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현아 팽
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1 ORIGINAL ARTICLE Korean J Clin Lab Sci. 017;9(): pissn eissn -6 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 9, No., December The Characteristics of Imipenem-Resistant Bacteria Isolated from One Patient Chul Park 1, Hyeok-Jae Lee, Min-Young Seo 1 Department of Clinical Laboratory Science, Gwangyang Health Science University, Gwangyang, Korea Department of Biomedical Laboratory Science, Gwangju Health Science University, Gwangju, Korea 한환자에게서분리된 Imipenem 내성세균들의특성 박철 1, 이혁재, 서민영 1 광양보건대학교임상병리과, 광주보건대학교임상병리과 Four imipenem-resistant bacteria were isolated from the clinical specimens of a patient with pneumonia. To identify the isolates, we used the GN card of Vitek II system and performed a phylogenetic analysis based on S rrna gene sequence. The isolates were identified as P. aeruginosa ( strains), P. monteilii (1 strain), and P. putida (1 strain), and were tested for antibiotic resistance after determining the MIC of imipenem to be g/ml using the AST-N5 card of Vitek II system. The imipenem-resistant genotypes were determined using PCR products amplified using specific -Lactamase gene primers. The MBL gene was identified in all four isolates. One strain of P. aeruginosa exhibited the VIM and SHV-1 type genes, while the other strain exhibited both VIM and OXA group II genes. According to the antimicrobial susceptibility test, the bacteria were more susceptible to amikacin than other antibiotics. DNA fingerprint analysis using ERIC-PCR to analyze the epidemiological relationship between strains estimated that both the P. aeruginosa isolates were similar, but exhibited different DNA band types. It is uncommon to find four strains of imipenem-resistant bacteria with different DNA band types in a single patient. Key words: ERIC (Enterobacterial repetitive intergenic consensus)-pcr, Imipenem-resistant bacteria, MBL (Metallo- -lactamase) gene Corresponding author: Chul Park Department of Clinical Laboratory Science, Gwangyang Health Science University, 5 Daehakro, Gwangyang 5776, Korea Tel: Fax: pcggs @gy.ac.kr This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright 017 The Korean Society for Clinical Laboratory Science. All rights reserved. Received: October 13, 017 Revised 1 st : October 3, 017 Revised nd : October 31, 017 Revised 3 rd : November, 017 Revised th : November 6, 017 Revised 5 th : November, 017 Accepted: November, 017 서론 190년대이후로부터각종 cephalosporin제제와 aminoglycoside, tetracycline, monobactam, quinolone, cabapenem, glycopeptide 등많은종류의항생제가개발되어실제임상에서사용되었다. 그러나이시기에는 penicillin 내성폐렴구균등이세계각지에서문제가되기시작하였고, imipenem-resistant Acinetobacter baumannii 균주도영국에서 처음분리가되었으며, 1990년대에는 vancomycin resistant enterococcus (VRE) 가출현하면서, 항생제내성세균의문제는세계적인관심사로대두되었다 [1]. 그후로는그람양성균의최종치료제라고여겨지던 glycopeptide 제제인 vancomycin 에내성인 vancomycin intermediate stapylococcus aureus (VISA) 가일본에서처음으로 1996년에출현함으로서효용성이심각하게흔들리기시작하였다. 그리고광범위 -lactamase (extended spectrum -lactamase, ESBL) 를생성하는그람음

2 1 Chul Park, et al. The Characteristics of Imipenem-Resistant Bacteria 성균의빈도도증가하기시작하여 -Lactamase 의효과적인치료를위해 carbapenem 항생제를사용하였다. 최근에는 carbapenem 항생제사용이빈번해지면서 Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens 등에서 carbapenem 내성인세균들이점차적으로증가하기시작하였다. 이러한세균들의내성기전으로는주로세포막의투과성감소와항균제의유출그리고 carbapenemase 생성등에의해나타나는데획득성 carbapenemase에의한내성은다른균들에게그내성유전자를전달할수가있어이러한세균들의전파로인한감염증치료와더불어내성확산의우려가대두되고있다 []. Carbapenemase에는 class A, B, D 등이있는데 class D 군에는 OXA형이있으며주로광범위 -lactam 항생제들을가수분해하지만 carbapenem 의가수분해능력이약하거나일부 extended spectrum- -lactam제를가수분해하지못하며아직까지는분리빈도는작지만 carbapenem 을가장잘분해하는것은 class B이며, 효소의활성을위해 Zn 과같은금속이온이필요하기때문에 metallo- -lactamase (MBL) 로명명되었으며 [3] 대표적인 MBL로는 IMP (active on imipenem), VIM (Verona integron-encoded metallo- -lactamasea) 이대표적이며, SPM (Sao Paulo metallo- -lactamase) 과 GIM (German imipenemase), SIM (Seoul imipenemase) 등도보고되었다 [,5]. 국내여러병원에서 003 년에분리된 imipenem 내성 Pseudomonas spp. 의 11.1% 와 Acinetobacter spp. 의 15.1% 는 IMP-1 또는 VIM- MBL 생성균이었다 [6]. 아시아, 유럽, 남, 북아메리카를포함한전세계적으로보고되고있으며브라질에서도 SPM-1 [7] 이보고되었다. IMP-1형 MBL 생성균은 1991년일본에서 P. aeruginosa로부터처음분리되었으며 [] 주로일본, 아시아및유럽에서도분리보고되었다 [9]. VIM-1형은이태리에서처음분리되었으며 [10] 이어서프랑스에서 VIM-형이분리되었다 [11]. 그이후대만및그리스에서 VIM-3형및 VIM-형 [1] 이각각보고되었는데, 국내에서는 1995년분리된 P. aeruginosa에서 VIM-형이처음분리되었으며 [13], Acinetobacter, S. marcescens [1] 및 E. cloacae [15] 등에서도분리되었다. 일본에서는 IMP-1형이주로분리되는반면에우리나라는 VIM-형이대부분을차지하였다 [6]. 이에본연구에서는전남순천에위치한종합병원중환자실에서폐렴으로입원한한환자에게서검체는다르지만 imipenem 내성세균이반복분리됨으로서 carbapenemase 생성균주선별검사와 -lactamase 유전자형을알아보고균주간의역학적연관성분석을위해 ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus)-pcr 을이용한 DNA 지문분석을하였다. 재료및방법 1. 연구대상 017년 월부터 017년 3월사이전남순천의한종합병원에서폐렴으로입원한한 ( 일개 ) 환자의임상검체에서분리된 carbapenem 의대표적약제인 imipenem 에내성을가진균주를 Vitek II system (BioMerieux, Marcy, 1 Eltoile, France) AST-N5 카드를이용해서 imipenem의최소억제농도 (MIC) 가모두 g/ml을확인한후본실험에사용하였다. 환자의검체로는객담, 기관지세척액, 농, 소변으로각각다르지만동일환자에게서 imipenem 에내성인균주가 개월사이에연속분리됨으로서총 균주를대상으로연구하였다.. 균주의동정순수분리한 imipenem 에내성인균주동정은미생물자동동정기기인 Vitek II system의 GN 카드를이용하였고, 종까지정확하게동정되지않았던균주를보다정확한동정을위해서 S rrna 유전자의염기서열을이용하여계통학적방법으로분석하였다. 3. DNA 추출 MHA (Mueller-Hinton Agar) 배지에서자란세균집락 1 loop를채취하여 Park과 Kim [] 의방법에따라서 DNA를추출하였고차가운 70% ethanol로세척한후건조해서 0 C 에냉동보관하였으며사용시멸균된증류수에녹여실험에이용하였다.. 계통분류학적연구 (S rrna 유전자염기서열분석 ) S rrna 유전자를증폭하기위해 7F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') 와 19R (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') primer 를사용하였으며 [17] PCR 반응액의조성및증폭조건은 Hwang 등 [1] 의방법을이용하였으며 PCR thermal cycler TP600 (Takara Bio Inc., Japan) 을이용하여증폭하였다. 염기서열분석은 ( 주 ) 제노텍 (GenoTech, Daejeon, Korea) 에의뢰하였으며결정된 S rrna 유전자염기서열의종간유사도는 BLAST을이용하여 GenBank 데이터베이스와비교검색하였다 []. 계통수작성은 neighbor-joining [19] 방법을이용하였으며진화거리는 Jukes와 Cantor [0] 의식을이용하였다. 계통수의신뢰도는 1,000회반복을통한 bootstrap

3 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 9, No., December 분석 [1] 을실시하여확인하였다. 5. 항생제감수성검사항생제의 MIC측정은 Vitek II system의 AST-N5 카드로측정하였으며 imipenem 에내성인균주는디스크확산법으로 McFarland 0.5관에맞춘세균현탁액을 MHA 배지에접종한후 10 g imipenem 항생제디스크 (Becton Dickinson, BBL, Sparks, USA) 를올려놓고37 C에서 1 hr 배양한후억제대의직경은 CLSI 기준에의해판독하였다 []. 대조균주로는 P. aeruginosa ATCC 753을사용하였다. 6. Carbapenemase 생성균주선별분리된균주가 carbapenemase 생성검증을위해 Hodge 변법으로확인하였다. 시험은 E. coli ATCC 59를생리식염수로 McFarland 0.5관탁도를맞추어 MHA 평판배지에접종한후배지중앙에 imipenem 디스크를올려놓은후중앙으로부터배지끝부분을향해시험세균을일직선으로접종하고 37 C에서 0 hr 배양하였다. 결과판정기준은시험한균주접종선중앙쪽말단부가다른부위에비해더넓게증식하면양성으로판정하였다 []. 7. MBL 검증분리된균주가 MBL 생성검증을위해 Imipenem-EDTA 디스크상승효과시험을실시하였다. 선별시험은균주를생리식염수에 McFarland 0.5관탁도로맞추어 MHA 배지에접종한후 10 g imipenem 디스크와 0.5 mm EDTA 10 L가함유된디스크를 10 mm 거리가되게올려놓고 1시간동안배양 한후억제대의확장현상이관찰되면양성으로판정하였다 [].. PCR을이용한 -lactamase 유전자형분석 -Lactamase 유전자형을검사하기위해기존에알려진 primer는 Table 1 [] 과같이사용하였으며 OXA group I은 OXA-5, OXA-7, OXA-10 and derivatives (OXA-11, OXA-1, OXA-, OXA-17) 과 OXA-13 and derivatives (OXA-19, OXA-) 를 OXA group II는 OXA-, OXA-3, OXA-15, OXA-0을 OXA group III은 OXA-1, OXA-, OXA-30, OXA-31 을각각포함한다 [3]. 그리고이들각각의 primer를이용하여 PCR을실시하여증폭하였다. PCR 반응액은 dntp ( 각.5 mm), MgCl mm, primer 각 0 pmol, Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea) 0.5 U, genomic DNA 100 ng 및반응완충용액 (10 mm Tris-HCl, 0 mm KCl, 1.5 mm MgCl ) 에총부피가 50 L가되도록증류수를첨가하였고 PCR 반응은 PCR thermal cycler TP 600 (Takara Bio, Foster City, CA, USA) 을이용하였으며 PCR반응조건은 95 C에서 5분간초기 denaturation 시키고, 95 C에서 30초, 59 C에서 30초, 7 C에서 0초의 cycle을 30회반복한후마지막으로 7 C에서 10분동안반응시켰다. PCR 산물은.5% agarose gel에전기영동한후확인하였다 []. 9. ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus)-pcr 을이용한 DNA 지문분석균주간역학적연관성을알아보기위해 ERIC-PCR 을 Park 과 Kim [] 의방법에따라실시하였다. 장내세균의반복서열 primer ERIC1R (5'-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3') Table 1. Primers used to detection -lactamase gene and the amplified fragment size Class Primer Sequence (5' 3') Target -lactamase Amplicon size (bp) A SHV-F CCG GGT TAT TCT TAT TTG TCG CT SHV-1 and derivative 31 SHV-R TAG CGT TGC CAG TGC TCG B IMP-F GCT ACC GCA GCA GAG TCT TTG IMP 657 IMP-R CCT TTA ACC GCC TGC TCT AAT G VIM-F GTT TGG TCG CAT ATC GCA AC VIM 51 VIM-R AGA CCG CCC GGT AGA CC D OXA-1F AGC CGT TAA AAT TAA GCC C OXA group III 90 OXA-1R CTT GAT TGA AGG GTT GGG CG OXA-F GCC AAA GGC ACG ATA GTT GT OXA group II 700 OXA-R GCG TCC GAG TTG ACT GCC GG OXA-10F TCT TTC GAG TAC GGC ATT AGC OXA group I 760 OXA-10R CCA ATG ATG CCC TCA CTT TCC OXA-F GTA CTA ATC AAA GTT GTG AA OXA-, 5, 6, 0, 7 1,05 OXA-R TTC CCC TAA CAT GAA TTT GT OXA-5F CGA TCA GAA TGT TCA AGC GC OXA-5 5 OXA-5R ACG ATT CTC CCC TCT GCG C

Carbapenemase 생성균주 선별검사 gel 사진을 저장하였고 Gelcompar II program (Applied Imipenem 내성 균주가 carbapenemase를 생성하는가를 알아 Maths, Belgium)을 이용하여 band pattern 간 유사도를 결정 보는 Hodge 변법 시험결과 균주 모두 양성반응을 보였고(Figure 하였으며,

4 Chul Park, et al. The Characteristics of Imipenem-Resistant Bacteria 와 ERIC (5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3')를 주 로 각각 동정되었다(Figure 1). 문제작(Bioneer Co., Daejeon, Korea)하여 전기영동 한 후 Ethidium bromide 용액(10 mg/ml)에서 10 분간 염색하고. Carbapenemase 생성균주 선별검사 gel 사진을 저장하였고 Gelcompar II program (Applied Imipenem 내성 균주가 carbapenemase를 생성하는가를 알아 Maths, Belgium)을 이용하여 band pattern 간 유사도를 결정 보는 Hodge 변법 시험결과 균주 모두 양성반응을 보였고(Figure 하였으며, Gel image는 TIFF file format으로 저장하였다. 그리 A), MBL 생성 균주를 선별하기 위한 imipenem-edta 상승효 고 negative image로 변환한 후 normalization 과정을 통해 각 과시험에서도 균주 모두가 양성반응을 보였다(Figure C). 기 다른 gel 상의 size marker와 pattern들을 표준화하였으며, band-matching algorithm은 Dice-coefficient를 이용한 3. MBL 생성 검증 paired-wise similarity 계산 방법을 이용하고 band-matching PCR을 통한 -lactamase 유형 분석에서 객담과 기관지 세 tolerance는 0.75%로 선택하였으며 Similarity matrice의 척액에서 분리된 P. aeruginosa 균주와 농에서 분리한 P. cluster 분석은 UPGMA (unweighted pair group method monteilii에서 Class B -lactamase VIM 유전자가 각각 분리 using arithmetic average)에 의해 수행하였다[]. 되었고 소변에서 분리된 P. putida에서는 IMP 유전자가 검출되 었다. 그리고 P. aeruginosa 균주에서는 VIM 유전자와 함께 결 과 class A 유전자형인 SHV-1 and derivative 유전자와 Class D 유전자형인 OXA group II 유전자를 각각 공동으로 보유하고 있 1. 균주의 분리 및 동정 었다(Table, Figure 3). 017년 월부터 017년 3월사이 한 종합병원 중환자실에서 폐렴으로 입원한 한(일개) 환자의 임상검체에서 분리된. 항생제 감수성 imipenem에 내성을 가진 균주를 Vitek II system의 GN 카드 IR01번 균주인 P. aeruginosa는 amikacin 만이 감수성이었 를 이용해 동정한 결과 객담, 기관지 세척액 검체에서 P. aeru- 고 모든 항생제에서 내성을 보였고 IR0번 균주인 P. aeru- ginosa를 각각 1균주씩 분리하였고 농과 소변검체에서 Pseu- ginosa는 tigecycline, minocycline, ciprofloxacin, ticarcil- domonas spp.로 동정된 균주를 S rrna 유전자 염기서열 분 lin/clavulanic acid 감수성을 보여 IR01번 균주인 P. aeruginosa 석을 이용한 계통분류학적 분석에 의해 P. monteilii, P. putida 와는 다른 항생제 감수성 경향을 보임으로서 서로 다른 균주임 을 추정 할 수 있었다. IR03번 균주인 P. monteilii는 amikacin, aztreonam, ceftazidime, piperacillin/tazobactam, ticarcillin/clavulanic acid, cefepim, gentamicin, meropenem, piperacillin에 감수성을 보였다. IR0번 균주인 P. putida는 amikacin, ciprofloxacin, gentamicin의 3가지 항생제에 감수 성을 보였으며 나머지 항생제에는 내성을 보였다(Table 3). Figure 1. Neighbour-joining tree based on nearly complete S rrna gene sequences showing relationships between strains, members of the genus Pseudomonas. The percentage numbers at the nodes are the levels of bootstrap support based on neighbour-joining analyses of 1,000 resampled data sets. The sequence of Escherichia coli ATCC 11775T (X075) was used as an outgroup. Bar, 0.01 nucleotide substitution per position. Figure. Modifid Hodge test (A) and EDTA double disc synergy test (B) and (C). (A) Upper and low are imipenem-hydrolyzing strains which distorted the inhibition zone. Left and right are imipenem-non-hydrolyzing strains with no effect on the zone (Negative control). (B), (C) The left disc contains 5 mm EDTA and the right disc contains 10 g imipenem. (C) is MBL producing strain and (B) is MBL non-producing strain.

Korean J Clin Lab Sci. Vol. 9, No., December 017 17 Table. Identification and imipenem-resistance genotype of the isolates Strain No.

putida VIMSHV-1 VIMOXA group II VIM IMP Abbreviation: BWF, Bronchial washing fluid. Table 3. Antibiotic susceptibility results of strains by Vitek II system MIC ( g/ml) Strain No.

5 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 9, No., December Table. Identification and imipenem-resistance genotype of the isolates Strain No. Specimen Identification Genotype of -lactamase Modified hodge test EDTA double disk synergy test IR01 IR0 IR03 IR0 Sputum BWF Pus Urine P. aeruginosa P. aeruginosa P. monteilii P. putida VIMSHV-1 VIMOXA group II VIM IMP Abbreviation: BWF, Bronchial washing fluid. Table 3. Antibiotic susceptibility results of strains by Vitek II system MIC ( g/ml) Strain No. AK AZT TIG CAZ MIN CIP CFP GM IM MER P/T TIM A/S PIP IR01 IR0 IR03 IR Abbreviations: AK, amikacin; AZT, aztreonam; TIG, Tigecycline; CAZ, ceftazidime; MIN, Minocycline; CIP, ciprofloxacin; CFP, cefepime; GM, gentamicin; IM, imipenem; MER, meropenem; P/T, piperacillin/tazobactam; TIM, ticarcillin/clavulanic acid; A/S, Ampicillin/Sulbactam; PIP, Piperacillin. Figure. ERIC-PCR patterns of genomic DNA of imipenem resistant P. aeruginosa, P. monteilii and P. putida. 씩 분리하였고 농과 소변검체에서 P. monteilii, P. putida로 각 Figure 3. Detection of -lactamase genotype isolated from strains. M, 1 kb plus DNA ladder; Lanes A, P. aeruginosa IR01 (SHV-1); B, P. aeruginosa IR01 (VIM); C, P. aeruginosa IR0 (OXA group II); D, P. putida IR0 (IMP); E, P. monteilii IR03 (VIM); F, P. aeruginosa IR0 (VIM). 각 동정되었던 총 균주를 대상으로 DNA band 유형을 확인한 결과 동일균종에서도 서로 다른 DNA band 유형으로 확인 되었 다(Figure ). 고 찰 5. 계통분류학적 분석(S rrna유전자 염기서열 분석) S rrna 유전자 염기서열의 종간 유사도를 알아보기 위해 -lactam 항생제는 그람음성간균의 감염증치료에 광범위하 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 게 사용되어 왔지만 얼마 지나지 않아 항생제 사용의 증가는 BLASTN program을 이용하여 GenBank database 에서 비교ㆍ penicillin과 광범위 cephalosporin을 가수분해하는 extended 검색하였으며 S rrna 유전자 염기서열에 기초하여 neigh- spectrum- -lactamase를 생성하는 내성세균의 출현을 야기 bour-joining tree를 작성하여 계통학적 위치를 확인 하였다 시켰다. 이들 내성세균의 치료에는 비교적 안정한 carbapenem []. Vitek II system에 의해 Pseudomonas spp.로 정확하게 계열의 항생제를 사용하고 있다. 그러나 이러한 항생제의 과다 동정되지 않았던 균주는 P. monteilii, P. putida로 각각 동정되 사용으로 인해 carbapenem에 내성인 세균들의 출현은 임상에 었다(Figure 1). 서 커다란 문제로 대두되고 있으며 특히 P. aeruginosa와 A. baumanni가 carbapenemase를 생성하여 내성세균으로의 보 6. ERIC-PCR을 이용한 DNA 지문 분석 객담, 기관지 세척액 검체에서 P. aeruginosa를 각각 1균주 고가 전 세계적으로 점차 증가하고 있는 추세이다[]. 또한 최근 에는 장내세균에서도 carbapenemase 생성균주가 나타나고 있

6 1 Chul Park, et al. The Characteristics of Imipenem-Resistant Bacteria 는실정이다 [15]. 본연구는전남순천의한종합병원중환자실에입원한한환자에게서 개월사이에검체별로 imipenem 내성세균이연속해서 균주가분리되어 Vitek II system 을이용해서동정과항생제 MIC 분석을하였다. 동정된균주로는 P. aeruginosa 균주와 Pseudomonas spp. 균주로정확하게동정되지않아 S rrna 유전자염기서열분석을이용한계통분류학적분석에의해 P. monteilii, P. putida로각각동정되었다. Vitek II system 에의해동정방법은생화학적특성에의한동정법으로유사한특성을갖는유전종의동정에는한계가있다는것을보여주었다 [5]. -lactamase 특이시발체를사용하여유전자형을검출한결과 class A에속한 -lactamase인 SHV-1 and derivative 유전자는 1 균주, class B에속한 metallo- -lactamase 중 IMP 유전자는 1 균주, 그리고 VIM 유전자는 3 균주가검출되었으며 Class D에속한 -lactamase인 OXA group II 유전자도 1 균주가검출되었다. 특징적인것은종에따른 imipenem 내성유전자형을분석한결과 균주의 P. aeruginosa에서 VIM 유전자와 SHV-1 and derivative 유전자, OXA group II 유전자를각각동시에보유하고있음을알수있었으며 P. monteilii, P. putida 각각 1 균주들도 MBL 유전자인 VIM 유전자와 IMP 유전자를각각보유하고있어한환자에게서 MBL 유전자가반복분리됨으로서병원내 -lactamase 내성유전자들을확인할수있었다. Carbapenemase 생성을알아보는 Hodge 변법시험결과에서는 균주모두에서양성반응을보였고, 특히 MBL 생성능을보는 imipenem-edta disk 효과시험결과에서도 균주모두에서양성반응을보여분자생물학적방법인 MBL 유전자형이모두검출되었던것과일치한결과를보여주었다. 항생제감수성검사에대한균주의내성율은 IR01, IR0번균주는 P. aeruginosa로같은균종이었지만 IR01번은 amikacin 만이감수성이었고모든항생제에서내성을보였지만 IR0번균주는 tigecycline, minocycline, ciprofloxacin, ticarcillin/clavulanic acid 감수성을보여 IR01번균주인 P. aeruginosa와는다른항생제감수성경향을보여서로다른균주임을추정할수있었다. IR03번균주인 P. monteilii는 amikacin, aztreonam, ceftazidime, cefepim, gentamicin, meropenem, piperacillin/tazobactam, ticarcillin/clavulanic acid, piperacillin에감수성을보여대체적으로내성률이적었지만 IR0 번균주인 P. putida는 amikacin, ciprofloxacin, gentamicin 3가지항생제에만감수성을보였고나머지항생제들에서는내성을보였다. 대체적으로 aminoglycoside 계통의 amikacin 에대한내성율은다른항생제들보다는다소낮은내성율을보여 주었다. 내성유전자에따른항생제내성율을보면 P. aeruginosa 가 P. monteilii, P. putida보다 MBL유전자와또다른내성유전자를동시에함께보유하고있어항생제내성율이높을것이라생각했지만결과는유의한차이는볼수없었다. ERIC-PCR 방법을이용한 DNA 지문분석결과, 한환자에게서검출된 균주모두서로다른 DNA band 유형을확인하였으며, 특히동일종으로분리된 P. aeruginosa 균주는호흡기유래검체로서같은균주일것으로판단하였으나 DNA band 유형의상동성이서로다른 band 양상을보여서로다른클론에서유래되었음을알아볼수있었다. 최근에점차적으로 imipenem 내성세균의분리율이증가추세에있는데본연구에서는한명의폐렴환자에게서 균주의 imipenem 내성세균이 개월사이에연속해서분리가되는첫사례로서특히분리된동종의 P. aeruginosa 균주도역학적연관성이상이함을확인하였다. 그러므로이러한내성세균들에의한감염은면역력이저하된장기입원환자와중환자실환자들에게치료적어려움에당면해있으며환자들에감염방지를위해서도적극적인손위생과더불어감염관리활동을통해예방해야만하고진단검사의학과에서는내성세균종과항생제감수성결과에대한흐름을임상의에게제시함으로서항생제내성에대한원내감염의위중함을인지시켜주어야할것으로생각된다. 요약폐렴의한 ( 일개 ) 환자의임상검체에서연속적으로분리된 Imipenem 내성세균 균주를분리하였다. 분리균을동정하기위해 Vitek II system의 GN card를이용하였으며 S rrna유전자염기서열을기초로계통학적분석을실시하였다. 분리균은 P. aeruginosa ( strains), P. monteilii (1) 및 P. putida (1) 으로동정되었다. 분리균들의항생제에대한내성시험은 Vitek II system AST-N5 card를이용해서 imipenem 의최소억제농도가모두 g/ml을확인한후실험에사용하였다. -Lactamase 유전자의특이시발체를이용하여증폭한 PCR 산물로 imipenem 내성유전자형을결정하였는데분리된 균주모두에서 MBL 유전자를확인하였으며 균주의 P. aeruginosa 는 MBL유전자중 VIM형과 SHV형유전자를그리고또다른균주는 VIM형과 OXA group II형유전자를동시에보유하고있었다. 항생제감수성결과에서는 amikacin 이다른항생제보다감수성을보였을뿐대체적으로내성율이높았다. 균주들간의역학적연관성분석을위해 ERIC-PCR 을이용한 DNA 지문분석결과, 분리된 균주의 P. aeruginosa는유사한균주일것으로추정하

7 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 9, No., December 였으나 DNA band 유형의상동성은서로다른유형임을알아볼수있었다. 특이하게한환자에게서 imipenem 내성세균이 균주가검출된것은이례적이며동종의 DNA band 유형도서로상이하였다. Acknowledgements: None Funding: The Research has been conducted by the Research Grant of Gwangju Health Science University in 01 (30100). Conflict of interest: None REFERENCES 1. Livermore DM. The impact of carbapenemases on antimicrobial development and therapy. Curr Opin Investig Drugs. 00;3():1-.. Lee K, Lim YS, Yong D, Yum JH, Chong Y. Evaluation of the Hodge test and the imipenem-edta double-disk synergy test for differentiating metallo-beta-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol. 003;1(10): Rasmussen BA, Gluzman Y, Tally EP. Cloning and sequencing of the class B beta-lactamase gene (ccra) from Bacteroides fragilis TAL3636. Antimicrob Agents Chemother. 1990;3(): Lee K, Yum JH, Yong D, Lee HM, Kim HD, Docquier JD, et al. Novel acquired metallo- -lactamase gene, bla(sim-1), in a class 1 integron from Acinetobacter baumannii clinical isolates from Korea. Antimicrob Agents Chemother. 005;9(11): Drieux L, Brossier F, Sougakoff W, Jarlier V. Phenotypic detection of extended spectrum betalactamase production in Enterobacteriaceae: review and bench guide. Clin Microbiol Infect. 00;1(Suppl 1): Lee KW, Lee WG, Uh Y, Ha GY, Cho J, Chong Y. VIM-and IMP-type metallo- -lactamase producing Pseudomonas spp. and Acinetobacer spp. in Korean Hospitals. Emerg Infect Dis. 003;9(7): Toleman MA, Simm AM, Murphy TA, Gales AC, Biedenbach DJ, Jones RN, et al. Molecular characterization of SPM-1, a novel metallo- -lactamase isolated in Latin America: report from the SENTRY antimicrobial program. J Antimicrob Chemother. 00;50(5): Watanabe M, Iyobe S, Inoue M, Mitsuhashi S. Transferable imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 1991;35(1): Koh TH, Wang GCY, Sng LH. IMP-1 and a novel metallo- -Lactamase, VIM-6, in fluorescent Pseudomonads isolated in Singapore. Antimicrob Agents Chemother. 00;(6): Lauretti L, Riccio ML, Mazzriol A, Cornaglia G, Amicosante G, Fontana R. et al. Cloning and characterization of bla VIM, a new integron-borne metallo- -lactamase gene form a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother. 1999;3(7): Rasmussen BA, Bush K, Keeney D, Yang Y, Hare R, O'Gara C, et al. Characterization of IMI-1 -lactamase, a class A carbapenem-hydrolyzing enzyme from Enterobacter cloacae. Antimicrob Agents Chemother. 1996;0(9): Pournaras S, Tsakris A, Maniati M, Tzouvelekis LS, Maniatis AN. Novel variant (bla VIM-) of the metallo- -lactamase gene bla VIM-1 in a clinical strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 00;6(1): Lee KW, Lim JB, Yum JH, Yong D, Chong Y, Kim JM. bla VIM- cassette-containing novel integrons in metallo- -lactamaseproducing Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida isolates disseminated in a Korean hospital. Antimicrob Agents Chemother. 00;6(): Yum JH, Yong D, Lee K, Kim HS, Chong YA. A new integron carrying VIM- metallo- -lactamase gene cassette in a Serratia marcescens isolate. Diagn Microbiol Infect Dis. 00;(3): Jeong SH, Lee K, Chong Y, Yum JH, Lee SH, Choi HJ, et al. Characterization of a new integron containing VIM-, a metallo-beta-lactmase gene cassettes, in a clinical isolate of Enterobacter cloacae. J Antimicrob Chemother. 003;51(): Park C, Kim NH. Genetic diversity of imipenem-resistant bacteria. The Korea Entertainment Industry Association. 013; 7(1): Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 197;69(): Hwang YM, Kim DK, Lee JH, Baik KS, Park C, Seong CN. Bacterial community of natural dye wastewater treatment facility. Journal of Life Science. 01;(): Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 197; (): Jukes TH, Cantor CR. Evolution of protein molecules. In: Munro HN, editor. Mammalian protein metabolism. New York: Academic Press; p Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution. 195;39(): Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; th Informational supplement, M100-S. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; Frédéric B, Catherine B, Nicole LZ. Identification of PSE and OXA -lactamase genes in Pseudomonas aeruginosa using PCR restriction fragment length polymorphism. J Antimicrobial Chemotherapy. 00;50(1): Jang IH, Park SD, Uh Y, Lee GS, Kim JB, Choi I. Molecular characteristics of bla OXA-3-producing Acinetobacter baumannii isolated from a university hospital. Ann Clin Microbiol. 013; (3): Bosshard PP, Abels S, Zbinden R, Bottger EC, Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic gram positive rods in the clinical laboratory (an 1-month evaluation). J Clin Microbiol. 003;1(9):13-10.

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence