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pissn 1229-1153 J. Fd Hyg. Safety Vol. 27, No. 3, pp. 317~324 (2012) Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.

1 pissn J. Fd Hyg. Safety Vol. 27, No. 3, pp. 317~324 (2012) Journal of Food Hygiene and Safety Available online at 일반프라이머를이용한 PCR 의식품원료진위판별에적용 박용춘 * 진상욱 임지영 김규헌 이재황 조태용 이화정 한상배 이상재 이광호 윤혜성 식품의약품안전청식품의약품안전평가원식품위해평가부식품감시과학팀 Application for Identification of Food Raw Materials by PCR using Universal Primer Yong-Chjun Park*, Sang-Ook Jin, Ji-Young Lim, Kyu-Heon Kim, Jae-Hwang Lee, Tae-Yong Cho, Hwa-Jung Lee, Sang-Bae Han, Sang-Jae Lee, Kwang-Ho Lee, and Hae-Seong Yoon Scientific Food Investigation Team, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food & Drug Safety Evaluation, Food & Drug Administration, 187 Osongsaengmyeong2-ro, Osong-eup, Cheongwon-gun, Chungcheongbuk-do , Korea (Received March 5, 2012/Revised July 8, 2012/Accepted September 17, 2012) ABSTRACT - In order to determine an authenticity of food ingredient, we used DNA barcode method by universal primers. For identification of animal food ingredients, L490/HCO2198 and VF2/FISH R2 designed for amplifying cytochrome c oxidase subunit1 () region and L14724/H15915 for cytochrome b (cyt b) region on mitochondrial DNA were used. Livestock (cow, pig, goat, sheep, a horse and deer) was amplified by L490/HCO 2198, VF2/FISH R2 and L14724/H15915 primers. Poultry (chicken, duck, turkey and ostrich) was amplified by L490/HCO 2198 and VF2/FISH R2 primers. But, Fishes (walleye pollack, herring, codfish, blue codfish, trout, tuna and rockfish) were only amplified by VF2/FISH R2 primers. For plant food ingredients, 3 types of primers (trnh/ psba, rpob 1F/4R and rbcl 1F/724R) have been used an intergenic spacer, a RNA polymerase beta subunit and a ribulose bisphosphate carboxylase region on plastid, respectively. Garlic, onion, radish, green tea and spinach were amplified by trnh/psba, rpob 1F/4R and rbcl 1F/724R. The PCR product sizes were same by rpob 1F/4R and rbcl 1F/724R but, the PCR product size using trnh/psba primer was different with others for plants each. We established PCR condition and universal primer selection for 17 item's raw materials for foods and determine base sequences aim to PCR products in this study. This study can apply to determine an authenticity of foods through making an comparison between databases and base sequences in gene bank. Therefore, DNA barcode method using universal primers can be a useful for species identification techniques not only raw materials but also processed foods that are difficult to analyze by chemical analysis. Key words: Universal primer, PCR (Polymerase Chain Reaction), DNA barcode, raw material 값싼식품원료를의도적으로혼합하거나표시사항을허위로기재한 EMA(Economically Motivated Adulteration) 식품의제조 유통사례가급증함에따라미국식품의약품청 ( 및영국식품기준청 ( 등에서는 EMA 방지를위한노력을하고있다. EMA 식품의경우서류검토, 관능및육안분석방법등에의하여사용원료를확인할수있으나과학적시험법의개발이요 *Correspondence to: Yong-Chjun Park, Scientific Food Investigation Team, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food & Drug Safety Evaluation, Food & Drug Administration, 87 Osongsaengmyeong2-ro, Osong-eup, Cheongwon-gun, Chungcheongbuk-do , Korea Tel: , Fax: yongchjun@korea.kr 구된다. 육안으로원재료를확인할수없거나의도적으로소량의원료를혼입하여제조된 EMA 식품에대하여사용원료를확인하는방법에는이화학적분석법, 단백질분석법, 유전자분석법등이있다. 이화학적인분석법으로는광합성의대사경로에따른탄소동위원소비율을활용한분석법 1,2), 분자량이적은 ion-fragment의패턴차이를이용하여비교분석하는 MS-전자코분석법 3,4,5), 함유하고있는특정성분물질의유무와함유량을확인할수있는 GC, LC, HPLC 등이주로이용되고있다 6,7). 그리고분자생물학적분석기술의발달에따라 DNA 분자수준에서염기서열차이에기초한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 기법은종래의단백질수준에서종감별의한계성과문제점을극복할수있는새로운기술로활용되고 317

2 318 Yong-Chjun Park et al. 있다 8,9,10). 특히 PCR 기법은극소량의 DNA로특정염기서열영역을특이적으로증폭함으로서신속정확하고감수성이매우높은종판별법으로알려졌다. 원료및가공식품으로부터다른원료가혼입되어있는지여부를확인하기위하여원료의특성에따라다른 matrix에서적절한 DNA추출법이필요하며추출방법이적절하지않을경우 PCR 증폭후위음성혹은위양성의결과를초래할수있기때문에적절한 DNA 추출방법을확립하는것이선행되어야한다. 또한가공공정의영향으로인하여유전자가손상되는경우가많기때문에 PCR을이용하여목적유전자를검출하기위해서는순도가높고충분한양의 DNA 를확보하는것이중요하다. 최근에는종동정에 DNA barcode를활용하는방법이많이연구되고있다. DNA barcode라는용어는 2003년 Hebert 11,12) 가최초로사용한용어로종동정을위한최소한의유전자를의미하며이러한 DNA barcode 부위를증폭하기위하여합성된뉴클레오타이드를일반프라이머 (universal primer) 라한다. 동물의경우미토콘드리아에존재하는 cytochrome C oxidase subunit 1(), 16S RNA 등을, 식물의경우는엽록체에존재하는 ribulose bisphosphate carboxylase(rbcl), maturase(matk), intergenic spacer(psbatrnh), RNA polymerase C(rpoC1), RNA polymerase beta subunit(rpob), NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit J(ndhJ), acetyl-coa carboxylase carboxyltransferase beta subunit(accd) 등을주로이용하고있다 13,14,15,16). 동물의경우미토콘드리아는세포질에존재하는소기관으로세포내에너지를생산하며미토콘드리아 DNA (mtdna) 는모계유전을통해다음세대에유전물질을전달하는것으로잘알려져있다 (Fig. 1). 동물 mtdna는약 16.5 kb 크기의환형이중나선구조로 13 종류의단백질을암호하는유전자 (ND1-ND6, CytB, COI-III, ATPase 6, 8), 2개의 rrna를지정하는유전자 (12S, 16S) 및 22개의 trna 유전자그리고제어부위인 D-loop 영역으로구성되어져있다 17). 동물의종감별에는핵 DNA보다 mtdna가종특이성, 신뢰성및재현성이높은것으로알려져있다 18). 또한일반적으로특정염기서열의복제수가매우낮은핵 DNA와는달리세포당미토콘드리아수가많고각미토콘드리아는다수의 mtdna를갖고있어종특이적미토콘드리아 DNA 염기서열을이용한 PCR 분석은종판별에매우효과적인방법으로알려졌다. 식물의경우유전학적으로잘보존되어있다고알려진엽록체상부위인 matk, rbcl, rpoc1, psba-trnh, rpob, ndh J, acc D(Fig. 2) 와핵 DNA에존재하는 ITS, ITS1, ITS2가대표적으로알려져있다. 최근약용식물을대상으로한연구에는 nuclear ribosomal DNA에위치한 second internal transcribed spacer(its2) 부위가가장효율성이높다고보고하였다 16). 본연구는일반프라이머를이용한유전자분석법을통해가공식품에사용된식품원료의진위여부를판별할수 Fig. 1. The structure of mitochondrial DNA in animal cell(source : en.wikipedia.org).

3 Application for Identification of Food Raw Materials by PCR using Universal Primer 319 Fig. 2. The structure of DNA in plant cell(source : Plant Systematics, 3rd Edition). 있는가능성을제시하였으며식품원료별사용가능한최적의프라이머와 PCR 조건을확립하였다. 또한본연구에서확립된시험법은식품중발견되는생물체의이물동정법에활용할수있을것으로기대된다. 재료및방법 재료선정국내 외언론보도등으로부터가짜식품의유통사례및 Table 1. Information of universal primer used in this study Species Target region Primer Primer Sequence(5' 3') Length(bp) Ref. Fishes Livestock Poultry Plant Cyt b trnh/psba rpob rbcl VF2 FISH R2 LCO 1490 HCO 2198 VF2 FISH R2 L14724 H15915 LCO 1490 HCO 2198 VF2 FISH R2 psba trnh rpob 1F rpob 4R rbcl 1F rbcl 724R TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA AGA ATC AGA A GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA AGA ATC AGA A CGA AGC TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G AAC TGC AGT CAT CTC CGG TTT ACA AGA C GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA AGA ATC AGA A GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC AAG TGC ATT GTT GGA ACT GG GAT CCC AGC ATC ACA ATT CC ATG TCA CCA CAA ACA GAA AC TCG CAT GTA CCT GCA GTA GC 700~900 Zhang, et al., ~700 Folmer, et al., ~900 Zhang et al., ,100 Irwin et al., ~700 Folmer, et al., ~900 Zhang, et al., ~1,025 Newmaster & Ragupathy, ~900 Fazekas et al., ~900 Fay, et al., 1998

4 320 Yong-Chjun Park et al. Table 2. Information of PCR condition used in this study Primer Step Temp. Time Cycles VF2/FISH R2 LCO 1490/HCO 2198 L14724/H15915 trnh/psba, rpob 1F/4R & rbcl 1F/724R Annealing Initial denaturation 95 o C 5 min Denaturation 95 o C 1 min Annealing variable 1 min Extention 72 o C 1 min Elongation 72 o C 7 min Initial denaturation 95 o C 5 min Denaturation 95 o C 1 min Annealing 40 o C 1 min Extention 72 o C 1 min Elongation 72 o C 7 min Initial denaturation 94 o C 4 min Denaturation 94 o C 45 sec Annealing 44 o C 1 min Extention 72 o C 1.5 min Elongation 72 o C 7 min Initial denaturation 94 o C 7 min Denaturation 94 o C 45 sec for trnh-psba 53 o C 30 sec for rpob 1F/4R 55 o C 30 sec for rbcl 1F/724R 48 o C 30 sec Extention 72 o C 1 min Elongation 72 o C 7 min 다소비식품에대한정보를취합하고유전자분석법으로진위판별이필요한목록을작성하였다. 가축의경우소, 돼지, 양, 염소, 말, 사슴등 6종, 가금류의경우오리, 닭, 타조, 칠면조등 4종, 어류의경우청어, 명태, 대구, 청대구, 송어, 다랑어, 우럭등 7종, 식물의경우마늘, 양파, 무, 녹차, 시금치등 5종을선정하였다. 시약및검체구입유전자증폭 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 을위한프라이머및 Taq DNA polymerase는바이오니아 (Bioneer, 대한민국 ) 에의뢰하여합성또는구매하였으며, PCR 장비는 GeneAmp TM PCR System 9700(Applied Biosystems, USA) 을사용하였다. 유전자추출은 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 및 DNeasy Plant mini kit(qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를사용하였다. 검체로사용된청어, 명태, 대구, 청대구, 송어, 다랑어, 우럭은대형마트와수산시장에서소, 돼지, 양, 염소, 말, 오리, 닭, 타조, 칠면조는대형마트또는사육농장에서, 마늘, 양파, 무, 녹차, 시금치는재래시장에서구입하여사용하였다. 유전자추출가축류, 가금류및어류는 DNeasy Blood & Tissue kit를사용하여유전자를추출하였으며, 식물류는 DNeasy Plant mini kit를사용하였다. 추출방법은제조사에서제공하는추 출법에의거하여추출하였으며, 최종용출단계에서는 AE 완충용액대신멸균증류수를사용하여용출하였다. Polymerase Chain Reaction(PCR) 반응액조성및반응조건 PCR을위한반응액의조성은주형 DNA 50 ng, dntps 200 µm, MgCl 2 2.5mM, 프라이머각 0.5 µm이되게혼합하였으며최종용량은 20 µl로하였다. 가축류, 가금류및어류는 L490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/ H15915 프라이머, 식물류는 trnh/psba, rpob 1F/4R 및 rbcl 1F/724R 프라이머를사용하였으며반응조건은 Table 2에명시하였다. 결과확인최종산물의확인은반응액 5µl를취하여아가로즈젤로 100V, 30분간전기영동하고 EtBr로염색 (1 µg/ml) 한후 UV 투영기를이용하여확인하였다. 결과 일반프라이머를이용한동물성식품원료의확인본연구에서는일반프라이머를이용하여식품원료의진위여부를확인하고자하였다. 동물성식품원료의경우사용된 DNA barcode 부위는 cytochrome C oxidase subunit

5 Application for Identification of Food Raw Materials by PCR using Universal Primer 321 Table 3. The PCR result from food raw materials using universal primers Fishes Livestock Fowl Plant Items Herring Universal primer LCO/ HCO VF2/ FISH R2 L14724/ H15915 trnh/ psba rpob 1F/4R rbcl 1F/724R Pollack - Trout - Blue codfish - Codfish - Tuna - Rockfish - Sheep Goat Cow Horse Deer Pig Duck Chicken Ostrich Turkey Garlic Onion Green tea Spinach Radish NT : Not test, The temperature is annealing condition () 부위를대상으로한 L490/HCO2198, VF2/FISH R2 프라이머및 cytochrome b 부위를대상으로한 L14724/ H15915를이용하였다. 식품원료는가축류 6종 ( 소, 돼지, 양, 염소, 말및사슴 ), 가금류 4종 ( 오리, 닭, 타조및칠면 조 ) 및어류 7종 ( 청어, 명태, 대구, 청대구, 송어, 다랑어및우럭 ) 을대상으로상기3 종류의프라이머를이용하여 DNA 증폭을유무를확인하였다. 가축류의경우 3 종류의프라이머 (L490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/

Lane S; 100 bp ladder, 1; herring, 2; pollack, 3; codfish, 4; blue codfish, 5; trout, 6; tuna, 7; rockfish, 8; sheep, 9; goat, 10; cow, 11; horse, 12; deer, 13; pig, 14; duck, 15; chicken, 16;

6 322 Yong-Chjun Park et al. Fig. 3. PCR product patterns of cytochrome c oxidase subunit 1() and cytochrome b(cyt b) region on mitochondrial DNA using universal primer[vf2/fish R2 (A), L490/HCO2198 (B), L14724/H15915 (C)]. Lane S; 100 bp ladder, 1; herring, 2; pollack, 3; codfish, 4; blue codfish, 5; trout, 6; tuna, 7; rockfish, 8; sheep, 9; goat, 10; cow, 11; horse, 12; deer, 13; pig, 14; duck, 15; chicken, 16; ostrich, 17; turkey. Fig. 4. PCR product patterns of intergenic spacer, RNA polymerase beta subunit, ribulose bisphosphate carboxylase region on chloroplast DNA using universal primer[trnh/psba (A), rpob 1F/4R (B), rbcl 1F/724R (C)]. Lane S; 100 bp ladder, 1; garlic, 2; onion, 3; radish, 4; green tea, 5; spinach. H15915)에서 모두 증폭이 확인되었다. 그러나 재결합 온도 의 경우 L490/HCO2198 프라이머는 40oC, VF2 /FISH R2 프라이머는 50oC, L14724/H15915 프라이머는 44oC에서 최적의 재결합 온도로 나타났다. 가금류의 경우 L490/ HCO2198 및 VF2/FISH R2 프라이머에서는 증폭이 확인되 었지만 L14724/H15915 프라이머를 사용한 경우에는 증폭 되지 않았다. 최적의 재결합 온도는 가축류와 동일하게 L490/HCO2198 프라이머에서 40oC, VF2/FISH R2 프 라이머에서 50oC로 확인되었다. 어류의 경우 VF2/FISH R2 프라이머를 이용한 경우에 한하여 부위의 증폭을 확 인하였으며, 청어, 명태, 청대구 및 송어는 40oC에서, 대구, 다랑어 및 우럭은 55oC의 재결합 온도에서 가장 적합한 것으로 확인되었다(Fig. 3). 일반 프라이머를 이용한 식물성 식품원료의 확인 선발된 식물성 식품원료는 마늘, 양파, 녹차, 시금치 및 무 등 총 5종이다. 사용된 유전자 부위는 3종류(trnH-psbA, rpo B, rbc L)이며 모두 엽록체 유전자를 대상으로 하였다. 대상유전자 별로 사용된 프라이머별 반응조건은 재결합 온 도만 달리하였다. 재결합온도 결정은 40oC~60oC사이에서 5oC씩 변화를 주어(40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC) 1차적으 로 PCR 산물의 결과를 확인하고 증폭이 확인된 온도에서 다시 1oC씩 변화시키면서 최적의 재결합 온도를 결정하였 다. 사용된 5종의 시료는 3종류의 프라이머에서 모두 증폭 됨을 확인하였으며 최적의 재결합 온도는 trnh/psba 프라 이머는 53oC, rpob 1F/4R 프라이머는 55oC, rbcl 1F724R 프라이머는 48oC로 확인되었다(Fig. 4). 또한, rpob 1F/4R 및 rbcl 1F/724R 프라이머를 이용한 경우 시료별로 증폭

7 Application for Identification of Food Raw Materials by PCR using Universal Primer 323 산물의크기가일정하게확인되었지만 trnh-psba 프라이머에서는증폭산물의크기가시료별로차이가있었다. 고찰 최근값싼식품원료를대체하여사용하거나표시사항을허위로기재하여소비자를기만하는가짜식품 (EMA, Economically Motivated Adulteration) 의제조 유통으로인하여식품에대한막연한불안감이높아지고있다. 주요사례로는돼지고기에소고기향을첨가한소고기장조림, 무게를늘리기위하여양파또는무를혼합한다진마늘등이대표적이다. 가짜식품의경우서류검토방법, 관능및육안분석방법등에의하여사용원료의진위여부를확인할수있으나객관적이고정확한증거자료의확보를위해과학적인시험법의개발이요구된다. 이러한시험법중유전자를이용한분석법이최근각광을받고있다. 유전자는모든동물및식물의조직내에존재하며식품제조공정중처리되는압력, 고열등에대하여단백질보다안정성이높은장점이있다. 또한일반프라이머를이용하여특정유전자를특이적으로증폭시키는방법은신속성 11), 간편성, 민감도, 특이도등이우수하여최근에는식품원료동정에점진적으로사용되고있다 9,13,19,20,21,22). 동물성원료의경우 2003년 Hebert 등은미토콘드리아에존재하는유전자 (cytochrome c oxidase subunit, cytochrome b 등 ) 를이용하면신속하고정확하게판별할수있다고제안하였으며 23,24) DNA barcode 이라는용어를처음으로사용하였다 21). 특히 cytochrome c oxidase subunit 1() 유전자는해양무척추동물의동정을위하여 1994년 Folmer 등이최초로제안하였으나 13) 현재대부분의동물류에사용하고있는실정이다 25,26,27). 식물성원료의경우는 ribulose bisphosphate carboxylase(rbcl), maturase(matk), intergenic spacer(psba-trnh), RNA polymerase C(rpoC1), RNA polymerase beta subunit(rpob), NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit J(ndhJ), acetyl-coa carboxylase carboxyltransferase beta subunit(accd) 등이 16,28,29,30,31), 곰팡이류에는 internal transcribed space(its) 가주로사용되고있다. 특히식물류의경우는두가지이상의일반프라이머를이용일치여부를확인하여종판별에사용되고있다. 일반프라이머를이용하는방법은 PCR 후에염기서열을결정하는단계가추가되어비교적분석시간이길고, 데이터베이스에등록되어있는염기서열이없으면분석이어려우며, PCR 산물의크기가 ( 약 650 bp 이상 ) 커서가공식품적용엔한계가있다. 그러나추정되는원료물질을모를경우엔가장우선적으로사용될수있는방법이며프라이머개발을위한시간적, 경제적인투자가필요없다는점에서일반프라이머의활용가치가높다고할수있다. 따라서본연구에서는동물성및식물성식품원료별적 용가능한최적의프라이머및 PCR 조건을제시하였으며, 본방법은가짜식품으로의심되는식품분석시적용가능하며, 식품중생물체가이물로발견시정확한종동정에활용도가매우클것으로기대된다. 감사의말 본연구는식품의약품안전평가원 2011년도연구개발사업지원비 (11161소비연153) 에의해수행되었으며이에감사드립니다. 요약 본연구는식품원료의진위여부를판별하기위한시험법으로일반프라이머를이용한 DNA barcode 기법을도입하였다. 동물성식품원료의경우미토콘드리아 DNA 중 cytochrome oxidase subunit I(COI) 부위검출을위하여디자인된프라이머 (L490/HCO2198 및 VF2/FISH R2) 와 cytochrome b(cyt b) 부위검출을위하여디자인된프라이머 (L14724/H15915) 를사용하였다. 상기 3 종류의프라이머를사용하여가축류 6종 ( 소, 돼지, 염소, 양, 말및사슴 ), 가금류 4종 ( 닭, 오리, 칠면조및타조 ), 어류 7종 ( 명태, 대구, 청대구, 청어, 송어, 다랑어및우럭 ) 을대상으로 PCR 후전기영동하여예상되는 PCR 산물의생성유무를확인하였다. 가축류 6종에대하여는 L490/HCO2198, VF2/ FISH R2 및 L14724/H15915 프라이머를사용한경우 COI 및 cyt b가모두검출되었으며, 가금류 4종은 L490/ HCO2198 및 VF2/FISH R2 프라이머를사용한경우만 COI이검출되었다. 또한어류 7종은 VF2/FISH R2 프라이머를사용한경우에만 COI 부위가검출됨을확인하였다. 식물의경우엽록체 DNA 부위를이용하여디자인된 3 종류의프라이머 (trnh/psba, rpob 1F/4R 및 rbcl 1F/724R) 를사용하였다. 각각의프라이머를이용하여식물 5종 ( 마늘, 양파, 무, 녹차및시금치 ) 에대하여실험한결과 3종류의프라이머에서 PCR의산물을모두확인하였으며 trnh/ psba 프라이머의경우식물종마다 PCR 산물의크기는다르게검출되었다. 본연구에서는 17종의식품원료별일반프라이머및 PCR 조건을확립하였으며, 생산된 PCR 산물을대상으로염기서열을결정하고유전자은행에있는염기서열과 DB 비교 분석을통하여식품에사용된원료의진위여부판별에적용이가능할것으로기대된다. 참고문헌 1. Padovan G.J, D. De Jong, L. P. Rodrigues, J.S. Marchini: Detection of adulteration of commercial honey samples by the 13C/12C isotope ratio, Food Chemistry. 82, (2003).

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