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화선 용
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1 임상검사와정도관리 : 제 30 권제 2 호 2008 J Lab Med Qual Assur 2008 ; 30: B 형간염바이러스의라미부딘치료에따른약제내성돌연변이검출 : 직접염기서열분석법과 CLIP 염기서열분석법 박현웅 1 권혜린 2 송상훈 1,2 박경운 1,2 송정한 1,2 박성섭 1 김의종 1 서울대학교의과대학검사의학교실 1, 분당서울대학교병원진단검사의학과 2 Detection of Mutations in Chronic Hepatitis B Virus under Lamivudine Treatment: Direct Sequencing and CLIP Sequencing Hyunwoong Park 1, Hye Lin Kwon 2, Sang-Hoon Song 1,2, Kyoung Un Park 1,2, Junghan Song 1,2, Sung Sup Park 1, and Eui Chong Kim 1 Department of Laboratory Medicine Seoul National University College of Medicine 1, Seoul; Department of Laboratory Medicine Seoul National University Bundang Hospital 2, Sungnam, Korea Background: Hepatitis B Virus (HBV) is a major risk factor for hepatocellular carcinoma, and about five to six percents of people are infected with HBV in Korea. Lamivudine is a first-line drug having good control against HBV replication, but long-term treatment by lamivudine induces drug resistance. We analyzed the rate of HBV resistance mutation for lamivudine by direct sequencing and CLIP sequencing. Methods: HBV DNA was isolated from 371 patients who were in treatment, or were planning to be treated with lamivudine. The direct sequencing for lamivudine resistance mutation was performed in 371 patients and CLIP sequencing in 138 patients. We analyzed the mutation rate and the type of mutations for lamivudine resistance. Results: The mutation was detected in 203 patients (54.7%) and (CTG) L180M (ATG) was most common (36.1%) followed by (ATG) M204I (ATT) (29.9%) and (ATG) M204V (GTG) (18.6%). According to the duration of treatment, mutation rates were as follows: 45.3% for less than one year, 71.7% for one to two years, 66.7% for two to three years, and 87.9% for more than three years. The results of the direct sequencing and CLIP sequencing agreed in 134 out of 138 patients, in whom both tests were performed. Conclusions: We confirmed that HBV mutation rates for lamivudine resistance increased as the lamivudine treatment period increased. The lamivudine resistance mutations detected were similar to the previous studies. CLIP sequencing showed good correlation with the direct sequencing and gave additional mutation information. CLIP sequencing is a promising tool for the detection of lamivudine resistance mutation in HBV that can assist treatment plans. Key Words : Hepatitis B virus, Lamivudine, Mutation, Sequencing 서 B 형간염바이러스 (Hepatitis B Virus, HBV) 는 1970 년에 교신저자 : 박경운우 ) 경기도성남시분당구구미동 300 분당서울대학교병원진단검사의학과전화 :031) , FAX:031) m91w95@dreamwiz.com 론 B형간염바이러스입자의존재가밝혀진이래로전세계적으로약 3억 5천만명이감염되어있으며, 이중 300 만명이상에서급성간염이나간경변증, 간암으로진행하고있다 [1,2]. HBV 는한국인간세포암의가장큰위험인자로알려져있으며, 이는한국인에서의높은감염률 (5~6%) 과연관이있을것으로생각된다 [3]. HBV 는 Hepadnaviriae 에속하는 DNA 바이러스이며, 부분적인이중나선구조로이루어져있다. 40 nm 크기의

2 286 박현웅 권혜린 송상훈 박경운 송정한 박성섭외 바이러스입자는 Dane 입자라고도불리며, 3.2k 의염기로이루어진 DNA 는 pre-core/core, pre-s/s, P와 X의 4개의유전자영역으로구성되어있다. 중합효소가감염된세포에서의증식에관여하며역전사효소와리보누클리아제활성을가진영역을포함한다 [4]. HBV 에의한만성간질환의치료제로널리쓰이고있는약제중라미부딘은뉴클레오시드유사체로 HBV 의역전사효소의기능을방해하여 HBV 의증식을억제한다 [5]. 라미부딘은인터페론과달리경구용법으로사용되며 HBV 복제를억제하는효과가우수하며조직학적소견의개선도있다는보고도있다 [6,7]. 그러나사용기간에따라약제내성률이높아지기때문에약제내성을일으키는돌연변이를찾아내는것이중요하다 [1]. 이러한돌연변이는주로중합연쇄효소 C 영역의 YMDD 영역의점돌연변이가원인이되며라미부딘의부착부위를공간적으로방해하여약제내성을보이는것으로생각하고있다 [8]. 이러한돌연변이검출에는직접염기서열분석법과 CLIP 염기서열분석법이있다. 최근새롭게쓰이고있는 CLIP 염기서열분석법은중합효소연쇄반응과양방향염기서열분석을동시에시행하여검사시간을단축할수있으며, 염기서열분석, 유전자형분석, 약제내성분석을한번에시행하며이전에보고되지않은변이정보를제공한다. 본연구에서는한국인의라미부딘약제내성을일으키는것으로알려진 YMDD 영역을포함한역전사효소유전자와 S 유전자부위의염기서열을직접염기서열분석법과 CLIP 염기서열분석법을통해비교함으로써두검사법의치료기간에따른돌연변이출현빈도와분포를비교하고자하였다. 대상및방법 1. 연구대상 2005 년 12월부터 2007 년 6월까지 B형간염바이러스약제내성검사가의뢰된만성 B형간염환자 371 명을대상으로하여직접염기서열분석을시행하였다. 의무기록을검토하여대상환자들의나이, 성별, 라미부딘치료기간을조사하였다. 연령분포는 16개월부터 77세였으며평균연령은 46.1 세였으며, 남자는 265명, 여자는 106명을대상으로하였다. 의무기록검토를통하여치료기간을알수있었던 208 명의치료기간은 1년미만은 53명, 1년이상 2 년미만은 83명, 2년이상 3년미만은 39명, 그리고 3년이상은 33명이었으며, 평균치료기간은 1년 9개월이었다. 371 명중 138 명에서는 CLIP 염기서열분석을시행하였다. 2. 방법 1) 직접염기서열분석 혈청에서 High Pure Viral Nucleic Acid kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 를이용하여 DNA 를추출한후, HBV 유전자부위중 YMDD motif 주변역전사효소유전자와 S 유전자부위를중합효소연쇄반응으로증폭하였다. 시발체는순방향 5 -TCC TGC TGC TAT GCC TCA TC-3 과역방향 5 -TTC CGT CGA CAT ATC CCA TGA AGT TAA GGG A-3 이었으며, 필요에따라순방향 5 -TGC CTC ATC TTC TTG TTG GTT-3 과역방향 5 -GCT TCC AAT TAC ATA TCC CAT GA-3 의다른시발체로증폭하였다. 반응액은 Taq 중합효소 0.25 μl (5 U/μL), 양방향시발체각각 2 μl (10 pmol/μl), dntp 4 μl, 10X 완충액 5 μl, DNA 주형 5 μl 및증류수 32 μl이었다. 중합효소연쇄반응은 95 에서 5분간전변성반응을한후에 95 에서 30초동안변성반응, 55 에서 30초간결합반응, 72 에서 30초간연장반응을 35회반복한다음 72 에서 5분간연장반응을한번더시행하였다. 중합효소연쇄반응의산물 5 μl와 ExoSAP-IT (USB Coporation, Cleveland, Ohio, USA) 2 μ L를혼합하여 37 에서 15분, 80 에서 15 분반응시켜정제한후 4 에보관하였다. 정제과정후농도가 60~70 ng/μl 가되도록희석하였다. 증폭된산물은 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied-Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 Seq Scape software v2.5 (Applied-Biosystems) 를사용하여염기서열분석을시행하였다. 2) CLIP 염기서열분석 CLIP 염기서열분석은직접염기서열분석과달리두개의다른형광으로표지된시발체를이용하여정방향과역방향으로동시에염기서열을분석하는방법으로오차를감소시킨다. CLIP 염기분석을위한 QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) 를사용하여혈청으로부터 DNA 를추출한후, TRUGENE HBV Genotyping kit (Bayer HealthCare, Tarrytown, NY, USA) 내에포함되어있는시약들을제조사의지시대로혼합한후중합효소연쇄반응을시행하였다. CLIP 혼합액은 GeneObjects 3.2 소프트웨어의 OpenGene DNA Sequencing System을이용하여증폭반응산물의염기서열을 TRUGENE HBV GeneLibrarian 의염기서열과비교하였다. 결 직접염기서열분석법을이용한돌연변이분석에서대상환자 371 명중 203 명 (54.7%) 에서 YMDD 주변부위의돌연변이가발견되었다. 이중 (CTG) L180M (ATG) 의돌연변이바이러스를가지고있는환자는 134 명으로 (36.1%) 가장흔하였고, 그다음으로 (ATG) M204I (ATT) 이 29.9%, 과

3 HBV 의약제내성돌연변이검출 287 Table 1. The distribution of mutations in 371 patients by direct sequencing Amino Acid No. Mutation No. of patients (%) SA 145 (GGA) G145R (AGA) - (GGA) G145Q (GAA) 1 (0.3) RT 173 (GTG) V173L (TTG) 12 (3.2) (GTG) V173L (CTG) 5 (1.3) (GTG) V173L (YTG) 2 (0.5) 180 (CTG) L180M (ATG) 134 (36.1) (CTG) L180V (GTG) (GTC) A181S (TCT) 1 (0.3) 204 (ATG) M204V (GTG) 69 (18.6) (ATG) M204S (AGY) - (ATG) M204I (ATA) 5 (1.3) (ATG) M204I (ATT) 111 (29.9) (ATG) M204I (ATC) 12 (3.2) (ATG) M204I (ATY) 1 (0.3) (ATG) M204M/I/V (RTK) 14 (3.8) (ATG) M204M/I/V (RTR) 1 (0.3) (ATG) M204I (ATH) 1 (0.3) 205 (ATG)M205V(GTG) 1 (0.3) 207 (GTG) V207I (ATT) 1 (0.3) (GTG) V207I (ATA) 1 (0.3) (GTG) V207I (ATC) 1 (0.3) (GTG) V207L (TTG) 6 (1.6) Abbreviations: SA, surface antigen; RT, reverse transcriptase; Y, cytosine or thymine; R, Adenine or guanine; K, guanine or thymine; H, adenine or cytosine or thymine. (ATG) M204V (GTG) 이 18.6% 순이었다 (Table 1). 치료기간을알수있었던 208 명에대하여직접염기서열분석법을이용한돌연변이분석에서 135 명 (64.9%) 이돌연변이를가지고있었다. 치료기간별로돌연변이의출현빈도를살펴보면 1년미만의치료군 53명중 24명 (45.3%) 에서돌연변이가검출되었다. 1년이상 2년미만의치료군에서는 83명중 59명 (71.1%) 에서돌연변이가검출되었으며, 2년이상 3년미만의치료군에서는 39명중 26명 (66.7%) 에서돌연변이가검출되었으며, 3년이상치료군에서는 33명중 29명 (87.9%) 에서돌연변이가검출되었다. 이들을 208 명의돌연변이의분포또한 (CTG) L180M (ATG) 이 85명에서발견되어 40.9% 로가장흔한돌연변이이었고, (ATG) M204I (ATT) 는 28.4% 로두번 째, (ATG) M204V (GTG) 는 23.1% 로세번째로흔한돌연변이로치료기간을고려하지않았던 371 명의분포와큰차이가없었다 (Table 2). 직접염기서열분석법으로돌연변이검사를시행했던대상환자 371 명중 138 명의환자의검체에대해서는 CLIP 염기서열분석을시행하였다. 이중 98 명 (71.0%) 에서돌연변이가발견되었다. 이돌연변이중, (CTG) L180M (ATG) 이 39.9% 로가장흔한돌연변이이었고, (ATG) M204V (GTG) 는 27.5% 로두번째, (ATG) M204I (ATT) 는 25.0% 로세번째로흔한돌연변이였으며이는치료기간을고려하지않았던 371 명의돌연변이빈도순서와차이가없었다 (Table 3). 직접염기서열분석법과 CLIP 염기서열분석법에의한돌연변이분석결과는 4 예를제외하고는 134 명 (97.1%) 에서

4 288 박현웅 권혜린 송상훈 박경운 송정한 박성섭외 Table 2. The distribution of mutations in 208 patients with known treatment period by direct sequencing Amino Acid No. Mutation Less than 1 year 1 year~less than 2 year No. of mutations 2 year~less than 3 year Over 3 year Total SA 145 (GGA) G145R (AGA) RT 173 (GTG) V173L (TTG) (GTG) V173L (CTG) (GTG) V173L (YTG) (CTG) L180M (ATG) (CTG) L180V (GTG) (ATG) M204V (GTG) (ATG) M204S (AGY) (ATG) M204I (ATA) (ATG) M204I (ATT) (ATG) M204I (ATC) (ATG) M204I (ATY) (ATG) M204M/I/V (RTK) (ATG) M204M/I/V (RTR) (ATG) M204I (ATH) (GTG) V207I (ATT) (GTG) V207I (ATA) (GTG) V207I (ATC) (GTG) V207L (TTG) Total no. of mutations Abbreviations: SA, surface antigen; RT, reverse transcriptase; Y, cytosine or thymine; R, Adenine or guanine; K, guanine or thymine; H, adenine or cytosine or thymine. 일치하였다. 차이를보인 4 예는직접염기서열분석법을이용한돌연변이분석에서돌연변이가없는것으로나왔으나 CLIP 염기서열분석에서는 (CTG) L180M/L (MTG), (ATG) M204M/I (ATT), (GGA) G145A (GCA), (GGA) G145R (AGA) 의돌연변이가검출되었다. 고찰만성 HBV 간염에대하여과거인터페론을치료제로사용하였으나투여가불편하고부작용이심한단점이있다. 라미부딘은 HBV 의증식을억제하는약제로서치료효과가우수하고인터페론에비하여부작용이적어서 HBV 의 1차치료약제로사용하고있다. 그러나라미부딘의투여기간이길어짐에따라 HBV DNA 양이다시급증하는환자들이 흔히나타나고있다. 이러한환자들에서라미부딘에대한 HBV 내성의주된원인은주로중합연쇄효소 C 영역의 YMDD 영역의 204 번의아미노산이메티오닌에서발린으로치환되었거나 (M204V) 메티오닌에서이소류신으로치환 (M204I) 된경우이다 [9]. 이러한 YMDD motif 변이형은라미부딘을장기간투여한환자에서흔하게나타난다. 라미부딘을 1년동안치료한환자의 23% 에서, 2년동안치료한환자의 46%, 3년동안치료한환자에서 55%, 4년동안치료한환자의 71% 에서라미부딘에대한내성이나타난다는보고가있다 [10]. 본연구에서도 208 명을치료기간별로나누어분석해본결과기존의연구와같이치료기간이길어질수록돌연변이의발생빈도가높아짐을알수있었다. 특히 3년이상의장기적으로복용한 33명중 87.8% 에해당하는 29명에서돌연변이가관찰되었다. 하지만기존의연구보다

5 HBV 의약제내성돌연변이검출 289 Table 3. The distribution of mutations in 138 patients by CLIP sequencing Amino Acid No. Mutation No. of patients (%) SA 145 (GGA) G145R (AGA) 1 (0.7) (GGA) G145A (GCA) 1 (0.7) RT 173 (GTG) V173L (TTG) 6 (4.3) (GTG) V173L (CTG) 3 (2.2) 180 (CTG) L180M (ATG) 55 (39.9) (CTG) L180V (GTG) (GTC) A181S (TCT) 1 (0.7) 204 (ATG) M204V (GTG) 38 (25.0) (ATG) M204S (AGY) - (ATG) M204I (ATA) 2 (1.3) (ATG) M204I (ATT) 36 (27.5) (ATG) M204I (ATC) 4 (2.9) (ATG) M204I (ATY) 1 (0.7) (ATG) M204M/I/V (RTK) 2 (1.4) 205 (ATG)M205V(GTG) 1 (0.7) 207 (GTG) V207I (ATT) 1 (0.7) (GTG) V207I (ATA) - (GTG) V207I (ATC) - (GTG) V207L (TTG) 2 (1.4) Abbreviations: SA, surface antigen; RT, reverse transcriptase; Y, cytosine or thymine; R, Adenine or guanine; K, guanine or thymine; H, adenine or cytosine or thymine. 높은돌연변이발생빈도는이전에타의료기관치료를받았었기때문일수있다. 기존연구에서라미부딘투여에의하여 M204I 18.6%, M204V 1.4%, L180M /M204I 11.4%, L180M/ M204V 64.3% 의빈도로저항변이형이발견된다고알려져있다 [11]. 또한아미노산 180 과 204 번의단일돌연변이에서치료에따라 L180M/M204V 과 L180M/M204I 양상의이중돌연변이로변화한다고알려져있다 [12]. 이러한약제내성을일으키는원인은라미부딘이 HBV 의약제결합장소로생각되는 YMDD motif 근처의 C 영역에결합하여효과를나타내는곳에단백질의 3차구조의변화를일으켜, 라미부딘의결합력을떨어뜨려서약제내성을일으키는것으로생각되고있다 [13]. 이전생체외연구에서이러한변이형은야생형에비하여라미부딘에대한저항성이 L180M 은 1.7 배, M204I 은 100 배이상높은것으로알려져있다 [14]. 따라서라미부딘을치료받고있는환자의돌연변이의위치를정확히찾아내는것은앞으로환자의치료방향을설정하고, 필요에따라치료약제를다른항바이러스약물로변경하는데에큰역할을할것으로생각된다. 본연구에서또한총 371 명중 138 명에대하여 CLIP 염기서열분석법을이용하여돌연변이를분석하였다. 이들 138명에대해서시행한 CLIP 염기서열분석법에서 134명 (97.1%) 은직접염기서열분석법과동일한결과를보였으나, 직접염기서열분석에서음성을보인 4명에게서돌연변이가발견되었다. 4명중 (CTG) L180M/L (MTG), (ATG) M204M/I (ATK) 은야생형과변이형이섞여있었을것으로생각되며, (GGA) G145A (GCA), (GGA) G145R (AGA) 에서는직접염기서열분석법에서는확인되지않은부위의돌연변이가발견되었다. 이는직접염기서열분석법에서돌연변이를확인하지않는부위로생각된다. 이전의직접염기서열분석법에서는주로 L180M, M204I, M204V, M204S 의 4개의돌연변이를검출하였으나, CLIP 염기서열분석법에서는 V173L, L180M, L180V, M204I, M204V, M204S, V207I, G145R 를검출한다. 또한표면항원의코돈 의유전자형분석과, 중합연쇄효소 C 영역의 YMDD 영역이외에 B-E 영역의코돈 의돌연변이분석을시행하여 silent mutation, 염기다형성, 기존에보고되지않은변이정보를알수있는장점이있다. 또한 CLIP 염기서열분석법은한번에유전자형과돌연변이위치, 라미부딘내성여부를한번에알수있어앞으로더욱많이사용된것으로생각

6 290 박현웅 권혜린 송상훈 박경운 송정한 박성섭외 된다 [15]. 현재만성 B형간염의 1차치료제로널리쓰이고있는라미부딘은치료기간이늘어남에따라서내성돌연변이가출현한다. 직접염기서열분석법과 CLIP 염기서열분석법은대부분의경우에검사결과의일치를보이며, 직접염기서열분석법에서검출하지못하는돌연변이를 CLIP 염기서열분석법에서검출할수있다. 따라서 HBV 의돌연변이검출과치료약제결정에 CLIP 염기서열분석법이유용하다. 요약배경 : HBV 는간세포암과가장연관성이있는위험요소이며, 한국인에서감염률은 5~6% 이다. 라미부딘은 HBV 의증식을억제하는효과가우수하여 1차약제로널리쓰이고있으나라미부딘으로의치료기간이길어질수록약제에대한내성발현이증가하고있다. 이에직접염기서열분석법과 CLIP 염기서열분석법으로돌연변이비율을연구하였다. 방법 : 라미부딘치료를하고있거나, 치료를시작할예정인환자 371 명을대상으로하여직접염기서열분석과그중 138 명에대하여 CLIP 염기서열분석을시행하여돌연변이양성률과돌연변이종류를분석하였다. 결과 : 대상환자 371명중 203명 (54.7%) 에서돌연변이양성을보였으며, 이중 (CTG) L180M (ATG) 이 35.4% 로가장흔한돌연변이를나타냈으며, (ATG) M204I (ATT) 는 29.3% 로두번째, (ATG) M204V (GTG) 는 18.2% 로세번째로흔한돌연변이였다. 치료기간에따라서 1년미만에서는 45.3%, 1년이상 2년미만에서는 71.1%, 2년이상 3년미만에서는 66.7%, 3년이상의치료군에서는 87.9% 의돌연변이가검출되었다. CLIP 염기서열분석을통한돌연변이분석또한 4예를제외한 134 명 (97.1%) 에서직접염기서열분석과동일한결과를보였다. 결론 : 치료기간이길어짐에따라돌연변이발현이증가함을알수있었다. CLIP 염기서열분석법은직접염기서열분석법과거의동일한결과를내며, 직접염기서열분석법에서검출하지못하는부위의돌연변이도검출할수있다. 따라서 HBV 의돌연변이검출과치료약제결정에 CLIP 염기서열분석법이유용하다. 참고문헌 1. Stephen Locarnini, William S. Mason. Cellular and virological mechanisms of HBV drug resistance. J Hepatol 2006;44: Maynard JE. Hepatitis B: global importance and need for control. Vaccine 1990;8(S):S 박중원. 간세포암 : 개관과현황. 대한소화기학회지 2005; 45: Ganem D and Varmus HE. The molecular biology of the hepatitis B viruses. Annu Rev Biochem 1987;56: Karayiannis P. Hepatitis B virus: old, new and future approaches to antiviral treatment. J Antimicrob Chemoth 2003;51: Lai CL, Chien RN, Leung NW, Chang TT, Guan R, Tai DI, et al. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group. N Engl J Med 1998;339: Dienstag JL, Schiff ER, Wright TL, Perrillo RP, Hann HW, Goodman Z, et al. Lamivudine as initial treatment for chronic hepatitis B in the Untied States. N Engl J Med 1999;341: Bartholomew MM, Jansen RW, Jeffers LJ, Reddy KR, Johnson LC, Bunzendahl H, et al. Hepatitis-B-virus resistance to lamivudine given for recurrent infection after orthotopic liver transplantation. Lancet 1997;349: Allen MI, Deslauriers M, Andrews CW, Tipples GA, Walters KA, Tyrrell DL, et al. Identification and chracterization of mutations in hepatitis B virus resistent to lamivudine. Lamivudine Clinical Investigation Group. Hepatology 1998;27: Lai CL, Dienstag J, Schiff E, Leung NW, Atkins M, Hunt C, et al. Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B. Clin Inf Dis 2003;36: 신영민, 조몽, 허정, 김광하, 강대환, 송근암등. 만성 B형간염바이러스감염자에서 HBV 중합효소 YMDD 영역의자연돌연변이. 대한간학회지 2003;9: Gutfreund KS, Williams M, George R, Bain VG, Ma MM, Yoshida EM, et al. Genotypic succession of mutations of the hepatitis B virus polymerase associated with lamivudine resistance. J Hepatol 2000;33: 김미성, 채희복, 최기원, 이태원, 박선미, 윤세진등. B형만성간염환자에서라미부딘의치료효과와 YMDD 돌연변이형의검출. 대한간학회지 2001;7: Chin R, Shaw T, Torresi J, Sozzi V, Trautwein C, Bock T, et al. In vitro susceptibilities of wild-type or drug-resistant hepatitis B virus to (-)-beta-d-2,6-diaminopurine dioxolane and 20-fluoro-5-methylbeta-L-arabinofuranosyluracil. Antimicrob Agents Chemother 2001;45: 신정원, 박기현, 최태윤, 진소영, 김미영, 전병렬등. 만성 B형간염의바이러스유전자형과라미부딘내성돌연변이및조직학적연관성. 대한진단검사의학회지 2004;24:

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