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혜린 표
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1 부산광역시보건환경연구원보제 14 권 (I), 15~27, 2004 Rep. Busan Inst. Health & Environ, Vol.14, 15~27, 2004 미생물과 이주현 Study on the Antimicrobial Susceptbility of Vibrio spp. Isolated from Environmental source and Patients in Busan Microbiology Division Ju-Hyeon Lee Abstracts We investigated K serotype and antibiotic resistance pattern of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus which were recovered from coastal area and patients in Busan. The results were as followed. Out of 75 Vibrio parahaemolyticus isolated from sea water and shellfish, 31 strains(41%) were agglutinated with K antisera and the serotype showed K28, K29, K38, K42(respectively 3 strains), K9, K11, K19, 24 (respectively 2 strains), K19, K26, K36, K39, K58, K64(respectively 1 strains). Antibiotic resistance were tested by disk diffusion method with 16 different disks. Out of total 133 Vibrio parahaemolyticus, 123 strain(92%) showed resistance to ampicillin and ticarcillin, and the others were susceptible to 16 anibiotics. In the case of 14 Vibrio vulnificus which were isolated from patients, all strains were susceptible to 16 antibiotics. Keywords : Vibrio spp., K serotype, Antibiotic resistance

2 부산광역시보건환경연구원보제 14 권 (I)(2004) 서론 현재해양에서서식하고있는 Vibrio spp. 는 40여종이보고되고있으며 1) 이중사람에게직접적으로질병을야기하는병원성비브리오균은 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio fluvialis, Vibrio metschnikovii, Vibrio damsela, Vibrio hollisae, Vibrio mimicus, Vibrio furnissii, Vibrio cincinnatiensis, Vibrio carchariae 등 12종이알려져있다 2). 특히 Vibrio parahaemolyticus와 Vibrio vulnificus는우리나라에서하절기대표적인세균성감염질환의원인균으로중요시되고있으며매년식중독과같은급성장관감염과패혈증환자가발생되고있고, 비브리오패혈증으로인한사망자도꾸준히보고되고있다. Vibrio parahaemolyticus는그람음성간균으로서해수, 갯벌, 어패류, 해조류에부착하여서식하는호염성세균으로 1950년일본오사카에서절인정어리섭취로인한식중독환자발생시원인균으로서 Fujino 등 3) 에의하여처음으로분리되어보고되었으며, 우리나라에서는장등 4) 에의해 1967년경북안동지방에서처음발생한것으로보고된이래국내식중독발생의중요원인균으로 2001년 254명, 2002년 188 명의환자발생에이어 2003년도에는 V. parahaemolyticus에의한식중독환자발생이 732명 (9.3%) 으로황색포도상구균에의한환자발생수 808명 (10.2%) 에이어두번 째로높은발생율을나타내고있다 5). 한편, Vibrio vulnificus는병원성비브리오중에서도단순히장염등을유발하는 Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae와는달리치명적인패혈증을일으킨다는측면에서특히주의가요구되는병원균이다 6). 피부창상, 경구감염등을사망률이 50~ 60% 에이르는급성감염성질환을유발하는이균은 1970년 Roland 7) 에의해피부괴저병환자로부터처음보고되었으며 Hollis 등 8) 에의해 1976년 Lactose를분해한다는사실이밝혀졌고, 이후 1979년 Farmer 9) 에의해 Vibrio vulnificus로명명되어졌다. 우리나라에서는 1979년부터호남지역에서패혈증환자가산발적으로발생하였으나 1981 년에구등 10) 에의해 Vibrio vulnificus가최초로분리보고되었으며, 2000년부터전염병예방법에의해제3종법정전염병으로지정되어관리되고있는데최근발생양상을보면 2000년 21명, 2001년 41명, 2002년 60명, 2003년 80명으로계속적인증가추세를보여주고있다 11). Vibrio parahaemolyticus와 Vibrio vulnificus에의한감염은잠복기가 1~2일로짧은데, 감염후통상적인치료는 Gentamicin이나 Tetracyclin 등항생제치료가행해지고있다. 자연계에서분리되는비브리오는거의모든항생제에감수성을지닌다고알려져있으나축산및양식사료에사용되는항생제로인한해양환경의오염과생물축적등의영향은 Penicillin 내성균주의출현에이은메티실린내성황색포

3 도상구균 (MRSA, Methicillin resistant Staphylococcus aureus), 반코마이신내성황색포도상구균 (VRSA, Vancomycin resistant Staphylococcus aureus) 의출현과같이특정항생제계열에대한내성변이주나다제내성균주의출현도가능하게할것이다. 그러나해양환경에서분리한 Vibrio spp. 에대한항생제감수성패턴에대한다양한조사연구가국내에서아직까지보고된바가충분치못한게사실이다. 본연구에서는부산지역해양환경및환자에서분리된 Vibrio parahaemolyticus 와 Vibrio vulnificus를대상으로 K 혈청형및각종항생제에대한감수성을조사하여비브리오감염치료를위한자료를제공하고질병예방을위한 Database를구축하고자하였다. 재료및방법 1. 시험균주 2004년도부산지역의해수, 어패류등을 대상으로사람에게급성장관감염을유발하는대표적병원성비브리오인 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus 3종에대한분리를시도하였으며, 분리결과 Vibrio parahaemolyticus로동정된 133주를시험에사용하였다. 환경검체에서 Vibrio cholerae와 Vibrio vulnificus 는분리되지않았다. 임상분리균주는관내보건소에신고된패혈증환자의혈액에서 Vibrio vulnificus 14주를분리하여시험에사용하였다. 시험균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에따라그람음성간균, Oxidase 음성인집락을취하여 API 20E kit(biomerieux, France) 를사용하여균을동정하였다 ( 표 1). 2. 시험방법 1) K 혈청형분류 Vibrio parahaemolticus의혈청형별분류는협막항원인 K antigen에대한 Slide Table 1. Isolation of Vibrio spp. from marine specimens and patients collected from Busan district in 2004 Strains Specimens Sea water Patients Fish & sell-fish V. cholerae V. vulnificus V. parahaemolyticus Total Total

4 부산광역시보건환경연구원보제 14 권 (I)(2004) agglutination test로실시하였는데, K type은 1% NaCL을첨가한 Tryptic soy agar에서자란세균집락을멸균생리식염수 (0.85% NaCL) 에부유시켜 K serova antisera와동량혼합하여 1분이내에강한응집현상이관찰되는것을양성으로판정하였으며, 이때사용한 K serotype 진단용혈청은 Vibrio parahaemolyticus K-antisera test Kit(Denka Seiken Co., Japan) 를사용하였다. 2) 항생제감수성시험분리된 Vibrio spp. 에대한항생제감수성시험은 NCCLS(National committee for clinical laboratory standard) 지침에따라 Disc diffusion method를사용하여실시하였다. 접종액은 1% NaCL을첨가한 Tryptic soy agar에순수분리된균을 37 에서 20-24시간배양후멸균된면봉으로 4-5개의집락을채취, 멸균생리식염수에현탁하여 McFarland turbidity No. 0.5에맞춘후사용하였다. 균액을멸균된면봉에적시고시험관내벽에면봉을눌러과잉의접종액을제거한후 Mueller- Hinton agar에 60 로돌려가면서, 3회에걸쳐골고루바른후수분이흡수된후항생제 disc를간격이 24mm이상유지되도록배지표면에놓았다. M-H agar plate는 disk 부착후 15분내에 37 Incubator에옮겨 24시간배양하였다. 생성된억제환의크기는 inhibition zone의직경을 Caliper를이용하여 mm단위로측정하였으며, 결과판독은 BBL Sensi-Disc zone interpretation set를참고하여내성 (Resistant, R), 중등도감수성 (Intermediate, I), 감수성 (Susceptible, S) 으로판정하였다. 이시험에사용된항생제 disk는 BBL sensi disk (Becton-Dickinson) 로약제종류및역가는 Table 2. 와같다. 결과및고찰 1. Vibrio parahaemolyticus K 혈청형분류해수에서분리된 Vibrio parahaemolyticus 51주, 어패류에서분리된 24주등총 75주의환경유래분리주를대상으로 K 혈청형검사를실시한결과 31주에서 K antisera monovalent와의응집이확인되었는데 K34 형이 5주로 16% 의가장높은검출율을보였으며, K28, K29, K38, K42형각 3주, K9, K11, K22, K24형각 2주, K19, K26, K36, K39, K58, K64형이각 1주씩분류되어전체 15종의 K 혈청형이확인되었으며검출율은 41% 를나타냈다. 분리원별동정결과를살펴보면해수에서분리된 Vibrio parahaemolyticus 51주중 21 주 (41%) 에서 K9, K11, K19, K22, K24, K28, K29, K34, K36, K38, K39, K42, K64 등 13종의 K 혈청형이확인되었고, 그중 K29, K34형이각각 3주 (14%), K22, K28, K38, K42형각각 2주, K9, K11, K19, K24, K36, K39, K64형이각 1주검출되었으며, 어패류분리주의경우 10주가 K 항

5 혈청에응집반응을보였으며 K9, K11, K24, K26, K28, K34, K38, K42, K58형 9 종의혈청형분포를보였으며 K34형이 2 주나타났고 K9, K11, K24, K26, K28, K38, K42, K58형이각 1주확인되어해수에서분리된 Vibrio parahaemolyticus의경우와같이 K34형의검출율이높았다. 함등 12) 은 2001년도서울의시판수산물중분리된 Vibrio parahaemolyticus의 K 혈청형 분포및동정에관한보고에서 K24, K28, K34, K42, K47, K53 혈청형이 66건중 10 건확인되어 15.2% 의동정율을보였다고하였으며, 고등 13) 은서해안에서분리된 Vibrio parahaemolyticus에대한혈청형조사결과 K28형이 7주로서가장많았으며, K3형이 5주, K30형 4주, K19형및 K22형이각각 2주, 그리고 K13, K34, K42, K45, K46, K52 및 K68형이각각 1주분리되었 Table 2. Zone Diameter Interpretive Chart Code Antimicroial agent Disc potency Zone diameter Interpretive standards (mm) Resistant Intermediate Susceptible C Chroramphenicol 30 μg IPM Imipenem 10 μg AM Ampicillin 10 μg TE Tetracycline 30 μg TIC Ticarcillin 75 μg SXT Trimethoprim/ Sulamethoxazole 1.25/ μg CRO Ceftriaxone 30 μg CZ Cefazolin 30 μg SAM Ampicillin/ 10/10μg Sulbactam CIP Ciprofloxacin 5μg GM Gentamicin 10 μg AN Amikacin 30 μg NA Nalidixic Acid 30 μg CTT Cefotetan 30 μg CF Cephalothin 30 μg FEP Cefepime 30 μg

6 부산광역시보건환경연구원보제 14 권 (I)(2004) Table 3. distribution of K-serotype of V.parahaemolyticus isolated from sea water & fish Source of Isolation K serotype Total K9 K11 K19 K22 K24 K26 K28 K29 K34 K36 K38 K39 K42 K58 K64 sea water fish Total 다고보고하였는데, 본조사에서는 K 혈청형이 15종으로더욱다양하게분리되었으며검출율도 41% 로다소차이를보였는데이러한결과는부산지역의연안해수및어패류에서분리된 Vibrio parahaemolyticus의균특성등지역적인차이에서기인한점이클것으로사료된다. 한편, 이등 14) 은경북지역설사환자와환경에서분리한 Vibrio parahaemolyticus의독성인자에관한연구에서설사환자에서분리된 25균주중에서 1996년부터동남아를비롯하여전세계적으로유행하고있는 O3:K6형이 16.0% (4균주) 가포함되어있었으나, 환경에서는 O3:K6형은분리되지않았 % 24 41% 42% sea water fish Total strains K-s eroty pe Fig. 1. Comparison of K serotype detected from V. parahaemolyticus divided into sea water and fish

7 다고하였는데, 본조사에서도환경에서분리된 Vibrio parahaemolyticus에서 K6형은분리되지않아세계적유행과는다른패턴을보였으나앞으로지속적인모니터가필요하리라본다. 2. 분리주에대한항생제내성패턴부산연안의해수및어패류에서분리 동정된 Vibrio parahaemolyticus 133주와임상검체에서분리 동정된 Vibrio vulnificus 14주를대상으로 Chroramphenicol(C), Imipenem (IPM), Ampicillin(AM), Tetracycline (TE), Ticarcillin(TIC), Trimethoprim/Sulamethoxazole (SXT), Ceftriaxone(CRO), Cefazolin(CZ), Ampicillin/Sulbactam(SAM), Ciprofloxacin(CIP), Gentamicin(GM), Amikacin(AN), Nalidixic Acid(NA), Cefotetan(CTT), Cephalothin (CF), Cefepime(FEP) 등항생제 16종에대한감수성시험결과 Table 및 Table 6. 과같은결과를얻었다. 환경에서분리된 Vibrio parahaemolyticus 133주에대한항생제내성패턴을분석한결과 123주가 Ampicillin 혹은 Ticarcillin에내성을갖는약제내성균주로 92% 의내성율을보였는데이중 Ampicillin 과 Ticarcillin 2가지약제에동시내성을나타내는균주는 97주로 73% 를나타냈고단일내성을보인균주는 26주로 20% 를나타냈다 (Fig. 2). 분리원별약제내성율을비교해보면해수에서분리된 109주중약제내성균주는 102주로 94% 의내성율을나타냈다. 이중 Ampicillin 과 Ticarcillin 2가지약제에동시내성을보이는균주는 81주로 74% 를나타냈으며, 단일내성을보이는균주는 21주로 19% 를나타났다 (Fig. 3). 어패류에서분리된 24주의경우약제내성패턴은 Ampicillin 혹은 Ticarcillin에내성을보인균주는 21주로 88% 의내성율을보였으며, 이중 2가지약제에동시내성을나타낸균주는 16주로 67% 의내성율을보였다 (Fig. 4). 항생제별 Vibrio parahaemolyticus 분리균주 133주에대한감수성스펙트럼을살펴보면 Penicillin계열과 Cephem계열을제외한나머지 12종의항생제에서는 100% 감수성을보였다. Ampicillin의경우 133주중 118주 (89%) 가내성을나타냈으며중등도감수성을보인균주가 5주 (4%), 감수성을보인균주는 10주 (8%) 였으며, Ticarcillin 에서는 102주 (77%) 가내성을보였고, 중등도감수성을나타낸균주가 20주 (15%), 감수성을보인균주는 11주 (8%) 분리되었다. Cephem제제에속하는 Cefazolin의경우중등도감수성이 10주 (8%), 감수성을보인균주는 123주 (92%) 였으며, Cefotetan은중등도감수성을보인균주가 7주 (5%), 감수성을보인균주가 126주 (95%) 로나타났다. 특히, Ampicillin의경우손등 15) 에의해 2003년경북동해안에서해양환경에서분리된 Vibrio parahaemolyticus의 75% 가내성을갖고있음이보고된바있으며, 이등 16) 은 Vibrio parahaemolyticus의 98% 이상의높은내성을나타냈음을보고하며항

8 부산광역시보건환경연구원보제 14 권 (I)(2004) Table 4. Results of Antimicrobial susceptibility test of V. parahaemolyticus isolated from sea water and fish Antimicro bials C IPM AM TE TIC SXT CRO CZ SAM CIP GM AN Source of Resistant pattern isolation R I S Total 118 (89%) 5 (4%) 10 (8%) sea water 98 (90%) 3 (3%) 8 (7%) fish 20 (83%) 2 (8%) 2 (8%) Total 102 (77%) 20 (15%) 11 (8%) sea water 85 (78%) 14 (13%) 10 (9%) fish 17 (71%) 6 (25%) 1 (4%) Total - 10 (8%) 123 (92%) sea water 7 (6%) 102 (94%) fish 3 (13%) 21 (88%)

9 NA Total - 7 (5%) 126 (95%) CTT sea water 7(6%) 102 (94%) CF FEP C, Chroramphenicol ; IPM, Imipenem ; AM, Ampicillin ; TE, Tetracycline ; TIC, Ticarcillin ; SXT, Trimethoprim/Sulamethoxazole ; CRO, Ceftriaxone ; CZ, Cefazolin ; SAM, Ampicillin/Sulbactam ; CIP, Ciprofloxacin ; GM, Gentamicin ; AN, Amikacin ; NA, Nalidixic Acid ; CTT, Cefotetan ; CF, Cephalothin ; FEP, Cefepime. Table 5. Antimicrobial resistant pattern of V. parahaemolyticus isolated from sea water and fish 구분 균주수 약제내성균주 2약제내성균주 1약제내성균주 Sea water (94%) 81 (74%) 21 (19%) Fish (88%) 16 (67%) 5 (21%) Total (92%) 97 (73%) 26 (20%) Table 6. Results of Antimicrobial susceptibility test of V. vulnificus isolated from patients C IPM AM TE TIC SXT CRO CZ SAM CIP GM AN NA CTT CF FEP R I S C, Chroramphenicol ; IPM, Imipenem ; AM, Ampicillin ; TE, Tetracycline ; TIC, Ticarcillin ; SXT, Trimethoprim/Sulamethoxazole ; CRO, Ceftriaxone ; CZ, Cefazolin ; SAM, Ampicillin/Sulbactam ; CIP, Ciprofloxacin ; GM, Gentamicin ; AN, Amikacin ; NA, Nalidixic Acid ; CTT, Cefotetan ; CF, Cephalothin ; FEP, Cefepime

10 부산광역시보건환경연구원보제 14 권 (I)(2004) Fig. 2. Resistant rate of V. parahaemolyticus divided into antimicrobial from sea water and fish 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% C IPM AM TE TIC SXT CRO CZ SAM CIP GM AN NA CTT CF FEP 95 5 S I R Fig. 3. Resistant rate of V. parahaemolyticus divided into antimicrobial from sea water 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% C IPM AM TE TIC SXT CRO CZ SAM CIP GM AN NA CTT CF FEP 94 6 S I R Fig. 4. Resistant rate of V. parahaemolyticus divided into antimicrobial from fish 100% 90% 80% % 60% 50% 40% 30% S I R 20% 10% 0% 13 C IPM AM TE TIC SXT CRO CZ SAM CIP GM AN NA CTT CF FEP

11 생제노출이나 plasmid 전이에의한획득내성이아닌자연내성일것으로추정하였는데, 본조사결과에서도환경분리주인 Vibrio parahaemolyticus에대한항생제감수성시험결과 Penicillin계열의 Ampicillin 과 Ticarcillin에대한내성율이높음을확인하였다. 한편, 패혈증환자혈액에서분리된 Vibrio vulnificus 14주에대한항생제감수성시험결과는 Ampicillin과 Ticarcillin을포함한 16종의약제에대해모두가 100% 감수성을갖고있는것으로나타났다. 결론 부산지역해양환경및환자에서분리된 Vibrio parahaemolyticus와 Vibrio vulnificus 를대상으로 K 혈청형및항생제내성패턴을조사한결과는다음과같다. 1. 해수및어패류에서분리된 Vibrio parahaemolyticus 75주의 K 혈청형검사결과 31주가 K 혈청형이분류되어 41% 의검출율을보였으며, K34형 5 주, K28, K29, K38, K42형각 3주, K9, K11, K22, K24형각 2주, K19, K26, K36, K39, K58, K64형각 1주검출되었다. 2. 해수분리주는 51주중 21주 (41%) 가 K 혈청형이분류되었으며, K29, K34 Fig. 5. Resisdent rate of V. parahaemolyticus divided into the number of antibiotic from sea water & fish Total Sea w ater Fish strains 약제내성균주 1약제내성균주 2약제내성균주

12 부산광역시보건환경연구원보제 14 권 (I)(2004) 형이각 3주, K22, K28, K38, K42형각 2주, K9, K11, K19, K24, K36, K39, K64형각 1주검출되었다. 3. 어패류분리주는 24주중 10주 (42%) 가 K 혈청형이분류되었으며 K34형 2주, K9, K11, K24, K26, K28, K38, K42, K58형각 1주검출되었다. 118주와 102주가내성을보여 89% 및 77% 의높은내성율을보였으나, 나머지 14종의항생제에서는 92~ 100% 의감수성을보였다. 7. Vibrio vulnificus 14주에대한항생제감수성시험결과 16종의약제에대해모두 100% 감수성을나타냈다. 3. 환경에서분리된 Vibrio parahaemolyticus 133주의항생제내성패턴은 123 주가 Ampicillin 혹은 Ticarcillin에내성을갖는균주로 92% 의내성율을보였으며 2가지약제동시내성균주는 97주로 73%, 단일내성을보인균주는 26주로 20% 를나타냈다. 4. 해수에서분리된 109주중 Ampicillin 혹은 Ticarcillin에내성을보인균주는 102주로 94% 의내성율을보였으며, Ampicillin과 Ticarcillin 동시내성균주는 81주 74%, 단일내성균주는 21주로 19% 를나타냈다. 5. 어패류분리된 24주중 Ampicillin 혹은 Ticarcillin에내성을보인균주는 21주로 88% 의내성율을보였으며, Ampicillin과 Ticarcillin 동시내성균주는 16주 67%, 단일내성균주는 5주로 21% 를나타냈다. 6. Ampicillin 과 Ticarcillin에서는각각 참고문헌 1. Skermaman, V.B.D., V. MacGowan, P.H.A. Sneath, Approved lists of bacterial names. American Society for Microbiology, Washington D.C., U.S.A. 2. Baumann, P., A.L. Furniss, and J.V. Lee Genus I. Vibrio, p In N.R Kreig(ed.) Bergey's manual of systematic bacteriology Vol. 1. The William & Wilkins Co., Baltimore, Maryland. 3. Fujino, T., Okuno, Y., Nakada, D., Oyanma, A., Fukai, T., Mukai, T. and Ueho, T On The Bacteriological Examination of Shrasu-Food Poisoning. Med. J. Osaka Univ., 4, Chang, D. S Distribution and physiological characteristics of Vibrio parahaemolyticus in coastal sea of Korea. Ph. D. thesis, National Fisheries University of Busan. pp 식품의약품안전청 식중독발생

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Microsoft PowerPoint - PDFCoTemp.PPT 주요유방염세균의검출및 항생제감수성검사 임숙경 1. 검사시료 1. 시료채취 유방염우유 2. 체세포수측정 3. 대상세균 - Staphylococcus aureus - Coagulase negative staphylococci -Escherichia coli 3. 균분리방법 E. coli CHEC Agar 직접도말 (37 18-24h) 보라색집락 EMB Agar