(72) 발명자 도리야마 킨야 일본 미야기켄 센다이시 아오바쿠 가타히라 2쵸메 1반 1고 고쿠리츠 다이가쿠 호진 도호쿠 다이가쿠 내 오가와 도모히사 일본 미야기켄 센다이시 아오바쿠 가타히라 2쵸메 1반 1고 고쿠리츠 다이가쿠 호진 도호쿠 다이가쿠 내 무라모토 고지 일본

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1 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (51) 국제특허분류(Int. Cl.) A01H 5/00 ( ) C12N 15/82 ( ) C12N 15/29 ( ) C07K 14/42 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자(국제) 2010년10월14일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2012년05월11일 (86) 국제출원번호 PCT/JP2010/ (87) 국제공개번호 WO 2011/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2011년04월21일 JP-P 년10월14일 일본(JP) 전체 청구항 수 : 총 13 항 (11) 공개번호 (43) 공개일자 2012년08월30일 (71) 출원인 고쿠리츠 다이가쿠 호진 도호쿠 다이가쿠 일본 미야기켄 센다이시 아오바쿠 가타히라 2쵸 메 1반 1고 구미아이 가가쿠 고교 가부시키가이샤 일본국 도쿄도 다이토쿠 이케노하타 1쵸메 4반 26고 (72) 발명자 고마쓰 마사아키 일본국 도쿄도 다이토쿠 이케노하타 1쵸메 4반 26고 구미아이 가기쿠 고교 가부시키가이샤 내 가쿠 고이치로 일본국 도쿄도 다이토쿠 이케노하타 1쵸메 4반 26고 구미아이 가기쿠 고교 가부시키가이샤 내 (뒷면에 계속) (74) 대리인 이덕록 (54) 발명의 명칭 만노스 특이적 렉틴 전구체에 포함되는 시그널 펩티드, 그 시그널 펩티드를 엔코딩 하는 핵산, 그 시그널 펩티드의 이용 핵산 및 그 핵산 (57) 요 약 신규한 시그널 펩티드를 제공하는 동시에, 그 시그널 펩티드를 이용하여 소망의 단백질을 효율적으로 축적할 수 있는 기술을 제공한다. 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열로부터 이루어지는, 또는 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열에 대하여 1 또는 복수개의 아미노산이 결실( 缺 失 ), 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로부 터 이루어지는 펩티드를 코드 하는 핵산이다. 대 표 도 - 1 -

2 (72) 발명자 도리야마 킨야 일본 미야기켄 센다이시 아오바쿠 가타히라 2쵸메 1반 1고 고쿠리츠 다이가쿠 호진 도호쿠 다이가쿠 내 오가와 도모히사 일본 미야기켄 센다이시 아오바쿠 가타히라 2쵸메 1반 1고 고쿠리츠 다이가쿠 호진 도호쿠 다이가쿠 내 무라모토 고지 일본 미야기켄 센다이시 아오바쿠 가타히라 2쵸메 1반 1고 고쿠리츠 다이가쿠 호진 도호쿠 다이가쿠 내 호리 마사토시 일본 미야기켄 센다이시 아오바쿠 가타히라 2쵸메 1반 1고 고쿠리츠 다이가쿠 호진 도호쿠 다이가쿠 내 가토 데쓰야 일본 미야기켄 센다이시 아오바쿠 가타히라 2쵸메 1반 1고 고쿠리츠 다이가쿠 호진 도호쿠 다이가쿠 내 - 2 -

3 특허청구의 범위 청구항 1 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열로부터 이루어지는, 또는 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열에 대하여 1 또는 복수개의 아미노산이 결실( 缺 失 ), 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로부터 이루어지는 펩티드를 코 드 하는 핵산. 청구항 2 제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 시그널 펩티드인 것을 특징으로 하는 핵산. 청구항 3 제 2항에 있어서, 상기 시그널 펩티드는 소포체( 小 胞 體 ) 이행 시그널 펩티드인 것을 특징으로 하는 핵산. 청구항 4 제 1항 내지 제 3항의 어느 것인가에 기재한 핵산과, 해당 핵산의 하류에 위치하는 단백질의 성숙 영역을 코 드 하는 핵산으로 이루어지는 유전자. 청구항 5 제 4항에 있어서, 상기 단백질의 성숙 영역은 나가이모(Dioscorea batatas)의 만노스 특이적 렉틴의 성숙 영 역인 것을 특징으로 하는 유전자. 청구항 6 제 4항 또는 제 5항 기재의 유전자를 식물 체내에서 발현 가능한 프로모터의 하류에 배치하는 발현 벡터. 청구항 7 제 4항 또는 제 5항 기재의 유전자를 외래유전자로서 함유하는 형질전환 식물. 청구항 8 제 7항에 있어서, 내충( 耐 蟲 ) 활성이 부여되거나 증강된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물. 청구항 9 제 7항에 있어서, 벼과 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물. 청구항 10 제 7항에 있어서, 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물. 청구항 11 제 4항 또는 제 5항 기재의 유전자를 외래유전자로서 대상의 식물에 도입하는 공정을 포함하는 내충( 耐 蟲 ) 활 성의 부여 또는 증강 방법. 청구항 12 제 11항에 있어서, 상기 대상의 식물이 벼과 식물인 것을 특징으로 하는 내충( 耐 蟲 ) 활성의 부여 또는 증강 방법. 청구항 13 제 11항에 있어서, 상기 대상의 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 내충( 耐 蟲 ) 활성의 부여 또는 증강 방법. 명 세 서 - 3 -

4 [0001] 기 술 분 야 본 발명은 살충작용을 가져 만노스를 특이적으로 인식하는 렉틴(lectin)을 코드 하는 유전자, 상세하게는 나 가이모(Dioscorea batatas)의 만노스 특이적 렉틴(lectin)의 유전자가 소유하는 시그널 펩티드, 그 시그널 펩 티드를 코드 하는 DNA 및 이것을 이용한 해충의 방제 방법에 관한 것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] 배 경 기 술 렉틴(lectin)은 동물, 식물, 진균 및 세균 등 폭 넓은 생물종에서 찾아내져, 당을 특이적으로 인식해서 가역 적으로 결합하는 단백질이다. 렉틴에 대해서는 생리활성에 대해서도 연구가 전개되고 있어 예를 들면, 혈액형 의 연구, 암 세포의 연구, 림프구 분열 촉진의 연구, 바이러스의 연구 및 세포독성의 연구가 전개되고 있다 (비 특허문헌 1). 또한, 유해 곤충에 대한 살충 활성을 갖는 바실러스(bacillus) 균주의 렉틴을 이용하고, 그 렉틴을 코드 하는 유전자를 도입한 내충성( 耐 蟲 性 )의 향상한 재조합 식물을 만들어 내는 기술도 보고되고 있다(특허문헌 1). 식물 유래의 레틴은 해충에 대하여 효과를 가지는 것이 알려지고 있어 만노스 결합성 렉틴인 GNA는 관상 식물 의 스노 드롭(snowdrop)(Galanth; 마쯔유키소)의 구근으로 클로닝 되어(cloned), 감자, 토마토 및 벼등에 유 전자 도입된 재조합 식물이 만들어지고 있다. 이들 식물은 내충성( 耐 蟲 性 )이 부여되어 있는 것으로 알려져 있 다(비 특허문헌 2, 3). 식물 유래의 레틴에 대해서는, 예를 들면 나가이모 유래 만노스 특이적 렉틴DB1 단백질의 전 아미노산을 코드 하는 DNA 배열은 이미 보고되어 있다(특허문헌 2). 이 DNA 배열은 성숙한 단백질의 전 아미노산을 코드 하고 있고, DB1 유전자를 코드 하는 이미 보고된 DNA 배열을 담배에 유전자 도입한 것은 이미 보고되어 있다 (비 특허문헌 4). 또, DB1 유전자를 코드 하는 이미 보고된 DNA 배열을 벼에 유전자 도입한 것은 이미 보고되어 있다(비 특허문헌 5, 비 특허문헌 6). DB1 단백질은 저장 단백질이기 때문에 mrna로부터 번역된 전구체에는 이행 시그널이 포함되어 있을 것으로 예상되지만, 이 이행 시그널의 DNA 배열은 보고되지 않고 있다. 선행기술문헌 특허문헌 특허문헌 1 : 특허공표 평 호 공보 특허문헌 2 : WO2006/030638호 공보 비 특허문헌 비 특허문헌 1 : 렉틴 오사와 도시아, 모리 료이치편, 고단사( 講 談 社 ) 사이엔틱 비 특허문헌 2 : Fitches et al., Effect of Snowdrop Lectin(GNA) Deliver ed Via Artificial Diet and Transgenic Plants on the Development Tomato Moth( Lacanobia oleracea) Larvae in Laboratory and Glasshouse Trials, Journal of I nsect Physiology, 43(8), (1997). 비 특허문헌 3 : Rao et al., Expression of snowdrop lectin(gna) in trans genic rice plants confers resistance to rice brown planthopper, The Plant Jou rnal, 15(4), (1998). 비 특허문헌 4 : 가토( 加 藤 ) 데쓰야( 哲 也 ) 들, 1Ba-01 나가이모레쿠친 DB1을 축적시킨 형질전환 담배의 작출 과 진딧물 저항성 평가, 제26회 일본 식물세포분자생물학회 오사카( 大 阪 )ㆍ심포지엄 강연 요지집, 제64페이지. 비 특허문헌 5 :가토( 加 藤 ) 데쓰야( 哲 也 ) 들, 701 나가이모레쿠친 DB1을 이용한 형질전환 작물의 작출과 그 해충저항성 평가, 육종학연구 일본 육종학회 제114회 강연회요지집, 2008년 10월 제10권 별책 2호, 제193페이 지. 비 특허문헌 6 : Tetsuya Kato 들, P144 Production of transgenic rice expressing yam tuber lectin(db1) to confer sap-sucking insect-resistance, The 6th International Symposium of Rice Functional Genomics Programs and Abstrac ts, 제285페이지. 비 특허문헌 7 : J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989) - 4 -

5 [0018] 비 특허문헌 8 : Mitsuhara 들, Plant and Cell Physiology, 37, 49-59(1996) 발명의 내용 [0019] 해결하려는 과제 식용으로서 옛부터 이용되고 있는 나가이모(Dioscorea batatas) 덩어리 줄기 유래의 DB1 유전자가 원래 소유 하는 이행 시그널을 코드 하는 영역을 클로닝하고, 그 DNA배열 및 아미노산 배열을 밝히는 것으로 신규한 시 그널 펩티드를 제공하는 동시에, 해당 시그널 펩티드를 이용해서 소망의 단백질을 효율적으로 축적할 수 있는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 상기 시그널 펩티드를 이용하여 유전자 재조합 식물에 있어서 DB1 단백질을 효율적으로 축적하는 것으로 해충 저항성에 뛰어난 유전자 재조합 식물을 제공하는 것을 목적으 로 한다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] 과제의 해결 수단 본 발명자들은 예의 연구한 결과, 지금까지 보고되어 있었던 나가이모레쿠친(DB1) 유전자의 배열을 재검토하 고, 새로운 유전자 배열을 결정하여 게다가, DB1단백질 전구체에 포함되는 시그널 펩티드를 코드 하는 핵산이 존재하는 것을 발견, 그 배열을 결정했다. 새롭게 결정한 시그널 펩티드를 코드 하는 영역을 부가한 유전자를 이종식물에 도입하고, DB1 단백질을 효율적으로 축적시킴으로써 내충( 耐 蟲 ) 활성을 부여 또는 증강시킨 유전 자 재조합 식물을 작출하는 것을 찾아내고, 본 발명을 완성하는 데 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하를 포함한다. (1). 서열목록 2에 나타낸 아미노산 배열로부터 이루어지는, 또는 서열목록 2에 나타낸 아미노산 배열에 대하 여 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로부터 이루어지는 펩티드를 코 드 하는 핵산. (2). 상기 펩티드는, 시그널 펩티드인 것을 특징으로 하는 (1)기재의 핵산. (3). 상기 시그널 펩티드는, 소포체( 小 胞 體 ) 이행 시그널 펩티드인 것을 특징으로 하는 (2)기재의 핵산. (4). 상기 (1) (3) 어느 것인가에 기재한 핵산과, 해당 핵산의 하류에 위치하는 단백질의 성숙 영역을 코 드 하는 핵산으로 이루어지는 유전자. (5). 상기 단백질의 성숙 영역은, 나가이모(Dioscorea batatas)의 만노스 특이적 렉틴의 성숙 영역인 것을 특 징으로 하는 (4) 기재의 유전자. (6). 상기 (4) 또는 (5) 기재의 유전자를 식물 체내에서 발현 가능한 프로모터의 하류에 배치하는 발현 벡터. (7). 상기 (4) 또는 (5)기재의 유전자를 외래유전자로서 함유하는 형질전환 식물. (8). 내충( 耐 蟲 ) 활성이 부여되거나 증강된 것을 특징으로 하는 (7) 기재의 형질전환 식물. (9). 벼과 식물인 것을 특징으로 하는 (7) 기재의 형질전환 식물. (10). 벼인 것을 특징으로 하는 (7) 기재의 형질전환 식물. (11). 상기 (4) 또는 (5)기재의 유전자를 외래유전자로서 대상의 식물에 도입하는 공정을 포함하는 내충( 耐 蟲 ) 활성의 부여 또는 증강 방법. (12). 상기 대상의 식물이 벼과 식물인 것을 특징으로 하는 (11) 기재의 방법. (13) 상기 대상의 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 (11) 기재의 방법. 본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용 을 포함한다. [0036] 발명의 효과 본 발명에 의해, 신규인 시그널 펩티드 및 해당 시그널 펩티드를 코드 하는 핵산을 제공할 수 있다. 본 발명 에 관한 시그널 펩티드나 해당 시그널 펩티드를 코드 하는 핵산을 사용함으로써 소망의 단백질을 식물체 내에 효율 좋게 축적할 수 있다. 또한, 본 발명에 관한 시그널 펩티드나 해당 시그널 펩티드를 코드 하는 핵산을 - 5 -

6 사용함으로써 DB1 단백질을 효율 좋게 축적시킴으로써 식물에 내충( 耐 蟲 ) 활성을 부가 또는 식물의 내충( 耐 蟲 ) 활성을 향상시킬 수 있다. [0037] 도면의 간단한 설명 도 1은 실시예로 사용한 플라스미드의 제작 과정을 나타내는 순서도, 도 2는 실시예로 사용한 플라스미드의 제작 과정을 나타내는 순서도, 도 3은 실시예로 사용한 플라스미드의 제작 과정을 나타내는 순서도 이다. [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 신규 시그널 펩티드 본 발명에 관한 시그널 펩티드는, 나가이모(Dioscorea batatas) 유래의 DB1단백질 전구체에 포함되는 23개의 아미노산 잔기( 殘 基 )로 이루어지는 펩티드이다. 본 발명에 관한 시그널 펩티드를 코드 하는 핵산의 염기서열 및 시그널 펩티드의 아미노산 배열을, 각각 서열목록 1 및 2로 나타냈다. 또한, 본 발명에 관한 시그널 펩티드는, 서열목록 2에 나타낸 아미노산 배열열로부터 이루어지는 것에 한정되 지 않고, 예를 들면, 서열목록 2에 나타낸 아미노산배열에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산 잔기( 殘 基 )가 치 환( 置 換 ), 결실( 缺 失 ), 부가( 附 加 ) 또는 삽입( 揷 入 )된 아미노산 배열로부터 이루어지고, 시그널 펩티드로서 가능한 것도 포함된다. 여기서, 복수개의 아미노산 잔기로서는 예를 들면 2 5개의 아미노산 잔기를 들 수 있고, 바람직하게는 2 3 개의 아미노산 잔기를 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 2개의 아미노산 잔기 이 다. 서열목록 2에 나타낸 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산 잔기( 殘 基 ) 치환( 置 換 ), 결실( 缺 失 ), 부가( 附 加 ) 또는 삽입( 揷 入 )된 아미노산 배열이 시그널 펩티드로서 기능할 것인가 아닌가는, 종래 공지의 어 떤 수법을 적용해도 좋다. 예를 들면, 대상의 아미노산 배열을 상류에 소유하고 있는 단백질을 발현시켜, 소 포체 획분에 있어서의 해당 단백질을 검출한다. 대상의 아미노산배열이 시그널 펩티드로서 기능할 경우, 해당 단백질이 소포체( 小 胞 體 ) 획분( 畵 分 )에 있어서 그 단백질을 검출한다. 또한, 본 발명에 관한 시그널 펩티드는, 소위 소포체( 小 胞 體 ) 시그널 펩티드로서 기능한다. 소포체( 小 胞 體 ) 시그널 펩티드와로는 시그널 인식 입자(Signal recognition particle:srp)에 의해 인식되는 펩티드다. SRP는 리보솜(ribosome)에서 번역된 소포체 시그널 펩티드와 결합한 상태로 소포체 표면의 SPR 수용체와 결합한다. 소포체에서는, SRP와 소포체 시그널 펩티드가 분해하고, 그 후, 펩티아제에 의해 소포체 시그널 펩티드를 절 단하고, 그 후의 번역이 진행해서 성숙형의 단백질이 합성된다. 또한, 본 발명에 관한 시그널 펩티드는, 서열목록 2에 나타낸 아미노산 배열에 대하여 예컨대 75% 이상, 바람 직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 유사도를 소유하는 아미노산 배열로부터 이루어지고, 시그널 펩티드로서 기능하는 것이여도 좋다. 여기서, 유사도의 값은 BLAST( Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 실장한 컴퓨터 프로그램을 이용해서 디폴트의 설정으로 산출할 수 있다. 게다가, 본 발명에 관한 시그널 펩티드는, 서열목록 1에 나타낸 염기서열로부터 이루어지는 핵산에 의해 코드 되는 것에 한정되지 않고, 서열목록 1에 나타낸 염기서열로 이루어지는 핵산의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 아래에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의해 코드 되어 시그널 펩티드로서 기능하는 것이여도 좋다. 여기 서, 스트린젠트한 조건으로는 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들면, 45, 6 SSC(염화나트륨/구연산 나트륨)에서의 하이브리디제이션, 그 후의 50 65, SSC, 0.1% SDS에서의 세정을 들 수 있고, 혹은 그러한 조건으로서, 65 70, 1 SSC에서의 하 이브리디제이션, 그 후의 65 70, 0.3 SSC에서의 세정을 들 수 있다. 하이브리디제이션은 J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manu al, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)에 기재되 어 있는 방법 등, 종래 공지의 방법으로 할 수 있다. 본 발명에 관한 시그널 펩티드는 소망의 단백질의 N 말단측에 연결하는 것으로, 해당 단백질을 식물체 내에 고축적시킬 수 있다. 한편, 또한, 식물체 내에 있어서 발현되는 단백질은 상기 시그널 펩티드와의 융합한 단 백질 전구체로서 발현되고, 그 후, 시그널 펩티다아제(peptidase)에 의해 시그널 펩티드 영역이 절단되어 성 - 6 -

7 숙형 단백질로서 존재하는 것으로 된다. [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] 상기 시그널 펩티드를 포함하는 단백질 전구체는, 종래 공지의 수법에 의해, 해당 전구체를 코드 하는 핵산을 발현 벡터에 짜 넣어 얻을 수 있었던 발현 벡터를 식물체에 도입하는 것으로 해당 식물체에 축적할 수 있다. 발현 벡터는, 식물 내에서 발현을 가능하게 하는 프로모터와, 상술한 전구체를 코드 하는 핵산을 포함하도록 구축한다. 발현 벡터의 모체로 되는 벡터로서는, 종래 공지의 각종 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들면, 플라 스미드, 파지(phage), 또는 고스미드 등을 이용할 수 있고, 도입되는 식물세포나 도입 방법에 따라서 적당히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 pbr322, pbr325, puc19, puc119, pbluescript, pbluescriptsk, pbi계 의 벡터 등을 들 수 있다. 특히, 식물체에의 벡터의 도입법이 애구로박테리움을 이용하는 방법일 경우에는, pbi계의 바이너리 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. pbi계의 바이너리 벡터로서는 구체적으로는 예를 들면, pbig, pbin19, pbi101, pbi121 등을 들 수 있다. 프로모터는, 식물체 내에서 상기 전구체를 코드 하는 핵산을 발현시키는 것이 가능한 프로모터라면 특히 한정 되는 것은 아니고, 공지의 프로모터를 호적하게 이용할 수 있다. 특히, 프로모터로서는, 식물체 내에 있어서 하류의 유전자를 항상적으로 발현시키는 항상발현( 恒 常 發 現 ) 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 걸리는 프로모터로서는, 예를 들면, 콜리플라워모자이크바이러스 35S 프로모터(CaMV 35S), 각종 엑틴 유전자 프로모 터, 각종 유비키틴 유전자 프로모터, 노파린 합성 효소유전자의 프로모터, 담배의 PR1a 유전자 프로모터, 토 마토의 리브 로스(rib roast)1,5-2 인산 카르복실라아제ㆍ옥시게나이제 소 서브유니트 유전자 프로모터, 나 핀 유전자 프로모터 등을 들 수 있다. 이 중에도 콜리플라워모자이크바이러스 35S 프로모터, 엑틴 유전자 프 로모터 또는 유비키틴 유전자 프로모터를 보다 바람직하게 이용할 수 있다. 상기 각 프로모터를 이용하면, 식 물세포 내에 도입되었을 때에 임의의 유전자를 강하게 발현시키는 것이 가능해진다. 또한, 프로모터로서는, 식물에 있어서의 부위 특이적으로 발현시키는 기능을 소유하는 것을 사용할 수도 있다. 이러한 프로모터로서는, 종래 공지의 어떤 프로모터를 사용할 수 있다. 이러한 프로모터를 사용하여 상 기 전구체를 부위 특이적으로 발현시킬 수 있다. 또한, 발현 벡터는, 프로모터 및 상기 전구체를 코드 하는 핵산에 더해서, 게다가 다른 DNA 세그먼트를 포함 하고 있어도 좋다. 그 다른 DNA 세그먼트는 특히 한정되는 것이 아니지만, 터미네이터, 선별 마커, 인핸서, 번역 효율을 높이기 위한 염기배열 등을 들 수 있다. 또, 상기 발현 벡터는, 더욱 T-DNA 영역을 소유하고 있 어도 좋다. T-DNA 영역은 특히 애구로박테리움을 이용해서 상기 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 경우 에 유전자 도입의 효율을 높일 수 있다. 전사( 傳 寫 ) 터미네이터는 전사( 傳 寫 ) 종결 부위로서의 기능을 소유하고 있으면 특히 한정되는 것이 아니고, 공지의 것이어도 좋다. 예를 들면, 구체적으로는 노파린 합성 효소 유전자의 전사 종결 영역(Nos 터미네이 터), 콜리플라워모자이크바이러스 35S의 전사 종결 영역(CaMV35S 터미네이터) 등을 바람직하게 이용할 수 있 다. 이 중에서도 Nos 터미네이터를 보다 바람직하게 이용할 수 있다. 상기 발현 벡터에 있어서는, 전사 터미 네이터를 적당한 위치에 배치함으로써 식물 세포에 도입된 후에, 불필요하게 긴 전사물을 합성시킨다고 하는 현상의 발생을 방지할 수 있다. 형질전환체 선별 마커로서는, 예를 들면 약제 내성 유전자를 이용할 수 있다. 걸리는 약제 내성 유전자가 구 체적인 하나의 예로서는, 예를 들면, 하이그로마이신, 블레오마이신(bleomycin), 카나마이신(kanamycin), 겐 타마이신, 클로람페니콜(chloramphenicol) 등에 대한 약제 내성 유전자를 들 수 있다. 그에 따라, 상기 항생 물질을 포함하는 배지에서 생육하는 식물체를 선택함으로써, 형질전환된 식물체를 용이하게 선별할 수 있다. 또, 형질전환체 선별 마커로서는, 소정의 약제에 대하여 저항성을 부여하는 변이형 아세트 유산합성 효소 유 전자를 사용할 수도 있다. 발현 벡터의 구축 방법에 대해서도 특히 한정되는 것이 아니고, 적의 선택된 모체가 되는 벡터에, 상기 프로 모터 및 상기 전구체를 코드 하는 핵산 및 필요에 따라 상기 기타의 DNA 세그먼트를 소정의 순서로 되도록 도 입하면 좋다. 예를 들면, 상기 전구체를 코드 하는 핵산과 프로모터와(필요에 따라 전사 터미네이터 등)을 연 결해서 발현 카세트를 구축하고, 이것을 벡터에 도입하면 좋다. 발현 카세트의 구축에서는, 예를 들면, 각 DNA 세그먼트의 절단 부위를 서로 상보적인 돌출 말단으로서 두고, 라이게이션 효소로 반응시키므로 해당 DNA 세그먼트의 순서를 규정하는 것이 가능해진다. 또한, 발현 카세트에 터미네이터가 포함될 경우에는, 상류에서, 프로모터, 상기 전구체를 코드 하는 핵산, 터미네이터의 순으로 되어 있으면 좋다. 또, 발현 벡터 를 구축하기 위한 시약류, 즉, 제한 효소나 라이게이션 효소 등의 종류에 대해서도 특히 한정되는 것이 아니 고, 시판하고 있는 것을 적의 선택해서 이용하면 좋다

8 [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] 또, 상기 발현 벡터의 증식 방법(생산 방법)도 특히 한정되는 것이 아니고, 종래 공지의 방법을 이용할 수 있 다. 일반적으로는 대장균을 호스트로서 그 대장균 내에서 증식시키면 좋다. 이때 벡터의 종류에 따라 바람직 한 대장균의 종류를 선택해도 좋다. 상술한 발현 벡터는, 일반적인 형질전환 방법에 의해 대상의 식물 내에 도입된다. 발현 벡터를 식물 세포에 도입하는 방법(형질전환방법)은 특히 한정되는 것이 아니고, 식물 세포에 따른 적절한 종래 공지의 방법을 이 용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 애구로박테리움을 이용하는 방법이나, 직접 식물 세포에 도입하는 방법을 이용할 수 있다. 발현 벡터를 직접 식물 세포에 도입하는 방법으로서는, 예를 들면, 마이크로 인젝션 법, 엑스트라폴레이션법(전기천공법), 폴리에틸렌 글리콜(glycol)법, 파티클(particle)암법, 프로토플래스트 (protoplast) 융합법, 인산 칼슘법 등을 이용할 수 있다. 또한, DNA를 직접 식물세포에 도입하는 방법을 채택한다면, 대상으로 하는 유전자의 발현에 필요한 전사유니 트, 예를 들면 프로모터나 전사 터미네이터와, 대상으로 하는 유전자를 포함한 DNA라면 충분해서 벡터 기능이 필수적이지 않다. 게다가, 전사유니트를 갖지 않는 대상으로 하는 유전자의 단백질 코드 영역만을 포함하는 DNA이여도, 숙주의 전사유니트 내에 인티그레이트(integrate) 하고, 대상이 되는 유전자를 발현할 수 있으면 좋다. 상기 발현 벡터나, 발현 벡터를 포함하지 않는 대상으로 되는 유전자를 포함한 발현 카세트가 도입되는 식물 세포로서는, 예를 들면, 꽃, 잎, 뿌리 등의 식물기관에 있어서의 각 조직의 세포, 캘러스(callus), 현탁 배양 세포 등을 들 수 있다. 여기서, 발현 벡터는 생산하고자 하는 종류의 식물체에 맞춰서 적절한 것을 적당히 구 축해도 좋지만, 범용적인 발현 벡터를 미리 구축해 두고, 그것을 식물 세포에 도입해도 좋다. 내충( 耐 蟲 ) 활성의 부여 또는 증강 본 발명에서는 상술한 본 발명에 관한 시그널 펩티드를 이용하고, 나가이모(Dioscorea batatas)의 만노스 특 이적 렉틴 성숙 영역을 코드 하는 유전자를 발현함으로써 식물에 대하여 내충( 耐 蟲 ) 활성을 부여하거나, 내 충( 耐 蟲 ) 활성을 향상시킬 수 있다. 나가이모(Dioscorea batatas)의 만노스 특이적 렉틴 성숙 영역을 코드 하는 핵산의 염기서열 및 해당 성숙 영역의 아미노산 배열을 각각 서열목록 3 및 4에 나타냈다. 또한, 본 발명에 있어서 만노스 특이적 렉틴 성숙 영역은 서열목록 4에 나타낸 아미노산 배열로부터 되는 것 으로 한정되지 않고, 예를 들면, 서열목록 4에 나타낸 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수 개의 아미노산 잔 기가 치환, 결실( 缺 失 ), 부가 또는 삽입된 아미노산 배열로부터 이루어지고, 만노스를 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 것도 포함된다. 여기서, 복수 개의 아미노산 잔기로서는 예를 들면 2 30 개의 아미노산 잔기 를 들 수 있고, 바람직하게는 2 15 개의 아미노산 잔기를 들 수 있고, 가장 바람직하게는 2 10 개의 아 미노산 잔기이다. 서열목록 4에 나타낸 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실( 缺 失 ), 부가 또 는 삽입된 아미노산 배열이 만노스 특이적 렉틴으로서 기능할 것인가 아닌가는 종래 공지의 어떤 수법을 적용 해도 좋다. 예컨대 대상의 아미노산 배열로부터 이루어지는 단백질의 만노스 결합 활성을 측정함으로써 만노 스에 특이적으로 결합하는 활성을 평가할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 만노스 특이적 렉틴 성숙 영역은 서열목록 4에 나타낸 아미노산 배열에 대하여 예를 들면 75% 이상, 바람직하게는 80%이상, 보다 바람직하게는 90%이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 유사도를 갖는 아미노산 배열로부터 이루어져 만노스에 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 것이여도 좋다. 여기서 유사 도의 값은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 실장한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 디폴트 의 설정으로 산출할 수 있다. 게다가, 본 발명에 있어서 만노스 특이적 렉틴 성숙 영역은 서열목록 3에 나타낸 염기서열로부터 이루어지는 핵산에 의해 코드 되는 것에 한정되지 않고, 서열목록 3에 나타낸 염기서열로부터 이루어지는 핵산의 상보쇄 ( 相 補 鎖 )에 대하여 스트린젠트인 조건 아래에서 하이브리다이즈 하는 핵산에 의해 코드 되어 만노스에 특이적 으로 결합하는 활성을 갖는 것이여도 좋다. 여기서 스트린젠트인 조건으로는 소위 특이적인 하이브리드가 형 성되어 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들면, 45, 6 SSC(염화나트륨/구연 산 나트륨)에서의 하이브리디제이션, 그 후의 50 65, SSC, 0.1% SDS 에서의 세정을 들 수 있고, 혹은 그러한 조건으로서, 65 70, 1 SSC 에서의 하이브리디제이션, 그 후의 65 70, 0.3 SSC 에서의 세정을 들 수 있다. 하이브리디제이션은 비 특허문헌 7에 기재되고 있는 방법 등, 종래 공지의 방 법으로 할 수 있다

9 [0065] [0066] [0067] 내충( 耐 蟲 ) 활성을 부여 또는 향상시키는 대상이 되는 식물, 환언하면 상기 시그널 펩티드를 이용해서 만노스 특이적 렉틴을 축적하는 식물로서는 특히 한정되지 않는다. 즉, 상기 시그널 펩티드를 이용해서 만노스 특이 적 렉틴을 발현시키는 것에 의해, 모든 식물체에 대해서 내충( 耐 蟲 ) 활성을 부여 또는 향상시킬 수 있다. 대 상이 되는 식물로서는 예를 들면, 쌍떡잎 식물, 단자옆 식물, 예를 들면 벼과나 유채과의 식물을 들 수 있지 만, 이 식물에 한정되는 것은 아니다. 벼과의 식물로서는 옥수수(Zea mays), 벼(Oryza sativa), 보리(Hordeum vul gare), 밀(Triticum aestivum), 버섯(Phyllostachys), 사탕수수(Saccharum offici narum), 네피아그라스(Pennisetum pupureum), 에리안사스 (Erianthus ravenae), 미스칸더스(참억새)(Miscanthus virgatum), 솔껌(Sorghum), 스위치글래스(Panicum) 등 을 들 수 있다. 유채과의 식물로서는 시로이누나즈나(Arabidopsis thaliana), 유채(Brassica rapa, Brassica napus, Brassica campestris), 양배추(Brassica oler acea var. capitata), 배추(Brassica rapa var. pekinensis), 청경채(Brassica ra pa var. chinensis), 순무(Brassica rapa var. rapa), 노자와나(Brassica rapa va r. hakabura), 미즈나(Brassica rapa var. lancinifolia), 소송채(Brassica rapa v ar. peruviridis), 파크쵸이(Brassica rapa var. chinensis), 무(Raphanus sativu s), 고추냉이(Wasabia japonica) 등을 들 수 있다. 여기서 내충( 耐 蟲 ) 활성으로는 특히 흡즙성 해충에게 대한 살충 활성 또는 기피 활성을 의미한다. 흡즙성 해 충으로서는 특히 한정되지 않지만, 노린재눈 해충, 예를 들면 매미과의 이와사키크사제미(Mogannia minuta) 등, 아와후킴시과의 시로오비아와후키(Aphrophora intermedia) 등, 뿔매미과의 도비이로쯔노제미(Mach aerotypus sibiricus) 등, 멸구과의 후타텐히메요코바이(Arboridia apicalis), 쟈노미드리히메요코바이 (Empoasca onukii), 쯔마구로요코바이(Nephotettix cinctice ps), 이나즈마요코바이(Recilia dorsalis) 등, 마름 멸구과의 마름 멸구(Pentasti ridius apicalis) 등, 멸구과의 히메트비운카(Laodelphax striatellus), 트비이로운카(Nilaparvata lugens), 세지로운카(Sogatella furcifera) 등, 시마 멸구과의 시마 멸구(Nisia nervosa) 등, 하네나가운카과의 사토마다라운카(Kamendaka sacch arivora) 등, 고가라시운카과의 렛드판가스 백(Achilus flammeus) 등, 하고로모과의 벳코하고로모(Orosanga japonicus) 등, 아오바하고로모과의 도비이로 하고로모(Mim ophantia maritima) 등, 기지라미과의 나시키지라미(Cacopsylla pyrisuga) 등, 히메키지라미과 의 만고키지라미(Calophya mangiferae) 등, 피로키세라과의 후드네아부람시(Daktulosphaira vitifoliae) 등, 가사아부람시과의 가라마쯔카사아부람시(Adelges laricis), 하리모미히노카사아부람시(Adelges tsugae) 등, 진딧물과의 엔도히게나가아부람시(Acyrthosiphon pisum), 내장 진딧물(Aphis gossypii), 유키야나기아부람시 (Aphis spiraecola), 니세다이콘아부람시(Lipaphis erysimi), 복숭아진딧물(Myzus persicae), 무기미도리아부 람시(Schizaphis graminum), 무기쿠비레아부람시(Rhopalosiphum padi) 등, 고나지라미과의 미칸트게코나지라 미(Aleurocan thus spiniferus), 다바코코나지라미(Bemisia tabaci), 시루바리후코나지라미(Bem isia argentifolii), 온시쯔코나지라미(Trialeurodes vaporariorum) 등, 와타후키카이가람시과의 오와라지카이가람 시(Drosicha corpulenta), 이세리아카이가람시(Icerya purchasi) 등, 코나카이가람시과의 파이낫푸루코나카이 가람시(Dysmicoc cus brevipes), 미칸코나카이가람시(Planococcus citri), 구와코나카이가람시(Pseu dococcus comstocki) 등, 가타카이가람시과의 쯔노로움시(Ceroplastes ceriferus)등, 가타카이가라모드키과의 간샤카타 카이가라모드키(Aclerda takahashii) 등, 마루카이가람시과의 아카마루카가람시(Aonidiella aurantii), 나시 마루카이가람시(Di aspidiotus perniciosus), 야노네카이가람시(Unaspis yanonensis) 등, 가스미 노린재과의 라이가스백(Lygus hesperus), 아카히게호소미드리카스미가메(Trigonotylus caelestialium) 등, 군바임시과의 쯔쯔지군바이(Stephanitis pyrioides), 나시군바이(Stephanitis nashi) 등, 노린재과의 토게시라호시카멤시 (Eysarcoris aeneus), 벼 노린재(Lagynotomus elongatus), 미나미아오카멤시(Nezara viridula), 쟈바네아오카 멤시(Plautia crossota) 등, 둥근 노린재과의 다이완마루카멤시(Megacopta cr ibraria) 등, 긴 노린재과의 간 샤코바네나가카멤시(Cavelerius saccharivorus) 등, 메다카나가카멤시과의 오메다카나가카멤시(Malcus japonicus) 등, 호시카멤시과의 아카호시카멤시(Dysdercus cingulatus) 등, 호소헤리카멤시과의 호소쿠모헤리 카멤시(Leptocorisa acuta), 구모헤리카멤시(Leptocorisa chinensis) 등, 허리 노린재과의 오쿠모헤리카멤시 (Anacanthocoris striicornis) 등, 히메헤리카멤시과의 아카히메헤리카멤시(Rhopalus maculatus) 등, 빈대과 의 빈대(Cimex lectularis) 등을 들 수 있다. 또, 엉겅퀴말눈 해충, 예를 들면 엉겅퀴말눈과의 히라즈하나아 자미우마(Frankliniella intonsa), 미칸키이로아자미우마(Frankliniella occidentalis), 쟈노키이로아자미우 마(Scirtothrips dorsalis), 미나미키이로아자미우마(Thrips pa lmi), 파 총채벌레(Thrips tabaci) 등, 구다 아자미우마과의 가키쿠다아자미우마( Ponticulothrips diospyrosi), 이네쿠다아자미우마(Haplothrips aculeatus) 등을 들 수 있다. 더구나, 식물 기생성 진드기류, 예를 들면 하시리다니과의 보리 진드기 (Penthaleus major) 등, 먼지 진드기과의 시쿠라멘호코리다니(Phytonemus palli dus), 쟈노호코리다니 - 9 -

10 (Polyphagotarsonemus latus) 등, 진드기과의 진드기의 일종(Siteroptes sp.) 등, 히메하다니과의 부도히메하 다니(Brevipalpus lewisi) 등, 게나가하다니과의 나미케나가하다니(Tuckerella pavoniformis) 등, 하다니과의 안즈아케하다니(Eotetranychus boreus), 미칸하다니(Panonychus citri), 린고하다니( Panonychus ulmi), 나미 하다니(Tetranychus urticae), 간자와하다니(Tetranychus kanzawai) 등, 나가쿠다후시다니과의 마쯔후시다니 (Trisetacus pini) 등, 마디 진드기과의 미칸사비다니(Aculops pelekassi), 나시사비다니(Epitrimerus pyri), 시토라스라스토마이트(Phyllocoptruta oleivora) 등, 하리나가후시다니과의 이누쯔게후시다니(Diptacus crenatae) 등, 고나다니과의 무기코나다니(Aleuroglyphus ovat us), 게나가코나다니(Tyrophagus putrescentiae), 로빈네다니(Rhizoglyphus robin i) 등을 들 수 있다. 또, 내충( 耐 蟲 ) 활성은 예를 들면, 식 물에 암컷 성충을 소정의 기간접촉시켜 생육한 차세대의 유충의 수를 측정하는 것으로 평가할 수 있다. 또한, 유충을 식물에 접촉시켜, 성충에 도달하는 비율을 측정하는 것에 의해 평가할 수도 있다. 내충( 耐 蟲 ) 활성의 부여로는 야생형에 있어서 내충( 耐 蟲 ) 활성을 갖지 않지만, 상기 시그널 펩티드를 이용해서 만노스 특이적 렉 틴을 축적하는 것에 의해 내충( 耐 蟲 ) 활성을 갖게 되는 것을 의미한다. 내충( 耐 蟲 ) 활성의 향상으로는 상기 시그널 펩티드를 이용해서 만노스 특이적 렉틴을 축적한 재조합 식물의 내충( 耐 蟲 ) 활성이 야생형에 있어서의 내충( 耐 蟲 ) 활성과 비교해서 유의하게 크게 되고 있는 것을 의미한다. [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] 특히, 본 발명에 있어서는 실용 작물인 벼에 대하여 상술한 본 발명에 관한 시그널 펩티드를 이용하여 나가이 모(Dioscorea batatas)의 만노스 특이적 렉틴 성숙 영역을 코드 하는 유전자를 발현, 축적함으로써 벼에 내충 ( 耐 蟲 ) 활성을 부여할 수 있다. 실시예 이하, 본 발명을 실시 예를 이용해서 더욱 상세하게 설명한다. 단, 본 발명의 기술범위는 이들 실시예에 한정 되는 것은 아니다. (1) 나가이모렉틴 DB1유전자의 염기배열 결정 나가이모 덩이 줄기로 Concert Plant RNA Reagent(Invitrogen 사)를 이용해서 프로토콜을 따라 전체 RNA를 추 출했다. 계속해서 Micro-FAST Track mrna Isolation Kit(Invitrogen 사)를 이용해서 프로토콜을 따라서 폴리 에틸렌(A)+RNA를 정제했다. Marathon cdna Amplification Kit(BD Biosciences Clontech)을 이용하고, 5 말단에 Marathon cdna Adaptor를 부가한 cdna를 합성했다. 그 cdna를 주형으로 해서 기보( 旣 報 )의 DB1(DDBJ 잿물세션 No.AB178475) 배열에 상 보적인 프라이머(primer) XB/DB1F(5 -TCTAGAGGATCCATGGCCGATTTCATACTT-3 (배열번호 5), 밑줄 부분은 Xba 와 Bam HI 인식 사이트)와 S/DB1R(5'- GAGCTCTCACTTGTTGACGACC-3 (배열번호 6), 밑줄 부분은 Sac 인식 사 이트)의 조합으로 PCR을 표 1 및 표 2에 나타낸 조건으로 하고, PCR 생성물의 염기서열을 결정했다. 얻어진 DNA 배열은 서열목록 3에 나타낸 바와 같다. 더구나 본 PCR 생성물을 pgem-t벡터(invitrogen 사)에 TA 클로닝 했다. 기보( 旣 報 )의 DB1(DDBJ 잿물세션 No.AB178475) 유전자가 짜 넣어진 플라스미드를 가진 대장균 콜로니로 부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN 사)에 의해 플라스미드 1을 단리( 單 離 ) 했다. 또한, 조작의 개략을 도 1에 나타냈다. 표 1 [0075]

11 표 2 [0076] [0077] [0078] [0079] (2) DB1 단백질 전구체에 포함되는 시그널 배열을 코드하는 DNA의 클로닝(cloning)과 염기서열 결정 나가이모덩어리 줄기로 Concert Plant RNA Reagent(Invitrogen 사)를 이용해서 프로토콜을 따라 전체 RNA를 추출했다. 계속해서 Micro-FAST Track mrna Isolation Kit(Invitrogen 사)를 이용해서 프로토콜을 따라서 폴 리에틸렌(A)+RNA를 정제했다. Marathon cdna Amplification Kit(BD Biosciences Clontech)을 이용해서 cdna의 5 말단에 Marathon cdna Adaptor를 부가한 cdna를 키트의 프로토콜을 따라 합성했다. Marathon cdna Adaptor가 붙은 DB1cDNA를 주형으 로 해서 cdna Adaptor에 상보적인 Adaptor Primer(AP1;5 -CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 (배열번호 7))과, 기보( 旣 報 )의 DB1(DDBJ 잿물세션 No.AB178475) 배열에 상보적인 프라이머(primer)(DB1midR;5 - CATTTCCCACGTTGGTGT-3 (배열 번호8))을 이용하여 표 3 및 4에 나타낸 조건으로 5 -RACE PCR을 행했다. 표 3 [0080]

12 표 4 [0081] [0082] [0083] 그 다음에, 얻어진 PCR 생성물을 pgem-t Easy Vector(Promega)에 TA 클로닝하고, 대장균 JM109주에 도입하여 안티피린 50ppm을 함유하는 LB 배양지 상에서 선발했다. 원하는 플라스미드를 가진 대장균 콜로니로부터 플라 스미드를 QIAprep Sp in Miniprep Kit(QIAGEN 사)에 의해 회수하고, Adaptor primer와 DB1midR primer를 이용 해서 염기서열을 결정했다. Adaptor primer와 DB1midR primer 간의 밝혀진 유전자 배열 및 추정 아미노산 배 열을 각각 서열목록 9 및 10에 나타냈다. 그 다음에, 서열목록 9에 나타낸 DNA 배열의 최초의 ATG의 상류에 Xba 와 Bam HI를 부가한 프라이머 (primer)(xb/ndb1f;5 -TCTAGAGGATCCATGGCTAACCCAGGAGCA-3 (서열목록 11), 밑줄 부분은 Xba 와 Bam HI 인식 사이트) 및, 기보( 旣 報 )의 DB1의 cdna 배열(DDBJ 잿물세션 No.AB178475)의 스툽코돈을 포함하는 17 염기에 상 보적인 배열로 Sac 배열을 부가한 프라이머(primer)(S/DB1R;5 -GAGCTCTCACTTGTTGA CGACC-3 (서열목록 12), 밑줄 부분은 Sac 인식사이트)를 이용하고, 처음에 합성한 나가이모 덩이 줄기의 cdna를 주형으로 해서 표 5 및 6에 나타낸 조건으로 PCR을 행하여 전장( 全 長 ) DB1DNA를 얻었다. 전장( 全 長 ) DB1DNA의 배열을 서열목록 13 에 나타냈다. 전장 cdna로부터 예상되는 아미노산 배열(서열목록 14)에 근거해서 세포내 국 존재예측 데이터 베이스(predotar)를 이용해서 예측하면, 서열목록 1 및 2에 나타낸 영역에 소포체 이행 시그널 배열이 확인되 었다. 표 5 [0084]

13 표 6 [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] 그 다음에, 본 PCR 생성물을 pgem-t벡터(invitrogen 사)에 TA 클로닝 했다. 전장( 全 長 ) 나가이모 DB1 유전자 가 짜 넣어진 플라스미드를 가진 대장균 콜로니로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN 사)에 의해 플라스 미드 2을 단리( 單 離 ) 했다. 또한, 조작의 개략을 도 1 및 도 2에 나타냈다. (3) 유전자 재조합 벼의 작출과 DB1 유전자 도입의 확인 배열번호 13에 나타낸 전장( 全 長 ) 나가이모 DB1 유전자를 바이너리 벡터에 삽입하고, 통상의 아그로박테리움 법을 이용해서 벼(Oryza sativa L.) 대중( 臺 中 ) 65호에 유전자 도입했다. <벼종자의 사전 배양> 감염용 벼 캘러스(callus)의 배양으로서 탈곡 완료한 벼 종자를 50ml 원심용 튜브에 집어넣고, 벼 종자멸균 용액(차아염소산 나트륨 수용액, 유효염소농도 2% (wt%), 0.5% Tween 20을 40ml 가해 15분간 전도 혼화하면서 세정했다. 용액만을 데칸트에서 제거해 멸균수로 4 5회 세정하고, 차아염소산을 제거했다. 멸균한 여지상에 종자를 비우고, 수분을 제거해 N6CI 배양지에 치상( 置 床 ) 하고, 30, 16L/8D의 조건으로 배양했다. 2주간 마 다 계대( 繼 代 ) 하고, 1개월 반 계대( 繼 代 ) 후의 캘러스(callus)를 형질 전환에 사용했다. <컨스트럭트(construct)의 작성> Ⅰ) 35S-DB1 배열번호 13에 나타낸 전장( 全 長 ) 나가이모 DB1 유전자를 바이너리 벡터 E12-35S-Ω(비 특허문헌 8)의 BamH /Sac 사이트에 삽입하고, 컨스트럭트(constr uct)를 작성했다 (도 2/바이너리 벡터 2). Ⅱ) RSs1-DB1 5'말단에 Sal 의 제한 효소절단 부위를 붙인 플라이머(primer)(Sal/RSs1 F)와 3'말단에 BamH 의 제한 효소 절단 부위를 붙인 플라이머(primer)(Bam/RSs1 R)를 이용하고, 대중( 臺 中 ) 65호로부터 추출한 벼 게놈을 템플 릿으로 해서 KOD PL US(TOYOBO)을 이용한 PCR을 표 7 및 8에 나타낸 조건으로 하여 Rice sucrose synthase 1 프로모터(RSs1Pro.)를 클로닝했다

14 표 7 [0096] 표 8 [0097] [0098] 그 다음에, PCR 생성물에 대하여 1.5% 아가로스겔을 이용해서 전기영동을 하고, RSs1 프로모터의 단편을 겔로 추출했다. rtaq(takara)을 이용한 PCR을, 표 9 및 10에 나타낸 조건으로 해 단편( 斷 片 )의 양단에 A(adenine) 을 부가한 후, pgem-t Vector(안티피린; Amp 내성)(Promega)에 삽입(TA cloning;16 o/n)하고, 대장균에 클 로닝했다. 표 9 [0099]

15 표 10 [0100] [0101] 다음에, Amp 내성, RSs1Pro. cdna를 가지는 콜로니를 Sal/RSs1 F, RSs1600 R의 플라이머(primer)를 이용한 콜 로니 PCR에 의해 선발했다. 콜로니 PCR의 조건을 표 11, 12 및 13에 나타냈다. 얻어진 콜로니를 Amp를 가한 LB 배양지에 식균( 植 菌 )하고, QIAprep spin miniprep kit(qiagen)를 이용하여 플라스미드를 정제했다. 얻어 진 플라스미드에 대하여 Sal 와 BamH 에서 제한 효소처리를 하고, RSs1 Pro. 를 절출( 切 出 )했다. 바이너리 벡터(pBI101H)를 Sal 와 BamH 에서 제한 효소처리하고, RSs1 Pro.를 연결(ligation) 했다(RSs1 바이너리). 서열목록 13에 나타낸 전장( 全 長 ) 나가이모 DB1 유전자를, RSs1 바이너리의 BamH /Sac 사이트에 삽입하고, 컨스트럭트를 작성했다(도 3/바이너리 벡터 4). 표 11 [0102] 표 12 [0103]

16 표 13 [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] 사용한 플라이머(primer)를 아래에 정리해서 나타냈다. 또한, 밑줄부는 제한 효소부위다. XB/NDB1 F: 5 -TCTAGAGGATCCATGGCTAACCCAGGAGCA-3 (서열목록 15) S/DB1 R: 5 -GAGCTCTCACTTGTTGACGACC-3 (서열목록 16) Sal/RSs1 F: 5 -GTCGACCTTTCGTGACTTGTTTTCGC-3 (서열목록 17) Bam/RSs1 R: 5 -GGATCCTAGCTTGGCAGCCAT-3 (서열목록 18) RSs1 600 R: 5 -CCAAACAAGAACAAACCGGC-3 (서열목록 19) <바이너리 백터 컨스트럭트(construct)의 작성> 플라스미드 1 및 플라스미드 2를 Sac (TAKARA BIO 사)로 처리 후, DNA PCR & Gel Purification Kit(GE Healthcare 사)로 DNA를 정제했다. 계속해서 Bam HI(TAKARA BIO 사)로 절단하고, 아가로스겔(0.8%)로 전기영 동 하고, 플라스미드 1로부터는 456bp의 밴드를, 플라스미드 2로부터는 525bp의 밴드를 아가로스겔로부터 회 수하고, DNA PCR & Gel Purification Kit(GE Healthcare 사)에서 DNA를 정제했다. 한편, 바이너리 벡터(El2-35S-Ω)를 Sac (TAKARA BIO 사)로 처리 후, DNA PCR & Gel Purification Kit(GE Healthcare 사)로 DNA를 정제했다. 계속해서 Bam HI(TAKARA BIO 사)로 절단하고, 아가로스겔(0.8%)로 전기영 동 하고, GUS 유전자를 제거한 DNA 부분을 DNA PCR & Gel Purification Kit(GE Healthcare 사)를 사용해서 정 제했다. 본 바이너리 벡터 부분의 DNA를 플라스미드 1 및 플라스미드 2로부터 절단한 456bp 및 525bp의 DNA를 각각 DNA Ligation Kit(TAKARA BIO 사)를 이용해서 라이게이션하고, 시그널 배열 결실( 缺 失 ) DB1 유전자를 짜 넣은 바이너리 벡터 1과 전장( 全 長 ) DB1 유전자를 짜 넣은 바이너리 벡터 2를 제작했다. <아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)에의 컨스트럭트의 도입> 작성한 상기의 바이너리 벡터 1μg를, 아그로박테리움(Agrobacterium tumef aciens)의 EHA105계통에 도입하고, 카나마이신(kanamycin)에서 선발했다. 콜로니PCR에 의해 DB1c DNA의 도입을 확인할 수 있었던 아그 로박테리움을 형질전환에 이용했다. <아그로박테리움 전( 前 ) 배양> 형질 전환을 하는 3일 전에 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 AB 고형 배지(50mg/l 하이그로마이 신)에 도포하고, 24, 암흑조건 아래에서 3일간 배양했다. [0118] <아그로박테리움의 감염과 공존 배양>

17 [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] 50ml 팔콘 튜브에 AA 배지를 40ml 넣고, 아세트실린곤을 40mg/l이 되도록 가했다. 전( 前 ) 배양한 아그로박테 리움을 200μl 칩의 앞에서 소량 취해, 전술의 AA배지 중에 녹여 암흑조건 아래에서 30분간 진탕 했다. 1 개 월 반 배양한 벼 캘러스를, 아그로박테리움을 넣은 AA 배지에 넣어, 1.5분간 진탕 했다. AA 배지의 상등액을 비이커에 비우고, 여분의 AA 배지를 멸균한 김타월(상품명: 주식회사 크레시아제)로 제거했다. N6CO 배지 (40mg/l 아세트실린곤 첨가)에 멸균 여지를 싣고, 그 위에 캘러스를 두어서 24, 암흑조건 아래에서 3일간 배양했다. <아그로박테리움의 제거와 선발> 공존 배양한 캘러스를 50ml 팔콘 튜브에 옮기고, 멸균수로 4회 세정했다. 그 후, 멸균수(50mg/l 메로펜)로 4 회 세정하고, 여분의 멸균수를 멸균한 김타월(상품명:주식회사 크레시아제)로 제거했다. 캘러스를 N6SE(30mg/l 하이그로마이신, 40mg/l 메로펜) 배지에 이식하고, 30, 16L/8D로 2 3주 동안 배양했다. <형질 전환체의 재분화> 선발 배양 후, 캘러스를 벼 재분화 배지(30mg/l 하이그로마이신, 40mg/l 메로펜)에 이식해 30, 16L/8D로 배 양하고, 재분화를 유도했다. 2주간마다 계대( 繼 代 )를 해 슈트(chute), 뿌리가 분화되어 오면 벼 발현 배지 (30mg/l 하이그로마이신, 40mg/l 메로펜)에 이식했다. 각 배지 조성은 아래에 정리해서 나타냈다. 선발에 의해 얻어진 캘러스로부터 이하에 나타낸 간이법에 의해 게놈을 추출하고, XB/NDB1F, S/DB1 R 플라이 머(primer)를 이용해서 표 14 및 15에 나타낸 조건으로 PCR을 해 유전자의 도입을 확인했다. 표 14 [0125] 표 15 [0126]

18 [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] PCR에 의해 유전자도입이 확인된 개체는 발현 배지에서 충분히 뿌리가 자랄 때까지 배양하고, 그 후, 지름 8cm의 비닐 포트에 이식해서 폐쇄계 온실(25 ± 1, 16L/8D)로 육성했다. 또한, 형질 전환체와 비형질전환 체에 있어서 생육에 차이는 보이지 않았다. <T 0 개체에 있어서의 간이법에 의한 유전자 도입의 확인> 식물체로부터 0.5 1cm 정도 크기의 엽편을 베어내고, 2 3 잎의 글라스 비즈 BZ-3(AS ONE)와 함께 1.5ml 튜브에 넣었다. DDW(멸균수)를 100μl 가해, 조직 분쇄기(QIAGEN Tissue Lyser)로 30회/초, 5분간 고속 진탕 함으로써 파쇄했다. 100μl의 DNA 추출 버퍼(buffer)(200mM Tris-HCl(pH7.5), 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS)을 가해, 전도 혼화하고나서 10분간 방치했다. 그 후 15,000rpm으로 10분간 원심분리했다. 상청 100μl을 새로운 1.5ml 튜브에 옮기고, 2-프로파놀을 등량 가해 전도 혼화했다. 충분히 휘저은 후, 15,000rpm으로 5분 간 원심분리했다. 상청을 피펫에서 완전히 제거하고, 10분간 바람에 말린 뒤, DDW 100μl을 넣어 보텍스 (vortex)에 의해 용해했다. 추출한 게놈 DNA는 4 로 보관했다. <T0개체에 있어서의 DB1 단백질 축적의 확인> 2ml 튜브에 벼 엽편( 葉 片 ) 0.1g를 넣어 액체 질소로 동결한 뒤 펫술에서 파쇄했다. 50mM의 Tris-HCl(pH7.0) 및 Protease Inhibitor(Roche사 제)를 각각 0.2ml 및 20μl씩 넣어 빙상에서 마쇄( 磨 碎 ) 했다. 추출액을 1.5ml 튜브에 옮기고, 2, 000rpm으로 10분간 원심분리했다. 상청( 上 淸 )을 새로운 1.5ml 튜브로 옮기고, 15, 000rpm으로 10분간 원심분리했다. 상청( 上 淸 )을 단백질 추출액으로 했다. 얻어진 단백질 추출액 μl와 3 샘플 버퍼(buffer) 5μl, 50mM의 Tris-HCl(pH7.0)을 계 15μl로 되도록 혼합하고, 33분간 펄펄 끓인 후, 빙상에서 5분간 급냉하여 영동용 샘플로 했다. 포지티브 컨트롤 및 DB1의 농도 정량으로서, 나가이모 정제DB1(1.0ng/μl)을 1, 3, 5, 8, 10μl와 3 샘플 버퍼(buffer) 5μl, 50mM의 Tris-HCl(pH7.0)을 계 15μl이 되도록 가한 것을 작성하고, 동일하게 펄펄 끓임, 급냉한 것을 이용했 다. 이들을 15%의 폴리아크릴아미드겔을 이용하여 전기영동을 했다. 전기영동 후, 세미 드라이식 브롯팅을 행했다. PVDF 멘브렌 (0.45μm, Millipore)을 메탄올에 몇초간 담근 후, 트랜스퍼 버퍼(buffer)(글리신(glycine) 14.42g, Tris-HCl 3.02g, SDS 1.0g/1L)에 담갔다. 브롯팅을 장치 에 트랜스퍼 버퍼(buffer)로 담근 여지 6장, 겔, 맴브레인, 여지 6장의 순서대로 공기가 들지 않도록 포개고, 장치 뚜껑을 닫았다. 전류를 멤브레인의 크기(cm 2 ) 0.8mA 로 설정해서 1.0시간 브롯팅 했다. [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] 브롯팅 종료 후의 멤브레인을 TBS(50mM Tris-HCl, 0.9% NaCl, 0.02% NaN3, ph 8.0)에 10분간 담갔다. 멤브레 인을 멤브레인 백에 넣고, 블로킹(blocking) 버퍼(buffer)(20ml TBS, 5% 스킴 밀크(skim milk), 0.1% Tween20)을 넣어 실온에서 1시간 진탕, 혹은 4 로 밤새 블로킹(blocking) 했다. 멤브레인을 40rpm으로 진탕하면서 TBS-T(TBS, 0.1% Tween 20)로 10분간 2 회 씻었다. 멤브레인 백에 넣어 1차 항체액(10ml TBS-T, 0.1g BSA, 1μl anti-db1 rabbit antisera)을 가하고, 실온에서 1시간 진탕, 혹은 4 도로 밤새, 1차 항체반응을 했다. 1차 항체반응 후의 멤브레인을 40rpm으로 진탕하면서 TBS-T에서 10분간 2회 씻었다. 멤브레인 백에 넣어 2 차 항체액(10ml TBS-T, 0.1g BSA, 2μl anti-rabbit IgG(Fc), AP conjugate(promega))을 가해, 실온에서 1시 간 진탕하여 2차 항체반응을 했다. 2차 항체반응 후의 멤브레인을 40rpm으로 진탕하면서 TBS-T에서 10분간 씻었다. 세정액을 버리고, AP 9.5Buffer(100mM Tris-HCl(pH9.5), 100mM NaCl, 50mM MgCl2)에 멤브레인을 3분간 담가서 완충화시켰다. 멤브 레인을 멤브레인 백에 넣어서 발색액(10ml AP 9.5Buffer, 173mM NBT 50μl, 115.3mM BCIP 25μl)을 가해, 밴드가 검출될 때까지 가볍게 진탕 했다. 35S-DB1 도입계통의 T 0 개체 및 RSs1-DB1 도입계통의 T 0 개체에 있어서, DB1cDNA 플라이머와 같은 위치(519b p)에 밴드를 확인할 수 있었다. [0139] [0140] <T 1 개체에 있어서의 DB1 유전자 도입의 확인> 간이법에 의해 목적 유전자의 도입이 확인된 35S-DB1 도입 계통 및 RSs1-DB1도입 계통의 T 0 개체에 대해서 자

19 식( 自 殖 ) 차세대 T 1 개체를 전개했다. T 0 개체의 경우와 동일하게 간이법에 의해 T 1 개체의 게놈을 추출하고, XB/NDB1F, S/DB1 R 플라이머(primer)를 이용해서 PCR 을 행해 유전자의 도입을 확인했다. [0141] [0142] [0143] [0144] <T1 개체에 있어서의 DB1 단백질 축적의 확인> T 1 개체에 대하여 T 0 개체와 동일한 조작을 하여 DB1 단백질의 축적을 확인하였다. (4) 비교 대조용의 유전자 재조합 벼의 작출로 DB1 유전자 도입의 확인-1 상기 (3)에 준하여 서열목록 3에 나타낸 DB1 유전자를 바이너리 벡터에 삽입하고, 통상의 아그로박테리움 법 을 이용해서 벼(Oryza sativa L.) 대중( 臺 中 ) 65호에 유전자 도입했다. 간이법에 의해 T 0 개체의 게놈을 추출 하고, XB/NDB1F, S/DB1 R 플라이머(primer)를 이용해서 PCR을 행해 유전자의 도입을 확인했지만, 목적 유전자 의 도입은 확인되지 않았다. [0145] [0146] (5) 비교 대조용의 유전자 재조합 벼의 작출로 DB1 유전자 도입의 확인-2 상기 (3)의 RSs1-DB1 컨스트럭트의 작성 에 있어서의 GUS 유전자를 도입한 바이너리 벡터 3(도 3)을 이용하 고, 상기 (3)과 같은 유전자 재조합 조작을 하여 목적으로 하는 비교 대조용의 유전자 재조합 벼 T 1 개체를 작출했다. [0147] [0148] (6) 유전자 재조합 벼 T 0 개체의 히메트비운카(Laodelphax striatellus)에 대한 효과시험 PCR에 의해 유전자 도입이 확인된 개체를 발현 배지에 충분히 뿌리가 자랄 때까지 배양하고, 그 후, 지름 8cm 의 비닐 포트에 이식해서 폐쇄계( 閉 鎖 系 ) 온실 (25 ± 1, 16L/8D)로 육성했다. 개체가 3엽기에 달한 단계 에서 기쿠카와( 菊 川 ) 미즈타( 水 田 ) 흙을 넣은 1/10,000a 포트에 심도 2cm로 이식하고, 나일론제의 그물로 포 트를 덮고, 이식 7일 후 및 14일 후에 그물 속에 각각 히메트비운카의 암컷 성충 10 마리를 놓았다. 이식 42 일 후에 차세대 유충수 및 성충수를 조사했다. 그 결과를 표 16에 나타냈다. 표 16 [0149] 공시개체( 供 試 個 體 ) 유충 + 성충의 수 시그널 배열을 포함하는 DB1 유전자 도입 벼 11 시그널 배열을 부가하지 않은 DB1 유전자 도입 벼 196 비 재조합체 219 [0150] 표 16에 나타낸 바와 같이, 서열목록 3에 나타낸 시그널 배열을 포함하는 DB1 유전자를 도입한 T 0 개체는 비 재조합체와 비교하여 히메트비운카에 대한 대단히 뛰어난 방제 효과를 나타냈다. 또한, 서열목록 3에 나타낸 시그널 배열을 부가하지 않은 DB1 유전자만을 도입한 벼 T 0 개체는 비 재조합체와 비교하여 히메트비운카에 대 한 방제 효과가 얼마 안 되었다. [0151] [0152] (7)유전자 재조합 벼 T 1 개체의 히메트비운카(Laodelphax striatellus)에 대한 효과시험 벼 T 1 종자를 육묘 배토에 넣어 페이퍼 포트에 1알씩 파종하고, 격리 온실에서 재배했다. 파종 후 19일 후, 잎 의 일부로부터 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)을 이용하여 게놈 DNA를 추출해서 PCR 해석에 공시( 供 試 )했다. 하이그로마이신 내성 유전자를 확인하기 위해 포워드 플라이머(primer)로서 Hph-1S(5 -tgtcacgttgcaag acct- 3 (서열목록 20)), 리버스 플라이머(primer)로서 Hph-1A (5 -caaccaagctct gatagagttg-3 (서열목록 21))을 사용했다. PCR 반응은 95 로 2분간 한 후, 95 /30초, 54 /1분, 72 /1분, 을 35 사이클 행하고, 최종 신장 반응은 72 로 10분간 행했다. 반응 종료 후, PCR 반응액을 아가로스겔 전기영동에 제공하고, 하이그로마이신 내성 유전자의 도입이 확인된 개체를 기쿠카와( 菊 川 ) 미즈타( 水 田 ) 흙을 넣은 1/10,000a 포트에 심도 2cm로 이식했다 이식 7일 후에 나일론제의 그물로 포트를 덮고, 그물 속에 히메트비운카의 암컷 성충 5마리를 놓았 다. 이식 12일 후에 모든 암컷 성충을 제거하고, 이식 28일 후에 차세대 유충에게 대한 효과를 조사했다. 그 결과를 표 17에 나타냈다

20 [0153] 공시( 供 試 ) 개체 (사용 프로모터) RSs1 35S 대조 RSs1 - GUS * 표 17 유충수 + 성충수 [0154] [0155] [0156] * : 벼유래 스크로스 합성효소(RSs1) 유전자의 프로모터를 사용하여 GUS 유 전자를 도입 한 것 (DB1 축적 없음의 네가티브 컨트롤) (8)유전자 재조합 벼의 트비이론카(Nilaparvata lugens)에 대한 효과시험 벼 T 1 종자를 육묘 배토가 든 페이퍼 포트에 1알씩 파종하고, 격리 온실에서 재배했다. 파종후 19일 후, 잎의 일부로부터 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)을 이용하여 게놈 DNA를 추출해서 PCR 해석에 공시( 供 試 )했다. 하 이그로마이신 내성 유전자를 확인하기 위해서, 포워드 플라이머(primer)로서 Hph-1S(5 -tgtcacgttgcaa gacct-3 (배열번호 20)), 리버스 플라이머(primer)로서 Hph-1A (5 -caaccaagctc tgatagagttg-3 (배열번호 21))을 사용했다. PCR 반응은 95 로 2분간 간 행한 후, 95 /30초, 54 /1분, 72 /1분을 35사이클로 행했다. 최종 신장 반응은 72 로 10분간 행했다. 반응종료 후, PCR반응 액을 아가로스겔 전기영동에 제공하 고, 하이그로마이신 내성 유전자의 도입이 확인된 개체를 기쿠카와( 菊 川 ) 미즈타( 水 田 ) 흙을 넣은 1/10,000a 포트에 심도 2cm로 이식했다. 이식 9일 후에 나일론제의 그물로 포트를 덮고, 그물 속에 트비이론카의 암컷 성충 5마리를 놓았다. 이식 14일 후에 모든 암컷 성충을 제거하고, 게다가 이식 29일 후에 트비이론카의 암컷 성충 5마리를 추가 방충하고, 이식 43일 후에 차세대 유충에 대한 효과를 조사했다. 그 결과를 표 18에 나타 냈다. [0157] 공시( 供 試 ) 개체 (사용 프로모터) RSs1 35S 대조 RSs1 - GUS * 표 18 유충수 성충수 ** 유충수 + 성충수 [0158] [0159] [0160] [0161] * : 벼유래 스크로스 합성효소(RSs1) 유전자의 프로모터를 사용하여 GUS 유 전자를 도입 한 것 (DB1 축적 없음의 네가티브 컨트롤) ** : 추가한 성충을 포함 (9) 유전자 재조합 벼의 세지로운카(Sogatella furcifera)에 대한 효과시험 벼 T 1 종자를 육묘 배토가 든 페이퍼 포트에 1알씩 파종하고, 격리 온실에서 재배했다. 파종 후 19일 후, 잎의 일부로부터 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)을 이용하여 게놈 DNA를 추출해서 PCR 해석에 공시( 供 試 )했다. 하 이그로마이신 내성 유전자를 확인하기 위해 포워드 플라이머(primer)로서 Hph-1S(5 -tgtcacgttgcaagac ct- 3 (서열목록 20)), 리버스 플라이머(primer)로서 Hph-1A (5 -caaccaagctctga tagagttg-3 (서열목록 21))을 사용했다. PCR 반응은 95 로 2분간 간 후, 95 /30초, 54 /1분, 72 /1분,을 35사이클 행했다. 최종 신장 반응은 72 로 10분간 행했다. 반응 종료 후, PCR 반응액을 아가로스겔 전기영동에 제공하고, 하이그로마이신 내성 유전자의 도입이 확인된 개체를 기쿠카와( 菊 川 ) 미즈타( 水 田 ) 흙을 넣은 1/10,000a 포트에 심도 2cm으로 이식했다. 이식 9일 후에 나일론제의 그물로 포트를 덮고, 그물 속에 트비이론카의 암컷 성충 5마리를 놓았다. 이식 14일 후에 모든 암컷 성충을 제거하고, 이식 43일 후에 차세대유충에게 대한 효과를 조사했다. 그 결과를 표 19에 나타냈다

21 [0162] 표 19 공시( 供 試 ) 개체 (사용 프로모터) 유충수 성충수 유충수 + 성충수 RSs S 대조 RSs1 - GUS * [0163] [0164] [0165] * : 벼유래 스크로스 합성효소(RSs1) 유전자의 프로모터를 사용하여 GUS 유 전자를 도입 한 것 (DB1 축적 없음의 네가티브 컨트롤) 이상과 같이, 본 발명에 관한 시그널 펩티드를 이용하여 나가이모 렉틴 DB1 유전자를 발현, 축적한 재조합 벼 는 다양한 흡즙성( 吸 汁 性 ) 해충에게 대한 내충( 耐 蟲 ) 활성을 갖고 있는 것이 분명해졌다. 또한, 본 실시예로 사용한 배지 조성을 다음의 표 20에 정리해서 나타냈다. 표 20 [0166]

22 [0167]

23 [0168] [0169] 본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본명세서에 들어 있는 것으로 한다

24 도면 도면1-24 -

25 도면2-25 -

26 도면3 서 열 목 록 SEQUENCE LISTING <110> KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. TOHOKU UNIVERSITY <120> A signal peptide included in mannose-specific lectin precursor, a nucleic acid coding the signal peptide, and a use thereof <130> PH-4521-PCT <150> JP <151> <160> 21 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 69 <212> DNA <213> Dioscorea batatas

27 <220><221> CDS <222> (1)..(69) <400> 1 atg gct aac cca gga gca ttt gtt tcc ctt tct ctg gcc ctg cta ctt 48 Met Ala Asn Pro Gly Ala Phe Val Ser Leu Ser Leu Ala Leu Leu Leu gtt gct tct cct ctt tgc tgc 69 Val Ala Ser Pro Leu Cys Cys 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Dioscorea batatas <400> 2 Met Ala Asn Pro Gly Ala Phe Val Ser Leu Ser Leu Ala Leu Leu Leu Val Ala Ser Pro Leu Cys Cys 20 <210> 3 <211> 450 <212> DNA <213> Dioscorea batatas <220><221> CDS <222> (1)..(450) <400> 3 atg gcc gat ttc ata ctt tac tct ggg gaa tcc ctc agg tcc ggc caa 48 Met Ala Asp Phe Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Ser Leu Arg Ser Gly Gln tcc ttg acc tat gcg agc tac aat ttc att atg cag aat gac tgc aac 96 Ser Leu Thr Tyr Ala Ser Tyr Asn Phe Ile Met Gln Asn Asp Cys Asn ctg gtt cag tat gat aat ggc aag gca ata tgg gct tcc ggc act aac 144 Leu Val Gln Tyr Asp Asn Gly Lys Ala Ile Trp Ala Ser Gly Thr Asn

28 ggc cga ggc agc ggc tgc tat tgc gct atg cag agt gat ggt aac ctg 192 Gly Arg Gly Ser Gly Cys Tyr Cys Ala Met Gln Ser Asp Gly Asn Leu gtc gtt tat acc agt aac aac aat gct gtg tgg gca agc aac acc aac 240 Val Val Tyr Thr Ser Asn Asn Asn Ala Val Trp Ala Ser Asn Thr Asn gtg gga aat ggc cac tac gtc ctc atc ctt cag aaa gat cgc aac gtc 288 Val Gly Asn Gly His Tyr Val Leu Ile Leu Gln Lys Asp Arg Asn Val gtc atc tat gga ggt gca cgc tgg gca acc aac acc aac act gtc ggc 336 Val Ile Tyr Gly Gly Ala Arg Trp Ala Thr Asn Thr Asn Thr Val Gly gtt tct ggt ggt atg ttc atc gaa agt aag gcc acc atc ttt ggt tct 384 Val Ser Gly Gly Met Phe Ile Glu Ser Lys Ala Thr Ile Phe Gly Ser ttg cct gct aac gaa act act gca gaa gcc aag gct gca cgc att tcc 432 Leu Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ala Glu Ala Lys Ala Ala Arg Ile Ser atg gtc gtc aac aag tga 450 Met Val Val Asn Lys 145 <210> 4 <211> 149 <212> PRT <213> Dioscorea batatas <400> 4 Met Ala Asp Phe Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Ser Leu Arg Ser Gly Gln Ser Leu Thr Tyr Ala Ser Tyr Asn Phe Ile Met Gln Asn Asp Cys Asn

29 Leu Val Gln Tyr Asp Asn Gly Lys Ala Ile Trp Ala Ser Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ser Gly Cys Tyr Cys Ala Met Gln Ser Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Ser Asn Asn Asn Ala Val Trp Ala Ser Asn Thr Asn Val Gly Asn Gly His Tyr Val Leu Ile Leu Gln Lys Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Gly Ala Arg Trp Ala Thr Asn Thr Asn Thr Val Gly Val Ser Gly Gly Met Phe Ile Glu Ser Lys Ala Thr Ile Phe Gly Ser Leu Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ala Glu Ala Lys Ala Ala Arg Ile Ser Met Val Val Asn Lys 145 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 5 tctagaggat ccatggccga tttcatactt 30 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 6 gagctctcac ttgttgacga cc 22 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial

30 <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 8 catttcccac gttggtgt 18 <210> 9 <211> 349 <212> DNA <213> Dioscorea batatas <220><221> CDS <222> (49)..(348) <400> 9 tcgagcggcc gcccgggcag gtgtgtcttc agtttactac actaaaat atg gct aac 57 Met Ala Asn 1 cca gga gca ttt gtt tcc ctt tct ctg gcc ctg cta ctt gtt gct tct 105 Pro Gly Ala Phe Val Ser Leu Ser Leu Ala Leu Leu Leu Val Ala Ser cct ctt tgc tgc atg gcc gat ttc ata ctt tac tct ggg gaa tcc ctc 153 Pro Leu Cys Cys Met Ala Asp Phe Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Ser Leu agg tcc ggc caa tcc ttg acc tat gcg agc tac aat ttc att atg cag 201 Arg Ser Gly Gln Ser Leu Thr Tyr Ala Ser Tyr Asn Phe Ile Met Gln aat gac tgc aac ctg gtt cag tat gat aat ggc aag gca ata tgg gct 249 Asn Asp Cys Asn Leu Val Gln Tyr Asp Asn Gly Lys Ala Ile Trp Ala

31 tcc ggc act aac ggc cga ggc agc ggc tgc tat tgc gct atg cag agt 297 Ser Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ser Gly Cys Tyr Cys Ala Met Gln Ser gat ggt aac ctg gtc gtt tat acc agt aac aac aat gct gtg tgg gca 345 Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Ser Asn Asn Asn Ala Val Trp Ala agc a 349 Ser 100 <210> 10 <211> 100 <212> PRT <213> Dioscorea batatas <400> 10 Met Ala Asn Pro Gly Ala Phe Val Ser Leu Ser Leu Ala Leu Leu Leu Val Ala Ser Pro Leu Cys Cys Met Ala Asp Phe Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Ser Leu Arg Ser Gly Gln Ser Leu Thr Tyr Ala Ser Tyr Asn Phe Ile Met Gln Asn Asp Cys Asn Leu Val Gln Tyr Asp Asn Gly Lys Ala Ile Trp Ala Ser Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ser Gly Cys Tyr Cys Ala Met Gln Ser Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Ser Asn Asn Asn Ala Val Trp Ala Ser 100 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial

32 <220><223> Synthetic DNA <400> 11 tctagaggat ccatggctaa cccaggagca 30 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 12 gagctctcac ttgttgacga cc 22 <210> 13 <211> 519 <212> DNA <213> Dioscorea batatas <220><221> CDS <222> (1)..(519) <400> 13 atg gct aac cca gga gca ttt gtt tcc ctt tct ctg gcc ctg cta ctt 48 Met Ala Asn Pro Gly Ala Phe Val Ser Leu Ser Leu Ala Leu Leu Leu gtt gct tct cct ctt tgc tgc atg gcc gat ttc ata ctt tac tct ggg 96 Val Ala Ser Pro Leu Cys Cys Met Ala Asp Phe Ile Leu Tyr Ser Gly gaa tcc ctc agg tcc ggc caa tcc ttg acc tat gcg agc tac aat ttc 144 Glu Ser Leu Arg Ser Gly Gln Ser Leu Thr Tyr Ala Ser Tyr Asn Phe att atg cag aat gac tgc aac ctg gtt cag tat gat aat ggc aag gca 192 Ile Met Gln Asn Asp Cys Asn Leu Val Gln Tyr Asp Asn Gly Lys Ala ata tgg gct tcc ggc act aac ggc cga ggc agc ggc tgc tat tgc gct 240 Ile Trp Ala Ser Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ser Gly Cys Tyr Cys Ala

33 atg cag agt gat ggt aac ctg gtc gtt tat acc agt aac aac aat gct 288 Met Gln Ser Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Ser Asn Asn Asn Ala gtg tgg gca agc aac acc aac gtg gga aat ggc cac tac gtc ctc atc 336 Val Trp Ala Ser Asn Thr Asn Val Gly Asn Gly His Tyr Val Leu Ile ctt cag aaa gat cgc aac gtc gtc atc tat gga ggt gca cgc tgg gca 384 Leu Gln Lys Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Gly Ala Arg Trp Ala acc aac acc aac act gtc ggc gtt tct ggt ggt atg ttc atc gaa agt 432 Thr Asn Thr Asn Thr Val Gly Val Ser Gly Gly Met Phe Ile Glu Ser aag gcc acc atc ttt ggt tct ttg cct gct aac gaa act act gca gaa 480 Lys Ala Thr Ile Phe Gly Ser Leu Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ala Glu gcc aag gct gca cgc att tcc atg gtc gtc aac aag tga 519 Ala Lys Ala Ala Arg Ile Ser Met Val Val Asn Lys <210> 14 <211> 172 <212> PRT <213> Dioscorea batatas <400> 14 Met Ala Asn Pro Gly Ala Phe Val Ser Leu Ser Leu Ala Leu Leu Leu Val Ala Ser Pro Leu Cys Cys Met Ala Asp Phe Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Ser Leu Arg Ser Gly Gln Ser Leu Thr Tyr Ala Ser Tyr Asn Phe Ile Met Gln Asn Asp Cys Asn Leu Val Gln Tyr Asp Asn Gly Lys Ala

34 Ile Trp Ala Ser Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ser Gly Cys Tyr Cys Ala Met Gln Ser Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Ser Asn Asn Asn Ala Val Trp Ala Ser Asn Thr Asn Val Gly Asn Gly His Tyr Val Leu Ile Leu Gln Lys Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Gly Ala Arg Trp Ala Thr Asn Thr Asn Thr Val Gly Val Ser Gly Gly Met Phe Ile Glu Ser Lys Ala Thr Ile Phe Gly Ser Leu Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ala Glu Ala Lys Ala Ala Arg Ile Ser Met Val Val Asn Lys <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 15 tctagaggat ccatggctaa cccaggagca 30 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 16 gagctctcac ttgttgacga cc 22 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial

35 <220><223> Synthetic DNA <400> 17 gtcgaccttt cgtgacttgt tttcgc 26 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 18 ggatcctagc ttggcagcca t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 19 ccaaacaaga acaaaccggc 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 20 tgtcacgttg caagacct 18 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220><223> Synthetic DNA <400> 21 caaccaagct ctgatagagt tg