 universal Ⅱ. 프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 3 장 S 그림 123. trnh/psba 프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 마늘 lane 2 양파 lane 3 녹차 lane 4 시금치 lane 5 무 149

150 - 유전자분석법활용 - 2 rpob 프라이머를이용한방법 본프라이머는일반적으로식물의엽록체에존재하는부위를증폭하기위한방법임 rpob 프라이머서열 엽록체에존재하는유전자의일부분을증폭하기위한프라이머는아래표 120 에명시된것과같다. 표 120. 프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 엽록체 rpob 1f rpob 4r AAG TGC ATT GTT GGA ACT GG GAT CCC AGC ATC ACA ATT CC 약 600 Mattia 등 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 121 과같다. 표 121. PCR 반응조건 초기변성 Initial denaturation 94 7 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

151 Ⅲ. 일반 universal Ⅱ. 프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 3 장 S 그림 124. rpob 프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 마늘 lane 2 양파 lane 3 녹차 lane 4 시금치 lane 5 무 151

152 - 유전자분석법활용 - 3 rbcl 프라이머를이용한방법 본프라이머는일반적으로식물의엽록체에존재하는부위를증폭하기위한방법임 rbcl 프라이머서열 엽록체에존재하는유전자의일부분을증폭하기위한프라이머는아래표 122 에명시된것과같다. 표 122. 프라이머정보 구분프라이머명염기서열 5`-3` 예상크기 bp 비고 엽록체 rbcl 1F rbcl 724R ATG TCA CCA CAA ACA GA AAC TCG CAT GTA CCT GCA GTA GC 약 Mattia 등 PCR 반응조건 PCR 을위한반응조건은아래표 123 과같다. 표 123. PCR 반응조건 초기변성 Initial denaturation 94 7 분 1 변성 denaturation 초 결합 annealing 초 35 신장 extension 72 1 분 최종신장 elongation 72 7 분 1 보존

153 Ⅲ. 일반 universal Ⅱ. 프라이머를이용한유전자증폭 PCR PCR 반응결과 제 3 장 S 그림 125. rbcl 프라이머를이용한 PCR 결과. Lane 1 마늘 lane 2 양파 lane 3 녹차 lane 4 시금치 lane 5 무 153

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155 - 유전자분석법활용 - ⅣChapter 유전자증폭산물의 확인

156 - 유전자분석법활용 - Ⅳ 유전자증폭산물의확인 1. 전기영동에따른결과의판정 PCR 증폭결과는아가로스겔 agarose gel 등을이용한전기영동에의해확인할수있다 영동조의준비오염등의위험방지를위해실험용고무장갑을착용하여조작한다. 먼저겔조제용틀 gel maker 을조립한다. 겔의농도는전기영동할 DNA 길이와아가로스겔의종류에따라결정한다. 본실험에서는전기영동하고자하는대상이검체에서추출한 DNA와크기가 200 bp 전후의 PCR 증폭산물이므로 이에적합한아가로스겔을제조사의설명서를참고하여사용한다. 필요량의아가로스를칭량하여전기영동완충액을넣고가열하여아가로스를녹여사용한다. 전기영동완충액으로는 0.5 ~ 1배의 TAE Tris-ace tate/edta 완충액또는 TBE Tris-borate/EDTA 완충액을사용할수있으며 아가로스겔의제조시사용된완충액과같은것을전기영동과정및겔의염색과정에서도사용하여야한다. 또한 200 bp 이하의작은크기의 PCR 증폭산물을전기영동하므로아가로스는겔농도가높은것을사용한다 PCR 산물의크기에따라 1.5~2.5% 사용. 아가로스가충분히녹아겔이균일하게되면 55 정도로식혀서겔조제용틀에넣고콤 comb 을끼운후 30분정도방치하여충분히겔을굳힌다. 전 前 염색법은겔조제용틀에넣기전에아가로스겔 100 ml당 5 μl의에티디움브로마이드 EtBr 용액 10 mg / ml 을넣고잘혼합한다. 겔이굳으면겔이잠기도록전기영동완충액을부어콤을조심스럽게뺀다. 겔을전기영동조에장착하고 겔의윗면이충분히잠길정도로전기영동완충액을채운다 전기영동 PCR 증폭산물에염색액 gel loading buffer 을혼합후겔의각홈에시료를조심스럽게넣으며 양끝의각홈에는 PCR 증폭산물의크기를식별하기에적당한표식 DNA Marker DNA 을넣는다. 시료를주입후사용하는전기영동조의규격에맞는전압에서전기영동한다. 염색액에함유된 BpB Bromophenol Blue 가겔의 1/2에서 2/3가량진행하면전기영동을멈추고화상분석기등을이용하여전기영동결과를확인한다. 156

157 Ⅱ. Ⅳ. 유전자증폭산물의확인 제 4 장 겔의염색후 後 염색법의경우전기영동완충액 100 ml당 5 μl의에티디움브로마이드 EtBr 용액 10 mg / ml 을넣은염색액에영동이끝난겔을즉시넣은후 용기를진탕기 shaker 에올려놓고가볍게진동시키면서 20 30분정도염색한후다시 30분정도전기영동완충액에넣어탈색시킨다 단 전염색법은이조작은불필요하며바로결과를확인할수있다. 주의사항 에티디움브로마이드 Ethidium bromide 시약은 2중나선 DNA의나선사이에삽입되는형광시약으로강력한돌연변이원성물질이므로취급에주의해야한다. 취급시반드시고무장갑을끼고마스크를착용하여야한다. 폐액은에티디움브로마이드처리용의기구를사용하는것이좋으나 그럴수없는경우에는반드시활성탄 Activated charcoal 등으로처리한후에폐기하고고농도의경우처리업자에게위탁한다 결과의확인화상분석기나 Trans-illuminator에랩을깔고 그위에염색이끝난겔을올려놓고자외선을조사한다. CCD 카메라에의한촬영으로유형을확인하며 목적하는위치에서밴드 band 가얻어졌는지를 확인한후결과는화상데이터로보존해둔다. 폴라로이드카메라를사용할경우겔의사진을촬영하여보관한다. 157

158

159 - 유전자분석법활용 - ⅤChapter 유전자증폭산물의 결과판정

160 - 유전자분석법활용 - Ⅴ 유전자증폭산물의결과판정 1. 결과판정 1.1. PCR 산물확인종특이프라이머 Species-specific primer 를사용한 PCR 결과산물의생성유무및크기를확인하여종을판별한다. 다만 필요시에는 PCR 산물에대하여염기서열을결정하고유전자 DB를이용하여종 동정을할수있다 염기서열분석 일반프라이머 universal primer 를사용한경우 PCR 산물은염기서열을결정하고 NCBI 등유전자 DB 를사용하여최종동정을실시한다. 예시 COI 부위를증폭할수있는일반프라이머 LCO1490/HCO2198 를이용하여육류를대상으로 PCR 후염기서열을결정하고아래의방법으로수행한다. 가 BioEdit 등의프로그램을이용하여염기서열을편집한다. 160

161 Ⅱ. Ⅴ. 유전자증폭산물의결과판정 나 Blastn 등의프로그램을이용하여염기서열을입력한다. 제 5 장 다 입력된자료는 DB 내의염기서열자료와비교한다. 161

162 - 유전자분석법활용 - 라 염기서열을분석하여가장근접한종과의일치도를나타낸다. 본데이터는소고기 학명 Bos taurus 로판명된경우임 162

163 - 유전자분석법활용 - ⅥChapter 참고문헌

164 - 유전자분석법활용 - 1 박용춘, 김미라, 신준호, 김규헌, 이재황, 조태용, 이화정, 이상재, 한상배 : PCR 을이용한 식품중알레르기유발물질검출법개발, 한국식품위생안전성학회지, (2), 124~129 2 박용춘, 신승정, 이호연, 김용상, 김미라, 이상재, 이화정, 한상배 : 식품중사용금지원료인 Aphanizomenon flos-aquae 검출법개발및응용, 한국식품위생안전성학회지, (2), 188~193 3 박용춘, 김미라, 김용상, 이호연김규헌, 이재황, 김재이, 이상재, 이화정 : 전분의주원료 판별을위한유전자분석법개발및적용, 한국식품위생안전성학회지, (2), 181~187 4 박용춘, 김미라, 임지영, 박영은, 신준호, 황초롱, 임잔디, 김규헌, 이재황, 조태용, 이화정, 한상배 : 고추식육추출가공품의사용원료확인을위한유전자추출방법의비교및검토, 한국식품위생안전성학회지, 2012, 27(2), 146~151 5 박용춘, 진상욱, 임지영, 김규헌, 이재황, 조태용, 이화정, 한상배, 이상재, 이광호, 윤혜성 : 일반프라이머를이용한 PCR 의식품원료진위판별에적용, 한국식품위생안전성학회지, 2012, 27(3), 317~324 6 박용춘, 안치영, 진상욱, 임지영, 김규헌, 이재황, 조태용, 이화정, 박건상, 윤혜성 : 종특이 프라이머를이용한식육가공품의사용원료판별법, 한국식품위생안전성학회지, 2012, 27(1), 68~73 7 박용춘, 임지영, 김미라, 박영은, 임잔디, 황초롱, 김규헌, 이재황, 조태용, 이화정, 이상재, 한상배 : 고추다대기혼입불량고춧가루판별법개발, 한국식품위생안전성학회지, 2012, 27(2), 182~187 8 진봄비 : 한국산버드나무속 (Salix) 식물의 DNA barcode marker 변이연구, 대구대학교 석사학위논문, 2011, 9 박종근, 신기현, 신성철, 정구용, 정의룡 : 미토콘드리아 12S rrna 유전자의종특이적 PCR-RFLP Fingerprinting 를이용한식육원료의판별, 한국축산식품학회지, 2007, 27(2), 209~

165 Ⅱ. Ⅵ. 참고문헌 10 허만규, 윤혜정, 최주수 : trnl-trnf 서열에의한한국귤나무속과두근연식물종의 계통분류학적연구, 생명과학회지, 2011, 21(10), 1452~1459 제 6 장 11 홍은정, 김미화, 박수지, 강지원, 김동술, 이화정, 김은정, 이재황, 김승희, 이광호, 노봉수 : 유사식품인오징어젓갈과한치젓갈의판별을위한 MS- 전자코분석, 산업식품공학, 2011, 15(2), 122~ 홍은정, 김미화, 박수지, 김지은, 김동술, 이화정, 김은정, 이재황, 김승희, 이광호, 노봉수 : 황태채, 북어채및대구채판별을위한전자코분석, 산업식품공학, 2011, 15(2), 162~ Anderson, S. de Bruijn M. H., Coulson, A. R., Eperon, I. C., Sanger, F. & Young, I. G. Complete sequence of bovine mitochondrial DNA. Conserved features of the mammalian mitochondrial genome. J. Mol. Biol. 156(4), (1982) 14 Antonella, P., Cinzia, M., Francesco, C. & Antonio, B. Identification of Virgin Olive Oil from Different Cultivars by Analysis of DNA Microsatellites. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, (2004) 15 Arong, L., Aibing, Z., Simon, Y. W., Ho, W. X., Yanzhou, Z., Weifeng, S., Stephen, L. C. & Chaodong, Z. Potential Efficacy of Mitochondrial Genes for Animal DNA Barcoding: A Case Study Using Eutherian Mammals. BMC Genomics, 12(84), (2011) 16 Baldwin, B. G. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: An example from the compositae. Molecular Phylogenetics and Evolution. 1, 3-16 (1992) 17 Bellagamba, F., Moretti, V. M., Comincini, S. & Valfre, F. Identification of species in animal feedstuffs by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of mitochondrial DNA. J. Agric. Food. Chem. 49(8) (2001) 18 Brown, W. M., George, M., Jr. & Wilson, A. C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, (1979) 165

166 - 유전자분석법활용 - 19 Busconi, M., Foroni, C., Corradi, M., Bongiorni, C., Cattapan, F. & Fogher, C. DNA Extraction from Olive Oil and Its Use in the Identification of the Production Cultivar. Food Chemistry. 83, (2003) 20 Buteler, M. I., Jarret, R. L. & LaBonte, D. R. Sequence characterization of microsatellites in diploid and polyploid Ipomoea. Theor Appl Genet. 99, (1999) 21 Buteler, M. I., Jarret, R. L. & LaBonte, D. R. Sequence characterization of microsatellites in diploid and polyploid Ipomoea. Theor Appl Genet. 99, (1999) 22 Calvo, J. H., Rodellar, C., Zaragoza, P. & Osta, R. Beef and bovine-derived material identification in processed and unprocessed food and feed by PCR amplification. J. Agric. Food. Chem. 50(19), (2002) 23 Christopher, P. & Meyer, G. P. DNA Barcoding: Error Rates Based on Comprehensive Sampling. PLoS Biology. 3, 12 (2005) 24 Cipriani, G., Marrazzo, M. T., Marconi, R., Cimato, A. & Testolin, R. Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting and reveal polymorphism within ancient cultivars. Theor Appl Genet. 104, (2002) 25 Cipriani, G., Marrazzo, M. T., Marconi, R., Cimato, A., Testolin, R. Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting and reveal polymorphism within ancient cultivars. Theor Appl Genet. 104, (2002) 26 Fabrice, T. Celia, M. & Catherine, H. Food and forensic molecular identification: update and challenges. TRENDS in Biotechnology. 23, (2005) 27 Fabrice, T., Celia, M. & Catherine, H. Food and Forensic Molecular Identification: Update and Challenges. TRENDS in biotechnology. 23, 7 (2005) 166

167 Ⅱ. Ⅵ. 참고문헌 29 Filipe, P., Joao, C. & Antonio, A. Identification of Species with DNA-Based Technology: Current Progress and Challenges. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 2, (2008) 제 6 장 30 Fischer, D. & Bachmann, K. Onion microsatellites for germplasm analysis and their use in assessing intra- and interspecific relatedness within the subgenus Rhizirideum. Theor Appl Genet. 101, (2000) 31 Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R. & Vrijenhoek, R. DNA Primers for Amplification of Mitochondrial Cytochrome C Oxidase Subunit I from Diverse Metazoan Invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechology. 3(5), (1994) 32 Gianmarco, F., Milena, A., Beatrice, C., Manuela, L. & Giovanni, B.. Species Identification Through DNA "Barcodes". Genetic testing and molecular biomarkers. 13(3), (2009) 33 Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M. & Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theor Appl Genet 117, (2008) 34 Gracia, Z. & Lila, V. Cloning of the Pleiotropic T Locus in Soybean and Two Recessive Alleles That Differentially Affect Structure and Expression of the Encoded Flavonoid 3 Hydroxylase. Genetics. 163, (2003) 35 Gudmundur, H., Kristina, K., Monica, L., Antonios, M., Viggo, M., Manfred, N., Serge, P., Fausto, T., Cemal, T., Moleyur, N. V., Hannes, W., Dietmar, B. Identifying Fishes through DNA Barcodes and Microarrays. PLoS ONE. 5, e12620 (2010) 36 Guohao, H., Ronghua, M., Melanie, N., Guoqing, G., Roy, N. P. & Prakash, C. S. Microsatellites as DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). BMC Plant Biology. 3, (2003) 167

168 - 유전자분석법활용 - 37 He, G., Meng, R., Newman, M., Gao, G., Roy, N. P. & Prakash, C. S. Microsatellites as DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). BMC Plant Biology. 3, (2003) 38 Hold, G. L., Russell, V. J., Pryde, S. E., Rehbein, H., Quinteiro, J., Vidal, R., Rey-Mendez, M., Sotelo, C. G., Perez-Martin, R. I., Santos, A. T. & Rosa, C. Development of a DNA-based method aimed at identifying the fish species present in food products. J. Agric. Food. Chem. 49(3), (2001) 39 Hollingsworth, P. M., Graham, S. W. & Little, D. P. Choosing and Using a Plant DNA Barcode. PLoS one. 6, 5 (2011) 40 Sieh, H. M., Chiang, H. L., Tsai, L. C., Lai, S. Y., Huang, N. E., Linacre, A. & Lee, J. C. Cytochrome b gene for species identification of the conservation animals. Forensic. Sci. Int. 122(1), 7-18 (2001) 41 Ubalkova, Z., Kralik, P., Tremlova, B. & Rencova, E. Methods of gadoid fish species identification in food and their economic impact in the Czech Republic:a review. Veterinarni Medicina. 52, (2007) 42 Urng-Yi, W., Mung-Pei, T., Ming-chung, T. & Sin-Che, L. Universal Primers for Amplification of the Complete Mitochondrial 12S rrna Gene in Vertebrates. Zoological Studies. 39(1), (2000) 43 Yuk-Sang, K., Eun-Hee, Y., Seung-Woo, Y., Byoung-Hwa, K. & Tae-Yong, K. Rapid Identification of Probiotic Lactobacillus Species by Multiplex PCR Using Species-Specific Primers Based on the Region Extending from 16S rrna through 23S rrna. FEMS Microbiology Letters. 239, (2004) 44 Nnocenzo, M. & Enzo, P. Recovery and Characterisation of DNA from Virgin Olive Oil. European Food Research and Technology. 214, (2002) 45 Vanova, N. V., Zemlak, T. S., Hanner, R. H. & Herbert, P. D. N. Universal Primer Cocktails for Fish DNA Barcoding, Molecular Ecology Notes. 10, 1111 (2007) 168

169 Ⅱ. Ⅵ. 참고문헌 46 Eong-Hye, K., Uik, S., Hyun-Cheol, L., Jae-Chul, K. & So-Deuk, P. Phylogenetic Analysis od Herbaceous Peony Using Ribosomal DNA Partial Sequencing and RAPDs. Korean J. Breed. 29, (1997) 제 6 장 47 Jun, C., Qi, L., Lingfeng, K. & Hong, Y. How DNA Barcodes Complement Taxonomy and Explore Species Diversity: The Case Study of a Poorly Understood Marine Fauna. PLoS one. 6, 6 (2011) 48 Junbin, Z. Species Identification of Marine Fishes in China with DNA Barcoding. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 10, 1155 (2011) 49 Kenta, S., Erika, A., Hiroyuki, F., Akio, O., Shusei, S., Yasukazu, N., Satoshi, T., Shigemi, S., Tsuyuko, W., Yoshie, K., Hisano, T., Tsunakazu, F., Manabu, Y. & Sachiko, I. An interspeciwc linkage map of SSR and intronic polymorphism markers in tomato. Theor Appl Genet. 121, (2010) 50 Kenta, S., Erika, A., Hiroyuki, F., Akio, O., Shusei, S., Yasukazu, N., Satoshi, T., Shigemi, S., Tsuyuko, W., Yoshie, K., Hisano, T., Tsunakazu, F., Manabu, Y. & Sachiko, I. An interspecific linkage map of SSR and intronic polymorphism markers in tomato. Theor Appl Genet. 121, (2010) 51 Kim, Y. C., Lee, C. S., Hwang, S. W., Kim, S. J., Lee, Y. O., Yoon, S. W., Seo, J. H. & Nam, Y. S. Comparative Evaluation on Qualitative PCR using Different Extraction Methods for Nucleic Acids on Soybean and Corn Processed Foods. J. Fd Hyg. Safety. 18, 6-13 (2003) 52 Rcmar, P. & Rencova, E. Identification of bovine-specific DNA in feedstuffs. J. Food. Prot. 64(1), (2001) 53 Umar, S., Kahlon, T., & Chaudhary, S. A Rapid Screening for Adulterants in Olive Oil using DNA Barcodes. Food Chemistry. 127, (2011) 54 Yuhyun, K., Young-pyo, L., Heerae, L., Taeho, H., Soon-Kee, S. & Sunggil, K. Identification of Rfd1, A Novel Restorer-of-Fertility Locus for Cytoplasmic Male- 169

170 - 유전자분석법활용 - Sterility caused by DCGMS Cytoplasm and Development of Simple PCR Markers Linked to The Rfd1 Locus in Radish(Raphanus sativus L.). Euhytica. 175, (2010) 55 Lahiff, S., Glennon, M., O'Brien, L., Lyng, J., Smith, T., Maher, M. & Shilton, N. Species-specific PCR for the identification of ovine, porcine and chicken species in meta and bone meal (MBM). Mol. Cell. Probes. 15(1), (2001) 56 Lewers, K. S. & Styan, S. M. N. Strawberry GenBank-derived and genomic simple sequence repeat (SSR) markers and their utility with strawberry, blackberry, and red and black raspberry. JASHS January 130, (2005) 57 Maria, T. B. & Alessandra, D. Animal Species Identification in Food Products: Evolution of Biomolecular Methods. The Veterinary Journal. 10, 1016 (2010) 58 Ins-Lopes, P., Gomes, S., Santos, E. & Guedes-Pinto, H. DNA Markers for Portuguese Olive 59. Oil Fingerprinting. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56, (2008) 59 Ba, R. E. C., Stephenson, P., Edwards, K., Melzer, S., Nkumbira, J., Gullberg, U., Apel, K., Gale, M., Tohme, J. & Fregene, M. Simple sequence repeat (SSR) markers survey of the cassava (Manihot esculenta Crantz) genome: towards an SSR-based molecular genetic map of cassava. Theor Appl Genet. 102, (2001) 60 Callum, J., Clarke, A., Pither-Joyce, M., Shaw, M., Butler, R., Brash, D., Scheffer, J., Sims, I., Sjaak van Heusden & Shigyo, M. et al. Genetic mapping of a major gene affecting onion bulb fructan content. Theor Appl Genet. 112, (2006) 61 Ichiaki, Y., Atsushi, N., Jun, I., Yasuharu, T., Mohammed, A. H., Takeshi, Y. & Yumiko, Y. Molecular Identification of Species and the Geographic Origin of Seafood. Fisheries for Global Welfare and Environment. 5, (2008) 62 Irkin, E. V. & Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 71, (2007) 170

171 Ⅱ. Ⅵ. 참고문헌 63 Onaghan, M. T., Balke, M., Gregory, T. R. & Vogler, A. P. DNA-based Species Delineation in tropical Beetles Using Mitochondrial and Nuclear Markers. Philosophical Transactions of The Royal Society B. 360, (2005) 제 6 장 64 Ontiel-Sosa, J. F., Ruiz-Pesini, E., Montoya, J., Roncales, P., Lopez-Perez, M. J. & Perez-Martos, A. Direct and highly species-specific detection of pork meat and fat in meat products by PCR amplification of mitochondrial DNA. J. Agric. Food. Chem. 48(7) (2000) 65 Yers, M. J., Friedman, S. L., Farrell, D. E., Dove-Pettit, D. A., Bucker, M. F., Kelly, S., Madzo, S., Campbell, W., Wang, R. F., Paine, D. & Cerniglia, C. E. Validation of a polymerase chain reaction method for the detection of rendered bovine-derived materials in feedstuffs. J. Food. Prot. 64(4), (2001) 66 Am Hee Kim, Hye Jung An, Ji Young Hyun, Soon Ho Choi, and Chee Hark Harn. Application of Simple Sequence Repeats (SSR) Analysis for Determining the Degree of Purity and Variety Identification from Pepper F1 Varieties. SOL. PS-78 (2007) 67 Icolas, H., Robert, H., Erling, H., Nicholas, E. M., Eric, T., Mary, B., Douglas, W., Pierre, D., Allen, C., Paul, B., Junbin, Z., Julien, A. & Louis, B. Identifying Canadian Freshwater Fishes through DNA Barcodes. PLoS ONE. 3, e2490 (2008) 68 Hiai, Y. & Watabe, S. Identification of fish species in dried fish products by immunostaining using antimyosin light chain antiserum. Food Research International. 36, (2003) 69 Park, Y. J., Dixit, A., Ma, K. H., Lee, J. K., Lee, M. H., Chung, C. S., Nitta, M., Okuno, K., Kim, T. S. Cho, E. G. & Rao, V. R. Evaluation of genetic diversity and relationships within an on-farm collection of Perilla frutescens (L.) Britt. using microsatellite markers. Genet Resour Crop 55, (2008) 70 Paul, D. N., Hebert, A. C., Shelley, L. B. & Jeremy, R. d. Biological Identifications through DNA Barcodes. Proc. R. Soc. Lond. B. 270, (2003) 171

172 - 유전자분석법활용 - 71 Pineiro, C., Barros-Velazquez J., Perez-Martin R. I. & Gallardo, J. M. Specific enzyme detection following isoelectric focusing as a complimentary tool for the differentiation of related Gadoid fish species. Food Chemistry. 70, (2000) 72 Ineiro, C., Sotelo, C. G., Medina, I., Gallardo, J. M. & Perez-Martin, R. I. Reversed phase HPLC as a method for the identification of gadoid fish species. Zeitschrift fur Lebensmittel- Untersuchung und-forschung, 204, (1997) 73 Rakoczy-Trojanowska, M. & Bolibok, H. Characteristics and comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants. Cell Mol Biol Lett. 9, (2004) 74 Ratnasingham, S. & Hebert. P. D. N. Barcoding Bold: The Barcode of Life Data System. Molecular Ecology Notes. 7, (2007) 75 Ryosuke, Y., Motoshige, Y., Jong, L., Kristian, R., von, S., Glenn, A. C., Marianne, B. S., Adrienne, R., William, S. D., Simon, R. M. J. & Ben, F. K. EST and Mitochondrial DNA Sequences Support a Distinct Pacific Form of Salmon Louse, Lepeophtheirus salmonis. Mar Biotechnol. 10, (2008) 76 Sasimanas, U., Piyachat, M., Komsan, A., Duangtip, A., Kornsorn, S. & Kiattawee, C. Identification of species (meat and blood samples) using nested-pcr analysis of mitochondrial DNA. African Journal of Biotechnology. 10, (2011) 77 Shu-Biao W., Michelle, G., Wirthensohn, P. H. & John, P. G. Margaret Sedgley High resolution melting analysis of almond SNPs derived from ESTs. Theor Appl Genet. 118, 1-14 (2008) 78 Silvia, N., Enrico, N., Giulia, E., Roberto, M., Tomaso, P., David, L., Erickson, W., John, K. & Gianni, B. DNA Barcoding as a Reliable Method for the Authentication of Commercial Seafood Products. Original scientific paper. (2012) 79 Simona, P., Matteo, B., Caterina, A., Corrado, F. & Nelson, M. Storage-time Effects on Olive Oil DNA Assessed by Amplified Fragments Length Polymorphisms. Food Chemistry. 123, (2010) 172

173 Ⅱ. Ⅵ. 참고문헌 80 Springer, M. S., Hollar, L. J. & Burk, A. Compensatory Substitutions and the Evolution of the Mitochondrial 12S rrna Gene in Mammals. Mol. Biol. Evol. 12(6), (1995) 제 6 장 81 Sunggil, K., Heerae, L., Suhyung, P., Kang-Hee, C., Soon-kee, S., Dae-Geun, O. & Ki-Taek, K. Identification oh A Novel Mitochondrial Genome Type and Development oh Molecular Markers for Cytoplasm Classification in Radish(Raphanus sativus L.). Theor Appl Genet. 115, (2007) 82 Sussie, D., Kevin, A. G., Anne, G. E. S., Bjørghild, B. S. & John, B. T. Forensic identification of severely degraded Atlantic salmon (Salmo salar) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) tissues. Investigative Genetics. 1, 12 (2010) 83 Tajima, K., Enishi, O., Amari, M., Mitsumori, M., Kajikawa, H., Kurihara, M., Yanai, S., Matsui, H., Yasue, H., Mitsuhashi, T., Kawashima, T. & Matsumoto, M. PCR detection of DNAs of animal origin in feed by primers based on sequences of short and long interspersed repetitive elements. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, (2002) 84 Ulrich, G. M. and LaReesa, W. AFLP genotyping and fingerprinting. TREE. 14, (1999) 85 Verkaar, E. L. C., Nijman, I. J., Boutaga, K. & Lenstra, J. A. Differentiation of cattle species in beef by PCR-RFLP of mitochondrial and satellite DNA. Meat. Sci. 60(4), (2002) 86 Wei, W., Qi, X., Wang, L., Zhang, Y., Hua, W., Li, D., Lv, H. & Zhang, X. Characterization of the sesame (Sesamum indicum L.) global transcriptome using Illumina paired-end sequencing and development of EST-SSR markers. BMC Genomics. 12, 451 (2011) 87 Wenliang, W., Xiaoqiong, Q., Linhai, W., Yanxin, Z., Wei, H., Donghua, L., Haixia, L. & Xiurong, Z. Characterization of the sesame (Sesamum indicum L.) global transcriptome using Illumina paired-end sequencing and development of EST-SSR markers. BMC Genomics. 12, 451 (2011) 173

174 - 유전자분석법활용 - 88 Williams, J., Kubelik, A. R., Livak, K., Rafalski, J. & Tingey, S. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl Acids Res. 18, (1990). 89 Wolstenholme, D. R. Animal mitochondrial DNA: structure and evolution. Int. Rev. Cytol. 141, (1992) 90 Wunsch, A. & Hormaza, J. I. Molecular characterisation of sweet cherry (Prunus avium L.) genotypes using peach [Prunus persica (L.) Batsch] SSR sequences. Heredity 89, (2002) 91 Yong-Jin P., Anupam, D., Kyung-Ho M., Ju-Kyung L., Myoung-Hee L., Chan- Sik C., Miyuki, N., Kazutoshi, O., Tae-San K., Eun-Gi C., V. Ramanatha, R. Evaluation of genetic diversity and relationships within an on-farm collection of Perilla frutescens (L.) Britt. using microsatellite markers. Genet Resour Crop. 55, (2008) 174

175 - 유전자분석법활용 - ⅦChapter 부록

176 - 유전자분석법활용 - 그림 126. 동물세포에존재하는미토콘드리아유전자의구조 출처 en.wikipedia.org 그림 127. 식물세포에존재하는엽록체유전자의구조 출처 Plant Systematics 3rd Edition 176

177 Ⅱ. Ⅶ. 부록 제 7 장 그림 128. 바코드유전자의종류 Chen s. et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species

178 - 유전자분석법활용 - 표 124. 식품중사용원료진위판별법마련현황 10 ~ 13 년 연도 총계 년 8 11 년 년 년 45 식품원료 동물성 식물성 축산물 수산물 연도총계 10 년 11 년 12 년 13 년 소 돼지 축산물 20 - 양 염소 사슴 말 닭 오리 칠면조 타조 캥거루 거위 꿩 집비둘기 멧비둘기 메추리 토끼 참새 여우 제비 식품원료 동물성 수산물 45 대구 청대구 명태 오징어 한치 틸라피아 잉어 향어 붕어 미꾸라지 미꾸리 가물치 꽁치 고등어 다금바리 자바리 능성어 연어 송어 다랑어류 새치류 기름갈치꼬치 흑갈치꼬치 게 새우 전복 백합 소라 주꾸미 낙지 메기 쏘가리 참조기 광어 우럭 말쥐치 멸치 바닷가재 까나리 날치 열빙어 청어 홍어 가오리 점농어 성게 식물성 54 녹차 시금치 클로렐라 쌀 밀 메밀 인삼 도라지 더덕 마 마늘 양파 무 고구마 타피오카 검정콩 땅콩 참깨 들깨 올리브 아몬드 해바라기 복숭아 딸기 앵두 포도 배추 파 쪽파 토마토 호박 생강 당근 태국칡 양송이버섯 팽이버섯 표고버섯 새송이버섯 느타리버섯 영지버섯 고추냉이 겨자 알로에 오이 미나리 부추 녹두 팥 밤 잣 대추 호두 흰민들레 민들레 과라나 178

179

180 본지침서는불량식품의사용원료진위판별업무수행에도움을드리고자 개발하였으며, 판별법관련내용을인용할때에는반드시식품의약품안전처 ( 식품의약품안전평가원 ) 의동의를얻어야합니다. 식품중사용원료진위판별지침서 유전자분석법활용 발행일발행인편집위원장편집위원발행처 2013 년 12 월 왕진호 이상재 장영미 김상엽 김재이 박용춘 김규헌 장혜숙 이재황 정유경 김미라 김용상 이호연 식품의약품안전평가원식품위해평가부신종유해물질팀 충북청원군오송읍오송생명2로 187 전화 전송

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182 M I N I S T R Y O F F O O D A N D D R U G S A F E T Y