임앙병리럼마고 I 악외 1\ 1 : 머 133 뀐머 12 호, 81-85, 항바이러스치료효과판정에대한간염바이러스 청량검사와기타바이러스항원검사 제주한라대학생명과학연구소 의료법인한라병원임상병리과 * 문인경 민병해 김인환 김희정 * 김학구 * 정영준 * HBV Q

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건형 군
5 years ago
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1 임앙병리럼마고 I 악외 1\ 1 : 머 133 뀐머 12 호, 81-85, 항바이러스치료효과판정에대한간염바이러스 청량검사와기타바이러스항원검사 제주한라대학생명과학연구소 의료법인한라병원임상병리과 * 문인경 민병해 김인환 김희정 * 김학구 * 정영준 * HBV Quantitation PCR and Viral Marker Studies for Evaluation of Anti -viral Treatment Moon, In Kyung., Kirn, In Hwan., Min, Byung Hae., Kirn, Hee Jeong"'., Kirn, 1 굉 kg *., Jung, Y oung Zoon * Life Science Institute, Cheju Halla College Department 01 Clinical Pathology, Halla General H ospital* Hepatitis-B virus is a serious problem in Korea, and about 7 to 8 % of the populations are in carrier state. The only drugs currently approved for hepatitis-b infection is a -inteferon. However, the cure rate with this treatment is low. Some patients are unresponsive to the interferon, and some relapse when is stopped. Recently, Lamibudine, a novel cytosine analogue, exhibits potent anti-viral activity against hepatitis B virus. The effect of lamibudine treatment is good for almost all patient, but some patients showing refractorlness and the mutant HBV appearance. We studied for what kinds of tests are available for predict the response of lamibudine. HBeAg positive cases are 11.5 % in the HBV -PCR postive group and 0.0% in the HBV-PCR negative group. HBeAg neagtive cases are 88.5% in the HBV-PCR postive group and 100.0% in the HBV-PCR negative group. These results indicate that HBV-PCR test are more reliable for predict the viral state of HBV infection. So the 띠 ral status evaluation(infectivity) for HBV infection by HBeAg assay is not recommended. Further studies recruiting on patient s clinical courses and liver biopsy studies may helpful to determine the HBV viral status. Key Word : HBV, PCR, HBeAg 1. 서론우리나라에서 B 형간염바이러스 (hepatitis B 81

2 하 여 커口V 뼈 ; HBV) 는황달, 만성간염, 간경변, 간암의 가장흔한원인이다. 전국민의 7-8% 정도가가지 하였는데모든시약과검제는사용전에실온으 로평형시킨후가볍게흔들어주었다. 그리고 고있다. 이미 B 형간염바이러스를가지고있는반응판 (πay) 의 37R well 에음성대조혈청, 2 개의 사람들에게최근까지 B 형만성간염의치료제는 well 에양성대조혈청그리고 1 개 well 에각검체 인터페론이유일하였다. 그러나인터페론은효 10μM 씩을분주하였다. 각 well 에검체희석액 200 과가만족할만한수준이아니었고고가약제를 사용해야하며여러가지부작용이있다는문제 점이있다. 최근항바이러스제가개발된것중에 는 B 형간염바이러스에효과가인정되어임상 μm 씩분주하고비드 φea 이를 1 개씩분주하고반 응판을톡톡쳐서혼합하였다. 그리고 45 0 C 항온 수조에 3 시간반응시켰다. 세척방법에의해서비 드를 Quickwash 로 2 회씩세척하였다. 그리고각 시험을하였고. 이중먼저그임상효과를인정 well 에표지항체 ( 田 eab 125 1) 200 따씩을분주한 받은약제가라미뷰딘 (lamivudine) 이다. 그러나, 후 45 0 C 항온수조에 3 시간반응시켰다. 비드를 라미뷰딘을 1 년간사용하다보면 10 명중 1-2 명 Quickwash(Abbott, USA) 로 2 번세척한후 Gamma 에서내성이생겨약효가사라지며, 2 년째가되 counter 로 방사능을측정하였다. 면내성이생기는환자의수는계속늘어난다. 그러므로어떤환자가가장큰효과를볼것인 지에대해서는많은연구와검토가필요한상태 이다. 본실험에서는라미뷰딘치료환자의초기 임상검사가치료반응정도와의관련성이있는 HBV DNA 의증폭을위한시발처 1ψrimer) 의 지여부와치료반응을판단하는지표들의효율쌍은한국생공 (Bioneer, Korea) 에의뢰하여합성 성을검토해보고자하였다. 하였다. Nested PCR (Core region) 1st PCR P비 ner n. set(524bp) 재료및밭법 5 -TCCYACTGTTCAAGCCTCCAAGC 년 10 월부터 2000 년 3 월까지 H 병원에 내원한환자중에서 f 田 eag, HBV-PCR 정량검 사를시행한간염치료환자들의혈청을대상으 로검사하였다. 환자중에서 HBV-DNA 정량검 사추적관찰및임상양상결과치료기간중에 계속음성으로전환된환자를반응군으로정하 고, 반대로 HBV-DNA 정량검사에서음성이양 성으로되거나처음부터음성으로전환이되지 않은환자를비반응군으로정하였다. 2. HBeAg (RIA) 검사방법 방사면역측정법 (RIA, radioimmuno assay) 에 하여田 eag 양성율을검사하였다. 田 eag 의 출을위하여 Abbott 사의 HBeAg kit (125 1) 를사용 의 검 - nu -E요( 메 n 내중U 끼합반효쇄소혀근처 J출ψ만니네(KHBV1) 5 -TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCC (KHBV2) 2nd PCR primer set(521bp) 5 -TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCC (KHBV3) 5 -CTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCC (KHBV4) 환자혈청 40μ 에용해완충액을 40μM 가하여 완전히혼합한후 mineral oil 을한방울떨어뜨 린다. 전자레인지 ( 출력 750W) 로 3 분 -3 분 -2 분 -2 분 끓인후 13,α 야 pm 4 0 C 에서 10 분동안원심분리 하여상층액을취하여 PCR 에사용하였다. 일차 PCR 은 accupower premix tube(bioneer, Korea) 에 멸균된 3 차증류수, HBV1, HBV2 primer( 각각 1 82

3 μq(2opmole/μq)), 시료 DNA( 0.3, 1, 7μ Q ) 를가하 여최종 20 씨로맞춘다음잘혼합한후 ltilcrocentrifuge 로 5 초원침한다. Mineral oil 을가하고 Table 1. Comparison of HBV -PCR test and HBe-Ag (RIA) test. f 핍 eag (+) f 핍 eag (-) PCR반응 (94 0 C 5 분, 94 0 C 1 분, 55 0 C 1 분, 72 0C 3분 33 회후 72 0 C 5 분 ) 을수행하였다. 양성대조군으 로는클론된 B 형 간염바이러스 cdna 를사 HBV-PCR (+) HBV-PCR (-) 용하였으며음성대조군으로는 DNA 대선증류 수를사용하였다. 이차 PCR 은 accupower premix tube 에 8-Mop 용액, HBV3, HBV 4 primer( 각각 1μM N. 고화를(2Opmole/ 따 )), 일차 PCR 반응액 2μ6 일차 PCR 과 B 형간염환자의일부는만성 B 형간염, 전격 같은조건으로수행하였다. PCR 이 끝난후 W 성간염으로이행된다. 田 V 가어릴때에감염될 n 뻐 silluminator 위에서 분동안비동화후 수록만성간염으로될가능성이높다. 출생때 (post -inactivation) 에 2 % agarose gel 에서 전기영동 에 모체로부터감염 ( 수직감염 ) 이되면대부분이 하였다. 그래픽프로그램을사용하여양성대조 1(521bp) band에대한 % 로 DNA 양을측정하였다 (level A: 검체 0.3 μ Q tube, level B: 1 따 tube, level C: 7μ tube). 만성화될수있다. 일단만성화되면대부분이평생동안바이라스를가지고있게된다 ( 보균자또는보유자 ). 세계적으로전인구의약 5% 가 HBV 보균자인데우리나라의경우 7~8% 정도 m. 켜를를 과 로보고된다. 田 V는증식기에바이러스가자신의 DNA 중합효소 (pol ymerase) 를이용해서활발히증식한다. HBV 의 e 항원 (1 田 eag) 과 DNA(HBV HBV-PCR 양성군에서 HBeAg 양성은 11.5% (3/26), 음성은 88.5%(23/26) 이였다. HBV-PCR 음성군에서 f 田 eag 양성은 0% (1/1 1), 음성은 100%(11/11) 이였다 (Table 1). HBV-PCR 정량겸사에의한치료반응군과치료비반응군의초기간기능검사 (ALP, AST, ALP, GGT) 는두군간의유의한차이가없었다 (Table 2). DNA) 가양성이고, 전염력이높게된다. 비증식기가되면田 eag와田 V DNA가음성이되고 e 항체 ( 田 eab) 가나타나며전염력도떨어지게되는데, 바이러스의 DNA는숙주인사람의 DNA에통합 (integration) 된다 (Alter et al., 1976; Fagan and Williams, 1986). HBV 의증식을반영하는지표로가장먼저사용된것은 B형간염표면항원 (hepatitis B surface antigen; HBsAg) 01 다. 이항원은바이러 Table 2. Biochemical laboratory data from lamibudine-treated response group and non-response group. ALP* AST ALT GGT Responcse Group Non-response Group : : : : : : : : 24.0 * : ALP, Alkaline phosphatase(iu/l); AST, Aspartate transferase(iu/l); ALT, Alanine transferase(iu/l); GGT, r -Glutamyl transferase(iu/l) 83

4 스의증식이없이간세포유전자에통합된田 V 유전자에의해서도생성이가능해서바이러스의 칩고문헌 증식을정확히반영할수없었다. 다음으로사용된것은 HBeAg, HBeAb 이다. HBeAg 양성인 1. Alter HJ, Seeff LB, et al. Type B hepatitis. The infectivity of blood positive for e antigen 때d 환자의감염력을일률적으로예측하기힘들고 B DNA polymerase after accidenta1 needle stick 형 간염의 임상적 경과와간조직 검사소견이 exposure. N Engl J Med 295: , 1976 f핍eag 유무와일정한관계가있다고볼수없 2. Fagan EA, Williams R. Serological response to 다는보고가있었다 (Hoofuagle et al., 1981; Fatto- HBV infection. Gut 27: , 1986 vich et al., 1984). 또, 혈중 HBV 의 DNA 중합효 3. Fattovich SV, Rugge M, et al. Clinical, virologic 소의활성도를바이러스의증식지표로사용하 and histologic outcome following seroconversion 려는시도가있었지만예민도의문제가있어도 from 1 田 eag to anti-hbe in chronic hepatitis B. 움이되지못하였다 ( 돼ndman et 떠., 1976; 최 등 Hepatol 4:1052 (Abstract), ). 이후바이러스입자의존재를의미하는 4. Fowler MJF, Monjardino J, et al. Analysis of HBV-DNA 를직접 검출할수있는방법이 개 the molecu1ar state of HBV DNA in the liver 발되어 HBV 에의한간염의상태를판단하는기 and serum of patients with chronic hepatitis or 준이되었다. HBV-DNA를검출할수있는방법 primary liver cell carcinoma and the effect of 은 dot blot/slot blot, in situ hybridization, souther therapy with adenine arabinoside. Gut 25:611- blot, PCR 법이 있으나 (Hadziy때nis et al., 1983; 618, 1984 Krogsaard et al., 1985; Fowler et al.,1984; Shafritz, 5. Hadziyannis SH, Lieberman HM, et al. Analysis 1982), 이중 PCR 법이가장예민한방법이고손 of liver di않ase, nuclear 1표3cAg, 띠ral replication, 쉽게검사할수있어최근많이사용하고있다 and hepatitis B virus DNA in liver and serum of (Saiki et al., 1985). 간염의치료는인터페론요법 f 田 eag vs. anti-hbe positive c따riers of hepatitis 이시행되어왔으나치료효율이떨어지는단점 B virus. Hepatol 3: , 1983 이 있어, 최근라미뷰딘치료가시행되고있다. 6. 돼ndman SH, Gravelle CR, et al. "e" antigen, 라미뷰딘은치료종결후다시바이러스가등장 Dane particles, and serum polymerase activity in 하는단점이있으나초기치료효율이좋아각 HBsAg carriers. Ann Intern Med 85: , 광받고있다. 이치료법의효과판정을위한바 1976 이러스표지검사는대표적으로田 eag과田 V 7. H lfuagle JH, Duseiko GM, et al. Seroconversion DNA 정량검사로치료가잘되면이 두가지 from hepatitis B e antigen to antilxxly in chronic 표지자가음성으로전환된다. 본실험에서두표 type B hepatitis. Ann Intern Med 94: , 지자의의미를파악한결과 HBeAg 보다는 HBV 1981 DNA 검사가치료판정에더 의미가있는정보 8. Krogsaard K, Aldershivile J, et al. Hepatitis B 를준다는것이밝혀졌다. 향후간염치료의판정 virus DNA, HBeAg and delta infection during 이나간염의상태, 예후판정, 간염바이러스보 the course from acute to chronic hepatitis B virus 유자의전염력판정의척도등에 HBV DNA를 infection. Hepatol 5: , 1985 이용하는것이더효율적이라고사료된다. 9. Sa퍼 RK, Sc뼈야S, et 떠.En장/ffiatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. 84

5 Science 230: , Shafritz DA. Hepatitis B virus DNA molecules in the liver of hepatitis B surface antigen carriers: mechanistic considerations in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. Hepatol 2 (Suppl):35s- 45s, 최상운, 김정룡, 이효석등. 간염 B 바이러스 DNA polymerase 활성도와田 eag 의관계. 대한소화기병학회잡지 20: ,

<30382EC0C7C7D0B0ADC1C22E687770>

<30382EC0C7C7D0B0ADC1C22E687770> 대한내과학회지: 제 76 권 제 2 호 2009 의학강좌-개원의를 위한 모범처방(Current Clinical Practice) 간기능검사의 이해와 적용 인제대학교 의과대학 일산백병원 내과학교실 김 경 아 Understanding and application of liver function tests Kyung-Ah Kim, M.D. Department of