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1 Journal of Dental Hygiene Science Vol. 12, No. 2, pp. 109~113 (2012) 임상에서분리한 Streptococcus pneumoniae 에서 Levofloxacin 내성유전자의비교연구 최재민 1 박선희 1 윤지아 1 한양금 2 이인수 1 1 한남대학교생명공학과, 2 대전보건대학교치위생 ( 학 ) 과 Comparative Analysis of Levofloxacin Resistant Genes in Clinically Isolated Streptococcus pneumoniae Jae Min Choi 1, Seon Hui Park 1, Ji A Yoon 1, Yang Keum Han 2 and In Soo Lee 1 1 Department of Biotechnology, Hannam University Daejeon, , Korea 2 Department of Dental Hygiene, Daejeon Health Science College Daejeon, , Korea Abstract One hundred seventy four Streptococcus pneumoniae clinical isolates were categorized depending on the types of specimens, the age and the gender, respectively. All isolates were analyzed the characteristics of the multi-drug resistance including levofloxacin antibiotics. In the results of analysis depending on the type of samples, it had been confirmed that sputum was the main source of pneumonia infection because 156 of 174 strains (89.7%) were isolated in sputum samples. The opportunity for isolating the S. pneumoniae that had tolerance to levofloxacin was increased in over 51 age patients group compared with other age and male group. Eight strains of isolates were evaluated higher resistant to levofloxacin, and those also showed multi-drug resistant including penicillin, tetracycline, erythromycin, clindamycin and trimethoprim-sulfamethoxazole. In the results of sequence analysis of quinolone resistance determining region in SP32 (MIC 64 µg/ml) and SP96 (MIC 8 µg/ml) which were levofloxacin resistant strains, an amino acid substitutions were found Ser-81 Phe in both GyrA of SP32 and SP96, and Ser-11 Gly in only SP96. A Ser-79 Phe substitution of ParC was found in both. Key words gyra, Levofloxacin, parc, Streptococcus pneumoniae 서 론 Streptococcus pneumoniae 는폐렴을발병시키는가장흔한세균이며, 성인을비롯하여영유아와소아의세균성수막염, 중이염, 부비동염의주요원인균이며 1), 65 세이상의노인에게서발병되는폐렴의경우에는사망률이비교적높은데, 그이유는고령으로인한면역기능의저하, 인후부반사기능저하, 기관지점액섬모운동의기능저하, 심폐기능부전등이부가적으로관여하기때문이다 2,3). 또한 S. pneumoniae 감염증중에서균혈증이나늑막염을동반하는침습성폐렴과뇌수막염등은당뇨병과악성종양환자들에서많이보고되고있다 4). 지역사회획득폐렴 Corresponding author Tel: Fax: inslee@hnu.kr Citation: 최재민등 : 임상에서분리한 Streptococcus pneumoniae 에서 Levofloxacin 내성유전자의비교연구. 치위생과학회지 12(2): , ISSN: (Print), (Online) 은연간인구 10,000 명당 12~90 명의빈도로발생하고, 사망률은약 5% 정도이며 5), 치료법은폐렴의중증도, 동반질환, 원인균및원인균의항생제내성에따라다르다. S. pneumoniae 감염의치료에페니실린이대표적인항생제로사용되어왔으나, 1967 년부터페니실린내성 Streptococcus 가분리된후, 1990 년대까지급속도록그내성도가증가하였고, 최근에다제내성 S. pneumoniae 도증가하고있다 6). 잇몸과치아에서분리되는 S. gordonii 는 S. pneumoniae 와구강에서공생적관계로생존하는데, 특히 penicillin 내성에관여하는 High-molecular-weight (HMW) penicillin-binding proteins (PBPs) 유전자는두균주간상동성이존재하는것으로보고되었다 7). 이와같이내성세균의출현과확산으로미생물감염성질환의치료가점점어려워지고있으며, 또한최근개발된 fluoroquinolone 계약제의광범위한사용으로인하여 S. pneumoniae 를비롯한 Gram negative bacillus 에서항생제내성세균출현빈도가증가하고있다 8,9). DNA gyrase 와 topoisomerase IV 의작용을저해하는 fluoroquinolone 에대한세균의방어 109

2 110 Comparative Analysis of Levofloxacin Resistant Genes in Clinically Isolated Streptococcus pneumoniae 기전은 gyrab 와 parce 유전자돌연변이또는 efflux 펌프의작용이라고알려져있다 10). 실험실이나임상에서분리된항생제내성세균의경우 gyra 와 parc 유전자각각의특정영역에서점돌연변이가발생되어내성이발생된다고보고되었으며 11), 이영역을 quinolone 내성결정부위 (Quinolone Resistance Determining Region, QRDR) 로명명하였다 12). 특히구강내 Streptococci 세균의 gyrase 와 topoisomerase 유전자의속간형질전환이보고되어 13), S. pneumoniae 의항생제내성유전자는치아우식증및치주질환유발 viridans streptococci 로확산될수있는위험성이있으므로 14) 구강을비롯한상기도부상주세균에대한항생제내성도조사는중요한의미를갖는다. 국내에서발병되는폐렴의경우항생제내성여부와관계없이경험적으로치료하는경우가많아내성의범위와임상경과간의추이를살펴보는데어려움이있다. 즉, 지역사회획득폐렴의경험적치료와적절한항생제를선택하기위하여각지역별원인균분포및항생제내성현황등의역학자료가요구되며, 이의확보를위한연구의필요성이대두되고있다 15). 본연구에서는 2008 년 10 월에서 2010 년 5 월까지임상에서분리된 S. pneumoniae 균주 174 개를대상으로 levofloxacin 에대한검체별, 연령별, 성별항생제감수성및다제내성조사를통하여세균의약제내성도및다제내성도범위를평가하며, 또한분자유전학적검사를통하여항생제기전을확인하고자하였다. 연구재료및방법 1. 실험균주및사용배지본연구에서사용된균주는 2008 년 10 월부터 2010 년 5 월까지구강의점막및객담, 혈액, 농, 각종도말및체액검체그리고중추신경계로부터분리된 174 개의 S. pneumoniae 이며, 세균의동정은 Optochin Sensitivity Test 와 Bile Solubility Test 를통해진행되었다 16,17). 항생제감수성조사의정도관리는 S. pneumoniae ATCC49619 를사용하였다. 세균의증균에는 Mueller-Hinton 배지를사용하였고, 필요에따라 5% defibrinated sheep blood 가첨가하였다. 배양은 5% CO2 및 35 o C 환경조건에서진행되었다. 2. 항생제감수성검사실험균주의항생제감수성조사는디스크확산법 18) 을사용하였고, 항생제최소억제농도 (mininmal inhibitory concentration) 는 MicroScan (Siemens Healthcare Diagnostics, USA) MICroSTREP plus antimicrobial panel 방법 19) 과액체배지희석법을 20) 사용하였다. 결과는 CLSI 기준에따라감수, 중간, 내성으로판정하였다 21). 항생제내성도조사는 penicillin, cefotaxime, vancomycin, clindamycin, erythromycin, levofloxacin 및 trimethoprim/sulfamethoxazole (Sigma, St. Louis, USA) 등의항생제를대상으로시행하였다. 3. 항생제내성유전자분석 1) PCR 및 DNA 클로닝유전자증폭을위한주형 DNA 는해당균주를하룻밤생장시킨세균의배양액과 Genomic DNA 분리 Kit (Promega, USA) 을사용하여준비하였다. gyra 와 parc 유전자증폭을위한 primer 로서 5 -TTC TCT ACG GAA TGA ATG-3 와 3 -GAT ATC ACG AAG CAT TTC-5, 5 -TGG GTT GAA GCC GGT TCA-3 와 3 -CAA GAC CGT TGG TTC TTT C-5 를각각사용하였다. PCR 반응시약은 DNA Polymerase (Top-Tag TM, CoreBio system, Korea), dntp (CoreBio system, Korea) 및 Thermocycler (Dice TM, Takara Bio, Japan) 를사용하였다. 증폭된 DNA 확인은 0.8% 아가로스전기영동을통하여수행되었으며, DNA 추출과정제는젤추출 Kit (MGTM SVMacrogen, Korea) 를사용하였고, 추출된 DNA 는 pgem T-easy vector (Promega, USA) 에결합하여 E.coli DH5a 에형질전환시켰다 22). 재조합 plasmid DNA 는 plasmid Mini Prep Kit (Dyne Bioinc Ltd. Korea) 를사용하여분리하였다. 4. 염기서열분석 gyra 및 parc 유전자의염기서열결정은 ( 주 ) 마크로젠에의뢰하였고, 분석은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool: 프로그램상에서 S. pneumoniae R6 염기서열을대상으로비교분석하였다. 결 과 1. 검체별 S. pneumoniae 분리빈도가장높은 S. pneumoniae 분리빈도는총 174 균주의 89.7% 인 156 균주가분리된구강내객담검체로확인되 Table 1. The distribution of S. pneumoniae isolates and their susceptibility to levofloxacin antibiotics Sources Number (%) Susceptibilities to levofloxacin of isolates Senseitive intermediate resistance Sputum 156(89.7) 167(96.0) 7(4.0) Eye 4(2.3) 174(100) Respiratory* 2(1.1) 174(100) Blood 6(3.4) 174(100) Pleural fluid 2(1.1) 174(100) CSF 2(1.1) 174(100) Ear 2(1.1) 173(99.4) 1(0.6) *Upper respiratory; CSF, Cerebrospinal Fluid

3 Journal of Dental Hygiene Science Vol. 12, No. 2, pp. 109~113 (2012) 111 Table 2. Age distribution and levofloxacin susceptibilities of S. pneumoniae isolates according to the age of patients Age Number of Susceptibilities to levofloxacin isolates (%) Senseitive intermediate resistance (2.9) 174(100) (1.1) 174(100) (1.7) 174(100) (5.7) 174(100) (10.7) 174(100) (12.1) 173(99.4) 1(0.6) (22.4) 169(97.1) 4(2.3) (33.9) 173(99.4) 1(0.6) (8.6) 172(98.9) 2(1.2) > 90 1(0.6) 174(100) Table 3. Gender distribution and levofloxacin susceptibilities of S. pneumoniae isolates Sex Number (%) Susceptibilities to levofloxacin of isolates Senseitive intermediate resistance Male 110(63.2) 105(95.5) 5(4.5) Female 64(36.8) 61(95.3) 3(4.7) 었으며, 그중에서 levofloxaicn 내성세균은객담과귀에서각각분리되었다 (Table 1). 연령별분리빈도는나이에따라서증가하는경향을나타내어, 61 세이상의고령에서상대적으로검출률이높았으나, 81 세이상부터는오히려감소하는경향을보여주었다. Levofloxacin 내성도는 51~90 세고령환자에게서가장높게나타났다 (Table 2). 성별기준으로 S. pneumoniae 의검출빈도는남성이여성에비하여 1.7 배높게조사되었다 (Table 3). 2. 분리된 S. pneumoniae 항생제감수성조사분리된 174 균주의 S. pneumoniae 를대상으로항생제내성도를조사한결과, clindamycin, erythromycin 및 TMP/SMX 등의 macrolide 계항생제내성세균의분리도가 penicillin 과비교하여약 3 배이상높게조사되었다 (Table 4). Table 4. Susceptibility to various antibiotics in 174 isolates of S. pneumoniae Antibiotics Susceptibilities Susceptible Intermediate Resistant Clindamycin 69(39.7)* 2(1.5) 103(59.2) Erythromycin 40(23.0) 2(1.2) 132(75.9) Penicillin 38(21.9) 106(61.0) 30(17.3) Tetracycline 59(34.0) 24(13.8) 91(52.3) TMP/SMX 36(20.7) 20(11.5) 118(67.8) Levofloxacin 165(94.9) 8(4.6) Vancomycin 174(100) TMP/SMX, trimethoprim/sulfamethoxazoe; *, Number (%) of isolates 전체분리균주의약 4.6% 만이 levofloxacin 내성도를나타내었고, 특히 vancomycin 내성균주는분리되지않았다. 총 174 균주의 S. pneumoniae 중에서항생제내성을갖는 164 균주를대상으로약제중복내성도를조사한결과, 서로다른 3 종류항생제에대한내성률은 9.7%, 4 종류항생제에대한내성률은 23.2%, 5 종류항생제에대한내성률은 41.5% 그리고실험에사용된모든종류의항생제내성률은 4.9% 로각각분석되었다. 특히 levofloxacin 내성세균들은시험한모든항생제에내성을소유하는것으로확인되었다 (Table 5). Table 5. Distribution of S. pneumoniae isolates according to antibiograms Antibiotics No. of resistant drug No.(%) of isolates a PEN 1 8(4.9) C 1 1(0.6) TE 1 1(0.6) SXT 1 4(2.4) PEN+SXT 2 10(6.1) C+E 2 4(2.4) TE+SXT 2 6(3.7) TE+ERY+SXT 3 b 3(1.8) E+P+SXT 3 1(0.6) C+E+T 3 1(0.6) C+E+P 3 7(4.3) PEN+TE+ERY 3 4(2.4) C+E+T+SXT 4 b 5(3.1) C+E+P+SXT 4 10(6.1) PEN+TE+ERY+SXT 4 22(13.4) PEN+TE+ERY+C 4 1(0.6) PEN+TE+ERY+C+SXT 5 68(41.5) PEN+TE+ERY+C+SXT+LV 6 8(4.9) a No.(%) of 164 strains showing resistance of 174 strains b Multidrug-Resistance; PEN, penicillin; TE, tetracycle; ERY, erytromycin; C, clinda-mycin; SXT, trimethoprim-sulfamethoxazoe; LV, levofloxacin Table 6. Comparison of susceptibility based on the determinating methods for evaluation in eight 8 levofloxacin resistance S. pneumoniae Bacterial strains Disk diffusion method (mm) ( ) Microscan MIC (µg/ml) ( ) Broth dilution method MIC (µg/ml) ( 2 4 8) SP4 R >4 16 SP12 R >4 8 SP16 R >4 8 SP32 R >4 64 SP35 R >4 32 SP96 R >4 8 SP109 R >4 32 SP176 R >4 32 S; Susceptible, I; Intermediate, R; Resistant

4 112 Comparative Analysis of Levofloxacin Resistant Genes in Clinically Isolated Streptococcus pneumoniae Table 7. The characteristics of point mutations of GyrA and ParC in levofloxacine resistant S. pneumoniae Amino acid substitution Levofloxacin Strains GyrA ParC MIC(µg/mL) Ser-81 Ser-114 Ser-79 SP96 8 Phe Gly Phe SP32 64 Phe Phe 디스크법과 MicroScan 방법을사용하였을경우, levofloxacin 에가장높은내성도를나타낸 SP32 (MIC 64 µg/ ml) 균주는상대적으로내성도가 3 배낮은 SP12, SP16 및 SP32 와동일한 MIC 값으로평가되었다 (Table 6). 3. gyra 와 parc 유전자의염기서열분석 Levofloxacin 내성 S. pneumoniae 는 SP32 와 SP96 을대상으로 QRDR 의염기서열분석및돌연변이유무를조사한결과, SP96 균주의 ParC 에서 79 번아미노산인 serine 이 phenylalanine (Ser-79 Phe) 으로, GyrA 에서 81 번과 114 번아미노산 serine 이각각 phenylalanine (Ser-81 Phe) 과 glycine (Ser-114 Gly) 으로치환되었고, SP32 균주에서는 ParC 의 79 번아미노산과 GyrA 의 81 번아미노산인 serine 이각각 phenylalanine 으로 (Ser-79 Phe, Ser- 81 Phe) 변이된것이확인되었다 (Table 7). 고 찰 S. pneumoniae 감염성호흡기질환의치료에서문제점으로대두되는것은환자의연령에관계없이원인균의항생제내성도가계속증가된다는것이며, 20) 특히최근 levofloxacin에대한내성도가증가하는양상을보여새로운 fluoroquinolon계항생제개발의필요성이대두되고있다. 21) 대전지역사회에서항생제내성 S. pneumoniae의출현빈도및내성도를조사하기위하여, 2008년 10월부터 2010년 5월까지병원에서분리된 174개의 S. pneumoniae를검체별, 연령별, 성별에따른항생제내성빈도와내성기전을분석하였다. S. pneumoniae가가장많이분리된시료는구강의객담으로조사되었고, 폐렴이호흡기질환임을감안할때이와같은결과는이해될수있으며, 또한고령환자의경우에분리빈도및항생제내성도가증가하였는데, 이것은노령으로인한면역력감퇴및이로인한항생제의존도가높았기때문에상대적으로항생제내성균주의출현이많았을것으로추정된다. 임상에서분리된미생물의항생제내성도조사는자동화된 MicroScan MIC, 비교적조사가용이한디스크확산법그리고전통적최소억제농도법을각각사용한결과, 분리된균주의항생제내성도는최소억제농도법을사용한결과에서정확하게조사되었으며, 임상결과를토대로환자에적합한약제처방에서이부분은충분히고려되어야할사 안으로진단해본다. 표 5 에서보는바와같이, 본연구에서분리된 8 개의 levofloxacin 내성세균모두는 6 종류의서로다른항생제에대한다제내성을나타내어 S. pneumoniae 에서항생제교차내성도현상이확인되었다. 현재 levofloxacin 에대한고도내성은 parc 와 gyra 유전자돌연변이현상으로이해되어, 세계적으로 S. pneumoniae 의 DNA topology 에관여하는 gyrase 및 topoisomerase 효소의아미노산서열분석연구가활발하게진행되고있다. 최근 Optochin Test 에서전형적인 Streptococci 결과와상이하게분석되는구강의 viridans streptococci 인 S. mitis 와 S. oralis 균주의항생제내성은 S. pneumoniae 변이유전자의 interspecies transfer 의결과일것이라는가능성이보고된이후, 22,24) 해부학적으로상호연계된구강및상기도에서식하는세균들의약제교차내성도는병원성구강미생물감염의치료와밀접한관계성을갖는다고할수있다. 본연구에서도 SP96 과 SP32 를대상으로아미노산서열을분석한결과 Janoir 등 (1996) 의보고와유사하게 QRDR 지역의점돌연변이를관찰할수있었으며, 이로인하여분리된 S. pneumoniae 는 levofloxacin 에대하여내성을갖는것으로확인되었다. 향후구강상피또는객담등에서분리된 fluoroquinolone 내성 S. pneumoniae 의 gyrase 및 topoisomerase 의아미노산서열변이현상을 S. mutans 와 S. salivarius 등과비교하는후속연구를통하여 Streptococci 속세균의항생제내성확산에대한이해의폭을넓힐수있을것이다. 요 약 임상에서분리한총 174 균주의 S. pneumoniae 를대상으로검체별, 연령별, 성별분리빈도및 levofloxacin 의내성도를조사하였으며, 항생제감수성검사를통해다제내성도를확인하였다. S. pneumoniae 가가장많이분리된검체는객담으로서총 174 균주의 89.7% 인 156 균주가분리되었다. 특히남성과 51 세의고령환자에서분리빈도가높았으며, 분리된 levofloxacin 내성 8 균주모두는 penicillin, tetracycle, erytromycin, clindamycin 및 trimethoprim-sulfamethoxazoe 대한다제내성도함께소유하고있는것으로확인되었다. 분리된 levofloxacin 내성균주 SP32 (MIC 64 µg/ml) 와 SP96 (MIC 8 µg/ml) 의 QRDR 염기서열을분석한결과, SP32 와 SP96 균주의 GyrA 에서 Ser-81 Phe 로, SP96 에서 Ser-11 Gly 으로아미노산치환이각각확인되었고, ParC 에서는두균주모두 Ser- 79 Phe 으로치환된돌연변이가확인되었다. 감사의글 이논문은 2007 년도한남대학교학술연구조성비지원에의하여연구되었음.

5 Journal of Dental Hygiene Science Vol. 12, No. 2, pp. 109~113 (2012) 113 참고문헌 1. Kim KH et al.: The causative organism of bacterial meningitis in Korean children, J Korean Med Sci 13(1): 60-64, Kaplan VD et al.: Hospitalized community-acquired pneumonia in the elderly: age-and sex-related patterns of care and outcome in the United States. Am J Respir Crit Care Med 165(6): , Janssens J P: Pneumonia in the elderly (geriatiric) population. Curr Opin Pulm Med 11(3): , 최원석등 : 국내침습성폐렴사슬알균감염증의임상양상. Infection & Chemotherapy 42(3): , Gutiérrez FM et al.: The influence of age and gender on the population-based incidence of community-acquired pneumonia caused by different microbial pathogens. J Infect 53(3): , Klugman KP et al.: Drug resistance patterns and serogroups or serotypes of pneumococcal isolates from cerebrospinal fluid or blood. J Infect Dis 158(5): , Marisa Haenni et al.: Mutational Analysis of Class A and Class B Penicillin-Binding Proteins in Streptococcus gordonii. Antimicrob. Aqents and Chemother. 50(12): , Chen DK et al.: Decreased susceptibility of Streptococcus pneumoniae to fluoroquinolones in Canada. N Engl J Med 341(4): , Doern GV et al.: Antimicrobial resistance among clinical isolates of Streptococcus pneumoniae in the United states during , including a comparison of resistance rates since Antimicrob Agents Chemother 45(6): , Gonzalez Irene M et al.: Fluoroquinolone resistance mutations in the parc, pare, and gyra genes of clinical isolates of viridans group Streptococci. Antimicrob Aqents Chemother 42(11): , Janoir C et al.: High-level fluoroquinolone resistance in Streptococcus pneumoniae requires mutations in parc and gyra. Antimicrob Aqents Chemothe 40(12): , Yoshida H et al.: Quinolone-resistant mutations of the gyra gene of Escherichia coli. Mol Gen Genet 211(1): 1-7, Balsalobre L. et al.: Viridans group streptococci are donors in horizental transfer of topoisomerase IV genes to Streptoccus pneumoniae. Antimicrob. Agents and Chemother. 47(12): Margaret Ip et al.: Fluoroquinolone Resistance in Atypical Pneumococci and Oral Streptococci: Evidence of Horizontal Gene Transfer of Fluoroquinolone Resistance Determinants from Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents and Chemother. 51(8): , 송재훈등 : 지역사회획득폐렴의치료지침권고안. Tuberc Respir Dis 67(4): , Bowen MK et al.: The Optochin sensitivity test: a reliable method for identification of pneumococci. J Lab Clin Med 49(4): , MacFaddin JF: Biochemical tests for identification of medical bacteria(1st). The williams & wilkins Co., Baltimore pp. 9-15, Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Nineteenth informational supplement. CLSI document M100-S19, CLSI, Kim HS et al.:. Evaluation of microscan microstrep plus antimicrobial suscepttibility panel for testing Streptococcus pneumoniae. Korean J Clin Microbiol 11(1): 18-22, Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard seventh edition. CLSI document M7-A7. Wayne, PA; CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; sixteenth informational supplement. CLSI document M100-S16. Wayne, PA; CLSI, Jeffrey H, Miller: Methods in enzymology. Bacterial Genetic Systems, pp , Tleyjeh IM et al.: The impact of penicillin resistance on short-term mortality in hospitalized adults with Pneumococcal pneumonia: a systematic review and meta-analysis. Clin Infect Dis 42(6): , Pestova E et al.: Intracellular targets of moxi-floxacin: a comparison with other fluoroquinolones. J Antimicrob Chemother 45(5): , (Received February 18, 2012; Revised March 26, 2012; Accepted March 28, 2012)

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