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1 Journal of Bacteriology and Virology Vol. 36, No. 1 p 다약제내성 Acinetobacter 균의유전종결정및항균제내성의특성규명 경북대학교의과대학미생물학교실, 단국대학교의과대학미생물학교실 1 임유미 최태생 1 김정민 * Determination of Genomospecies and Characterization of Antimicrobial Resistance of Multi-drug Resistant Acinetobacter spp. Isolates Yu-Mi Lim, Tae-Saeng Choi 1 and Jungmin Kim * Department of Microbiology, Kyungpook National University, School of Medicine, Department of Microbiology, Dankook University, College of Medicine 1 Received : February 14, 2006 Accepted : March 7, 2006 Acinetobacter species are non-fermentative Gram-negative coccobacilli and they have emerged as important nosocomial pathogens which are associated with the significant multidrug resistance in recent years. Carbapenem-resistant A. baumannii (CRAB) and pandrug-resistant A. baumannii (PDRAB) were reported in 1991 and 1998, respectively. Fiftyeight isolates of Acinetobacter species recovered from a university hospital between August 2004 and March 2005 were investigated for the existence of CRAB, PDRAB, extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Acinetobacter and examined for their phenotypic and genotypic characteristics. Genomospecies of Acinetobacter species were determined by amplified rdna restriction analysis (ARDRA) and antimicrobial susceptibility test was performed with 13 kinds of antimicrobial agents. Metallo-β-lactamase (MBL) producers were screened by modified hodge test and confirmed by imipenem-edta disk synergy test. Detection of bla IMP-1, bla VIM-2, bla TEM, and bla PER-1 was performed by PCR. Genomic DNAs were analyzed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Among 58 isolates of Acinteobacter species, 40 isolates were identified as genospecies 2 (A. baumannii), 9 were 13TU, 5 were A. phenon 6/ct, and 4 were Acinetobacter genospecies 3 by ARDRA. Thirteen isolates were confirmed as MBL-producers and bla IMP-1 and bla VIM-2 were carried by 5 and 8 isolates of them, respectively. MBL-producers were mostly 13TU, A. phenon 6/ct 13TU, and Acinetobacter genospecies 3 and they were susceptible to ciprofloxacin and ampicillin-sulbactam. Bla PER-1 was carried by thirteen isolates and 12 isolates of them were PDRAB showing resistance to all antimicrobial agents tested, including ceftazidime, cefepime, aztreonam, ciprofloxacin, amikacin, gentamicin, ampicillin-sulbactam, and imipenem. In conclusion, most MBL-producers belonged to 13TU, A. phenon 6/ct 13TU, and Acinetobacter genospecies 3 which were susceptible to ciprofloxacin and ampicillin-sulbactam, whereas 12 of 13 PER-1-producers were PDRAB originated from the same clone. Key Words: Acinetobacter spp., Genomic typing, Metallo-β-lactamase, PER-1, Pan-drug resistant Acinetobacter baumannii 서 론 Acinetobacter 균종은 1980 년대중반까지균의여러가지 * 교신저자 : 김정민 , 대구광역시중구동인 2 가 101 번지, 경북대학교의과대학미생물학교실 Phone: , Fax: , minkim@knu.ac.kr 생화학적성상에의해동정및분류되었지만, Bouvet과 Grimont (1986) 등은 DNA-DNA hybridization 방법에의거하여유전자형에따른유전종분류방법을고안하였다 (4,29). 그후 Bouvet과 Grimont은 amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) 방법을이용하여 12개의유전종을보고하였으며, 그동안새로운종의보고가계속적으로추가되어최근까지 32종의 Acinetobacter 균종이보고되었다 (5,7,10,23, 21

2 22 임유미, 최태생, 김정민 30,33). 대부분의 Acinetobacter 균종은환경미생물이지만, 인체나동물감염의경우 A. calcoaceticus-a. baumannii complex (ACB complex) 에속하는 A. calcoaceticus ( 유전종 1), A. baumannii ( 유전종 2), Acinetobacter genospecies 3, 및 Acinetobacter genospecies 13TU (Tjenberg and Ursing) 균종이대부분을차지하며, 특히 A. baumannii에의한감염이 90% 이상을차지하고있다 (3). 일반적으로그람음성세균은그람양성세균에비해건조한환경에서생존력이약하나, Acinetobacter 균종은그람음성세균임에도건조한무생물표면인침대시트, 베개및호흡기구, 혈관내삽관튜브등의병원환경에오랫동안서식하다가주로면역력이약한환자에게서폐렴, 패혈증, 요로감염, 상처감염, 수막염과같은광범위합병증을일으키는원내감염균으로알려져있다 (2,3,27,28.) Acinetobacter 균종의 carbapenem 내성기전에는항균제의막투과성감소나유출그리고다양한 β-lactamase에의한내성등이있다. 이중항균제의막투과성감소나유출에의한 carbapenem 내성은대부분유도에의하거나미약하며다른균으로전파가능성이낮고, 이들의내성기전보다중요한것은 carbapenemase에의한약제의불활성화로 carbapenemase 중에서도 carbapenem을가장잘분해하고이동성인자인 integron 내에존재하는것으로알려진 metallo-βlactamase (MBL) 에의한내성이다. MBL 유전자중 bla IMP-1 유전자가일본에서분리된 P. aeruginosa에서처음발견되었고 (1991) (24), bla IMP-1 유전자를보유하고있는 P. aeruginosa, K. pneumoniae, Citrobacter freundii, P. putida, P. stutzeri, Achromobacter xylosoxidans는일본에서자주보고되고있다 (12). bla VIM-2 유전자는이태리에서분리된 1주의 P. aeruginosa (1997) 에서처음발견되었고 (13) 한국에서는 1995년 MBL을생성하는 P. aeruginosa와 P. putida 다수를분리하여그것이프랑스에서보고된 bla VIM-2 유전자와염기서열이같음을보고하였으며 (15,19) A. baumannii와 Acinetobacter genospecies 3에서 bla VIM-2 유전자가검출되었다 (11). 현재대부분의원내감염 A. baumannii의경우, carbapenem 제제를제외한 2, 3세대 cephalosporin 제제, antipseudomonas penicillin 제제, fluoroquinolones 제제및 aminoglycoside 제제를포함한항균제에광범위하게내성을나타내고있다 (1, 3,6,8). 최근에는다약제내성균의증가로 carbapenem 제제의사용이늘어나면서 MBL-산생 Acinetobacter 균의증가와함께 carbapenem 제제를포함한모든항균제에내성을나타내는 pan-drug resistant A. baumannii (PDRAB) 가출현하게되었다 (11). 국내의경우, 1999년 30곳의병원에서분리된 Acinetobacter 균종의항균제감수성시험시행결과, 3세대 cephalosporin 제제, aminoglycoside 제제, monobactam 제제, 그리고 quinolone 제제등에 65% 이상의내성율을나타냈으며, imipenem 에도 6.2% 의내성율을나타내었다 (18). 2005년 1월에서 3월까지서울에있는병원환자에서분리된 Acinetobacter 균종의감수성시험시행결과에서는 penicillin 제제, aminoglycoside 제제, cephalosporin 제제, 및 monobactam 제제등의항균제에 70% 이상의내성율을나타냈으며, imipenem에 40% 의내성율을나타내어 (20) 1999년의 imipenem 내성율 6.2% 에비해크게증가한것으로나타났다. 이러한다약제내성 Acinetobacter 균종에의한원내감염이증가함에따라치료에사용될수있는항균제의제한과내성으로인한치료실패가중요한문제로등장하였다. 본연구에서는 2004년 8월부터 2005년 3월까지일개대학병원의환자검체에서분리된 Acinetobacter 균종을대상으로 Acinetobacter 균종의유전종을결정하고항균제내성양상과보유내성유전자를조사하여최근문제가되고있는 MBL-산생 Acinetobacter, extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 산생 Acinetobacter 및 PDRAB 균의존재를확인하고, 이균주들의표현형및유전형의특징을상세하게규명하였다. 재료및방법 1. 대상균주 2004년 8월부터 2005년 3월까지일개대학병원의환자검체에서분리된균주중 Vitek GNI card (biomeriex Vitek Inc., Hazelwood, Mo., U.S.A.) 검사결과, Acinetobacter baumannii 및 A. calcoaceticus-a. baumannii complex (ACB complex) 로동정된 58주를대상으로하였다. 2. Amplified rdna restriction analysis (ARDRA) Vaneechoutte 등의방법 (32) 에따라 ARDRA 방법을이용하여 Acinetobacter 균주의유전종을결정하였다. 평판배지에서배양된집락을증류수에부유하여 10분간끓여 PCR의주형으로사용하였다. PCR 반응을위하여 5 U Taq polymerase (rtaq, TaKaRa, Japan), 2.5 mm dntp, 10 mm KCl, 25 mm MgCl 2 로조성된 PCR 반응액에 25 pmol primer와 1.5 µl의 DNA를넣어최종 50 µl로만들어시행하였으며, 사용된 primer의염기서열은다음과같다 ; forward primer는 5'-TGG CTC AGA TTG AAC GCT GGC GGC-3' 이고 reverse primer는 5'-TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC CA-3' 이다. PCR 반응은 thermal cycler (Model 9600, Perkin-Elmer Cetus, CA) 를사용하였고반응조건은 94 에서 6분간반응시켜주형 DNA를변형시켰고, 다시 94 에서 45초, 60 에서 45초, 72 에서 1분간 35회반복하고, 마지막으로 72 에서 7분간반응시킨

3 Multi-drug Resistant Acinetobacter baumannii 23 후 4 에서중합반응을종료시켰다. 반응후생성된산물은 1.2% agarose gel에서영동하여결과를확인하였고, 5 µl 반응산물에 CfoI, AluI, MboI, RsaI, 및 MspI (Fermentas, USA) 의제한효소를처리하여 37 에서 2시간반응시킨후, 2% agarose gel에서영동하여결과를확인하고 band의양상을아래의웹 ( html) 에제시되어있는표준균주의제한효소절단양상 (Fig. 1) 과비교하여상기의제한효소절단결과에해당하는번호를조합하여최종적으로유전종을결정하였다. 3. 항균제감수성검사와 MIC (minimum inhibitory concentration) 측정사용된항균제는 piperacillin (Pi, MP Biomedicals, France), ticarcillin (Tc, MP Biomedicals, France), amikacin (Ak, ICN Biomedicals, USA), gentamicin (Gm, 신풍제약 ), tobramycin (Tb, 동광제약 ), ciprofloxacin (Ci, Sigma-Aldrich, China), ceftazidime (Cz, Greenford, England), cefepime (Cp, 보령제약 ), aztreonam (At, MP Biomedicals, France), imipenem (Im, MERCK&CO, USA), meropenem (Me, 유한양행 ), ampicillin-sulbactam (SMA, 한국유니온제약 ), 및 tazobactam (Tz, MP Biomedicals, France) 등 13종이다. National Committee for Clinical Laboratory Standards의방법 (22) 에따라항균제감수성검사와 MIC를측정하였으며, 감수성검사의정도관리를위하여 E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 표준균주를사용하였다. 4. 표현형에의한 metallo-β-lactamase 산생균의검색 Figure 1. Restriction patterns obtained after restriction digestion with CfoI, AluI, MboI, RsaI, and MspI for amplified 16S rdna of different Acinetobacter species. Numbers below each lane correspond to arbitrarily assigned ARDRA pattern numbers for each enzyme ( html). 이등의방법 (14) 에따라 modified hodge test와 imipenem- EDTA disk syergy test를시행하였다. Modified hodge test는지시세균인 E. coli ATCC 25922를생리식염수에희석하여 McFarland 0.5관탁도로맞추어 Mueller-Hinton agar (MHA) 평판배지에접종한후배지중앙에 imipenem disk 놓을자리를정하고그곳으로부터배지접시가장자리를향해시험세균을획선접종하였다. 35 에 15~30분정도방치후 50 Table 1. Oligonucletide primers used for detection of β-lactamase genes Primers Tm a ( ) Nucleotide sequence References TEM-sence TEM-antisence SHV-sence SHV-antisence CTX-M-sence CTX-M-antisence OXA-1-sence' OXA-1-antisence PER-1-sence PER-1-antisence VIM-2-sence VIM-2-antisence IMP-1-sence IMP-1-antisence a Annealing temperture used for PCR 5'-ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA-3' 5'-GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC-3' 5'-TGG TTA TGC GTT ATA TTC GCC-3' 5'-GGT TAG CGT TGC CAG TGC T-3' 5'-CGC TTT ATG CGC AGA CGA-3' 5'-GAT TCT CGC CGC TGA AGC-3' 5'-AGC CGT TAA AAT TAA GCC C-3' 5'-CTT GAT TGA AGG GTT GGG CG-3' 5'-ATG AAT GTC ATT ATA AAA GC-3' 5'-AAT TTG GGC TTA GGG CAA GAA A-3' 5'-ATT GGT CTA TTT GAC CGC GTC-3' 5'-TGC TAC TCA ACG ACT GAC CG-3' 5'-CTA CCG CAG CAG ACT CTT TGC-3' 5'-GAA CAA CCA GTT TTG CCT TAC C-3' Expected amplicon size (bp) AB AY AY AV Z DQ AB

4 24 임유미, 최태생, 김정민 mm zinc sulfate 용액 10 µl을떨어뜨린 imipenem disk (10 µg, BD BBL TM Biosciences, USA) 를올려놓고 37 에서 16~20시간배양하여결과를판독하였다. Imipenem-EDTA disk synergy test는시험균주를생리식염수에 McFarland 0.5관탁도로맞추어 MHA 평판배지에접종한후 10 µg imipenem 디스크와 0.5 M EDTA 디스크사이의거리가 10 mm가되게올려놓고 37 에서 16~20시간배양하여결과를판독하였다. 5. PCR을통한 β-lactamase 유전자검색 β-lactamase 내성유전자의검색을위해 primer를제작 (Table 1) 하여 PCR을시행한후, ( 주 )Macrogen에염기서열분석을의뢰하였다. PCR은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea) 와 thermal cycler (Model 9600, Perkin-Elmer Cetus, CA) 를이용하였다. 6. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) Mold의제작은 Gautom의방법 (9) 을따랐다. 평판배지에균을접종하여하룻밤배양한후, OD 600 값이 1.3이되도록균을 cell suspension buffer (100 mm Tris, ph 8.0; 100 mm EDTA, ph 8.0) 에부유하고, 부유한균액 200 µl에 proteinase K를 1 mg/ml가되도록첨가하여 55 에서 10분간반응시키고동량의 2% InCert agarose를균부유액과재빨리혼합하여 agarose의최종농도가 1% 가되게한후, 미리차게준비한 plug mold에 100 µl씩분주하여굳을때까지 4 에서 15 분간방치하였다. Lysis buffer (50 mm Tris, ph 8.0; 50 mm EDTA, ph 8.0; 1% sarcosine; 1 mg proteinase K per ml) 2 ml에 plug를넣고, 55 에서 80 rpm으로 6시간반응시킨후 plug 를 50 에예열된멸균증류수와 TE buffer (10 mm Tris, ph 8.0; 1 mm EDTA, ph 8.0) 로각각 15분씩 3회세척한후, 1.5 ml의 TE buffer에넣어서 4 에보관하였다. 각 plug를 5 mm 폭으로자른후제한효소 buffer 100 µl에넣고상온에서 15 분간반응시킨후, 새로운제한효소 buffer 200 µl에 50 U의 ApaI 제한효소 (Boerhinger Mannheim Co.) 를첨가하여, 37 에서 24시간반응시켜 TE buffer 1 ml로세척한다음영동에사용하였다. 0.5배농도의 TBE buffer에 1% pulsed field certified agarose로 running gel을만든후, 제한효소로처리한 plug와 size marker로서 lambda ladder (Bio-Rad Co, USA) 를 agarose gel의 well에넣어주고, running gel과동일한 agarose 로 well을채워주었다. 0.5배농도의 TBE buffer를이용하여 CHEF-DR III system (Bio-Rad Co, USA) 에서 initial pulse 5초, final pulse 20초, 6 V/cm, angle 120 조건으로 14 에서 18.5 시간전기영동하였다. 전기영동이끝난후 ethidium bromide (1 µg/ml) 로 gel을 30분간염색한다음증류수로충분히세척하여 UV-transilluminator 하에서결과를확인하였다. Pattern 분석을위해 Gel Compar II software (Applide Maths) 를이용하였다. 결과 1. Acinetobacter 균종의유전종결정본연구에서는병원환자에서분리된균주중 Vitek GNI card를통해 A. baumannii 및 A. calcoaceticus-a. baumannii complex (ACB complex) 로동정된 58주를대상으로 ARDRA 방법을이용한유전종동정을시행하였다 (Table 2). 그결과, Genospecies 2 (A. baumannii) 가 40주 (69.0%) 로가장많았으며, 13TU가 9주 (15.5%), A. phenon 6/ct 13TU가 5주 (8.6%), 그리고 Acinetobacter genospecies 3 (AG3) 가 4주 (6.9%) 로나타났다. Vitek GNI card에의해 A. baumannii로동정된 47주중 34주가유전종 2로 A. baumannii였고, 나머지는유전종 13TU (7주), 유전종 A. phenon 6/ct 13TU (2주) 및 Acinetobacter genospecies 3 (4주) 로확인되었다. Vitek GNI card에의해 ACB complex로동정되었던 11주는유전종 13TU (2주), Table 2. ARDRA profiles of Acinetobacter species Pattern with enzyme a Genomic species CfoI AluI MboI RsaI MspI No. of isolates Reference strain 2 (A. baumannii) ATCC ATCC ATCC ATCC TU RUH 2624 A. phenon 6/ct 3TU MGH 99896, 5804 a Numbers correspond to arbitrarily assigned ARDRA pattern numbers for each enzyme and patterns are shown in Figure 1

5 Multi-drug Resistant Acinetobacter baumannii 25 유전종 A. phenon 6/ct 13TU (3주), 그리고유전종 2 (A. baumannii) (6주) 로확인되었다. 2. 항균제내성양상 13종류의항균제를이용하여항균제감수성검사를실시한결과, aminoglycoside 계열중 gentamicin에서총 58주중 56주가내성을나타내어 96.6% 의높은내성율을나타내었으며, carbapenem 계열인 imipenem과 meropenem에는각각 25 주 (43%) 와 21주 (36%) 가내성을나타내었다 (Table 3). 항균제내성양상을유전종별로분류하여보았을때, A. baumannii (40주) 에서는 37주가 10종류이상의항균제에내성을나타낸다약제내성균이었고이중 12주는 imipenem 및 ampicillin/sulbactam에도내성을나타내어 PDRAB로추정되 었다. 40주의 A. baumannii 중 39와 38주가 ciprofloxacin과 ampicillin/sulbactam 항균제에내성을나타낸반면, A. phenon 6/ct 13TU와 Acinetobacter genospecies 3는모두감수성을나타내었다. 3. Metallo-β-lactamase (MBL) 산생균총 58주의 Acinetobacter 균주중항균제감수성검사에서 imipenem에감수성이저하된 36주의균주를대상으로 MBL 산생균검색을시행하였다 (Table 4). 36주중 modified hodge test에서양성으로판독된 25주로 imipenem-edta disk synergy test를시행하였고그결과양성으로판독된 13주를 MBL 산생균으로최종판정하였으며, 13TU와 A. phenon 6/ct 13TU에서각각 5주, Acinetobacter genospecies 3에서 2주, Antibiotics Table 3. Antimicrobial resistance for clinical isolates of Acinetobacter species A. baumannii (n=40) 13TU (n=9) No. of resistant strains A. phenon 6/ct 13TU (n=5) Acinetobacter genospecies 3 (n=4) Total (n=58) piperacillin (84.5%) ticarcillin (79.3%) amikacin (87.9%) gentamicin (96.6%) tobramycin (94.8%) ciprofloxacin (69.0%) tazobactam (69.0%) ceftazidime (84.5%) cefepime (70.7%) aztreonam (74.1%) imipenem (43.0%) meropenem (36.2%) amp/sul a (69.0%) a ampicillin + sulbactam Table 4. Antimicrobial susceptibility to imipenem, modified Hodge test, and detection of metallo-β-lactamases and β-lactamases among clinical isolates of Acinetobacter spp. Species (No. of isolates) Susceptibility to imipenem Positive for Susceptible Intermediate Resistant Hodge DDST VIM-2 IMP-1 PER-1 TEM-1 A. baumannii (40) TU (9) /ct 13TU (5) A. genospecies 3 (4) Total isolates (58)

6 26 임유미, 최태생, 김정민 Table 5. Antimicrobial susceptibilities of β-lactamase or metallo-β-lactamase producing Acinetobacter species MIC a (µg/ml) for isolates Antibiotics bla PER-1 positive (n=13) bla TEM-1 positive (n=27) bla VIM-2 positive (n=8) bla IMP-1 positive (n=5) Range MIC 50 MIC 90 Range MIC 50 MIC 90 Range MIC 50 MIC 90 Range MIC 50 MIC 90 piperacillin 32~ ~>512 >512 >512 32~ ~ amikacin 64~ ~>256 >256 >256 32~ ~ gentamicin >64 >64 >64 >64 >64 >64 32~>64 >64 >64 8~ tobramycin >64 >64 >64 64~>64 >64 >64 32~>64 64 >64 64~>64 >64 >64 ciprofloxacin 0.5~>16 >16 >16 16~>16 >16 >16 <0.25~ <0.25~ amp-sul b 16~ ~> ~ ~ ceftazidime >128 >128 >128 16~>128 >128 >128 16~ ~>128 >128 >128 cefepime >128 >128 >128 16~ ~ ~ aztreonam >128 >128 >128 16~ ~ ~ imipenem 1~ ~ ~ ~ a MIC 50 and MIC 90, MICs (µg/ml) for 50% and 90% of isolates tested, respectively, b ampicillin + sulbactam 그리고 A. baumannii가 1주로확인되었다. MBL 산생균이보유하고있는 MBL 유전자형을알아보고자 PCR을시행한결과, 5주의 A. phenon 6/ct 13TU와 3주의 13TU에서 bla VIM-2 유전자가검출되었고, 2주의 13TU와 2 주의 Acinetobacter genospecies 3 및 1주의 A. baumannii에서 bla IMP-1 유전자가검출되었다. 4. Extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 산생균 Cefepime과 aztreonam 등의 extended-spectrum β-lactam 제에내성을나타낸균주를대상으로 ESBL 유전자를조사하기위해 bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla OXA, bla PER-1 등의유전자에특이적인 primer를사용하여 PCR을시행하였다 (Table 4). 그결과 13주에서 bla PER-1 유전자가검출되었으며, 27주에서 bla TEM 유전자가검출되어염기서열을분석한결과 bla TEM-1 유전자로확인되었다. 13주의 bla PER-1 산생균은 1주의 13TU 를제외하고나머지 12주모두 A. baumannii였고, 27주의 bla TEM-1 산생균또한모두 A. baumannii였다. 2주의 Acinetobacter genospecies 3와 3주의 13TU는 MBL (bla VIM-2, bla IMP-1 ) 유전자와 ESBL 유전자 (bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla OXA, bla PER-1 ) 검사모두에서음성으로나타났다. 5. 보유내성유전자차이에따른 MIC 양상 Acinetobacter 균종의보유내성유전자의차이에따른항균제의내성양상을알아보기위해각항균제의 MIC 50 과 MIC 90 (µg/ml) 값을비교분석하였다 (Table 5). 13주의 bla PER-1 보유 Acinetobacter 균주들은 carbapenem 제제인 imipenem의 MIC 50 과 MIC 90 (µg/ml) 값이 16 µg/ml이었고, 4세대 extended-spectrum cephalosprine 제제인 cefepime 과 monbactam 제제인 aztreonam에도 MIC 50 과 MIC 90 값이 128 µg/ml 이상으로고도내성을나타낸반면, bla VIM-2 와 bla IMP-1 보유 Acinetobacter 균종은 imipenem 의 MIC 50 과 MIC 90 값은모두 16 µg/ml 이상으로내성을나타냈으나 ciprofloxacin과 ampicillin/sulbactam에는감수성을나타내었다. Bla VIM-2 산생균은 cefepime과 aztreonam에대한 MIC 50 값이 16 µg/ ml과 32 µg/ml로중등도의내성을나타낸반면 bla IMP-1 산생균은 64 µg/ml과 128 µg/ml 이상을나타내어, bla IMP-1 산생균이 bla VIM-2 산생균보다 cefepime과 aztreonam에대한내성정도가더욱높은것으로나타났다. 6. Clonal analysis 총 58주의 genomic DNA를 ApaI 제한효소로처리하여 PFGE를시행한결과, 45~500 kb 사이에서 12~16개의 band 가관찰되었다. PFGE 결과를 Gel Compar II software를이용하여유형을분석한결과, 총 40주의 A. baumannii 균종은 5종류의 clone으로구별되었고 (Fig. 2), 5주의 A. phenon 6/ct 13TU는 3종류의 clone으로분류되었다. 9주의 13TU는유전자별로 5종류의 clone으로분류되었고, 4주의 Acinetobacter genospecies 3는서로다른 4종류의 clone으로분류되었다. 12주의 bla PER-1 산생 A. baumannii 균들은동일한 PFGE 양상을나타내어동일 clone에서유래한것으로추정되었다.

7 Multi-drug Resistant Acinetobacter baumannii 27 고 병원환자에서분리되는 Acinetobacter 균종은주로 Vitek GNI card나 MicroScan 또는상업용 kit에의해균종이결정되는데, 위의방법들은표현형적특성및생화학적특성에의한동정법으로거의동일한특성을갖는유전종의동정에는한계가있다 (27). 그래서 Bouvet과 Grimont은분자생물학적특성을이용한 amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) 방법을고안하였고 (5), Acinetobacter 균종의유전종동정에이용되고있다. 본연구에서는병원환자에서분리된균주중 Vitek GNI card를통해 A. baumannii 및 A. calcoaceticus-a. baumannii complex (ACB complex) 로동정된 58주를대상으로 ARDRA 방법을이용한유전종동정을시행하고그결과를비교하였다. Vitek GNI card 검사결과 A. baumannii로동정되었던 47주중 ARDRA 실험결과에서는 34주만이 A. baumannii로동정되어생화학적동정결과와유전종동정결과가일치한경우는 72.3% (34주/47주) 였고, Vitek GNI card에의해 ACB complex로동정되었던 11주중에서도 6주가유전종동정에서 A. baumannii로확인됨으로써생화학적동정결과와유전종동정결과간에상당한차이를나타내었다. 그런데, 흥 찰 bla TEM-1 보유균 bla PER-1 보유균 bla TEM-1 보유균 bla TEM-1 보유균 bla IMP-1 보유균 Figure 2. Dendrogram generated by Gel Compar II software showing the relatedness of Acinetobacter baumannii determined by PFGE. 미롭게도본연구결과에서 Acinetobacter 균주의보유항균제내성유전자와항균제내성양상이 ARDRA 방법에의해결정된유전종에따라뚜렷이구분되는양상을나타내어 Acinetobacter 균종의동정에있어서유전종동정의필요성과중요성을제시하였다. 본연구결과에의하면, MBL (bla VIM-2, bla IMP-1 ) 유전자는주로 A. baumannii가아닌 13TU, A. phenon 6/ct 13TU, 그리고 Acinetobacter genospecies 3에존재하였고, bla PER-1 과 bla TEM-1 유전자는 A. baumannii에서검출되었다. 더욱이 MBL 산생 Acinetobacter spp. 는 imipenem을제외한실험에사용된대부분의항균제에서 A. baumannii에비해낮은내성정도를나타내어 A. baumannii와는뚜렷이구별되는항균제내성양상을나타내었을뿐만아니라 ciprofloxacin과 ampicillin-sulbactam에는감수성을나타낸반면, MBL을생성하지않았던 A. baumannii는 MBL 산생 Acinetobacter에비해다약제내성정도와각종항균제에대한내성정도가훨씬높았다. 지금까지보고된 MBL 산생 Acinetobacter 균종에관한연구를살펴보면대부분이유전종의결정없이 Vitek GNI card나 MicroScan 또는상업용 kit에의존하여 Acinetobacter 균종으로동정된균주를대상으로연구가진행되어있기때문에본연구의결과처럼 MBL 유전자또는 PER-1 유전자가어느특정유전종에서많이검출되는가에대한정보는없다. 본연구가일개대학병원이라는한정된장소및일정기간내에분리된균주를대상으로한결과이기때문에앞으로더욱다양한장소와여러기간내에분리된균주를대상으로보충연구를진행하여 Acinetobacter 균종의유전종결정의유의성을검증해야할것으로생각되나, 상기의유전종에따른항균제내성양상과보유항균제내성유전자의뚜렷한차이는 Acinetobacter 균의균종동정에있어서매우의미있는결과로생각된다. 13주의 MBL 산생균에서 bla VIM-2 유전자또는 bla IMP-1 유전자가검출되었는데, 이러한결과는국내에존재하는 Acinetobacter 균종에 bla VIM-2 유전자와 bla IMP-1 유전자가많이상재해있다는 Lee 등의연구 (16) 결과와유사하다. bla IMP 유전자는대부분일본, 아시아, 및유럽의 P. aeruginosa와 Acinetobacter 균종에서많이보고되고있으며 (12,25), bla VIM 유전자는이태리, 타이완, 프랑스및그리스의 P. aeruginosa 와 Acinetobacter 균종에서많이보고되고있다 (13,27). 이렇게일정한지역및균종에서 MBL 유전자가계속해서보고되고있는것은동일균주에의한감염의확산일가능성이높은것으로사료된다. 그러나본연구에서는 bla IMP-1 및 bla VIM-2 보유 Acinetobacter 균종의 PFGE 양상이다양한것으로보아여러종류의 clone이상재해있는것으로추정되며 MBL 산생균의원내토착화가우려된다. ESBL에속하는 bla PER-1 유전자는 1993년프랑스의 P. aeru-

8 28 임유미, 최태생, 김정민 ginosa에서처음발견되었으며 (24), 이어터키와이태리의 S. enterica Typhimurium 과 A. baumannii에서관찰되었고 (6), P. aeruginosa와 Acinetobacter 균종에서계속보고되고있다 (21, 31). 본연구에서도 13주에서 bla PER-1 유전자가확인되었는데, 흥미롭게도 13TU 1주를제외하고 12주모두가 A. baumannii 였으며, PFGE에서 12주모두동일한양상을나타내어동일균주의확산으로인한원내감염으로사료된다. 뿐만아니라 12주의 bla PER-1 보유 A. baumannii는실험에사용된모든항균제에내성을나타내었는데, MBL을산생하지않음에도불구하고 imipenem에도내성을나타내었으며 ampicillin/sulbactam에도내성을나타내어 PDRAB인것으로생각된다. Yong 등의연구 (34) 에서도 2001년에서 2002년사이국내병원에서분리된 Acinetobacter 균종 97주가운데 cefepime에내성을나타내는 bla PER-1 보유 Acinetobacter 균종이 53주 (54.6%) 인것으로나타나국내병원환경에존재하는 Acinetobacter 균종에 bla PER-1 유전자가널리확산되어있음을보고하였는데, 이연구에서는 bla PER-1 보유균이 ceftazidime, cefepime, cefotaxime, 그리고 aztreonam에내성을나타내고있음은확인하였으나다른항균제에대한감수성검사를시행하지않아 bla PER-1 보유균이본연구결과에서처럼 PDRAB인지는알수없다. PDRAB에대한최초의보고는 1998년 5월 Taiwan 의한병원에서분리된 A. baumannii로 ceftazidime, cefepime, ticarcillin-clavulanate, piperacillin-tazobactam, aztreonam, imipenem, meropenem, gentamicin, amikacin, ofloxacin, 및 ciprofloxacin에내성을나타내어 PDRAB로명명되었고, 동일병원의 1999년 1월에서 2000년 4월사이에분리된 Acinetobacter 균주가운데 6.5% 가 PDRAB인것으로보고되었다 (11). 이상의결과를요약하면일개대학병원에서분리된 Acinetobacter 균종중 ESBL (bla PER-1 ) 유전자는대부분 A. baumannii에서검출되었고, MBL (bla IMP-1, bla VIM-2 ) 유전자는대부분유전종 13TU, A. phenon 6/ct 13TU, 그리고 Acinetobacter genospecies 3에서검출되었다. 12주의 bla PER-1 산생 A. baumannii는 imipenem을포함한 13종의항균제에내성을나타내는 pandrug-resistant A. baumannii (PDRAB) 인것으로생각되며, PFGE 양상이동일한것으로나타나동일유래균주의확산으로인한원내감염으로추정된다. MBL 산생균은다양한종류의 clone이존재하는것으로보아 MBL 산생 Acinetobacter 균주의원내토착화가능성이우려된다. 감사의글본연구는 2005년경북대학교의과대학신진교수연구비지원결과임. 참고문헌 1) Aubert G, Guichard D, Vedel G: In vitro activity of cephalosporins alone and combinated with different antibiotic resistance profiles. J Antimicrob Chemother 37: , ) Bergogne-Bérézin E, Joly-Guillou M, Vieu JF: Epidemiology of nosocomial infection due to Acinetobacter calcoaceticus. J Hosp Infect 10: , ) Bergogne-Bérézin E, Towner KJ: Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features. Clin Microbiol Rev 9: , ) Bouvet PJ, Grimont PA: Taxonomy of the Genus Acinetobacter with the Recognition of Acinetobacter baumannii sp. nov., Acinetobacter haemolyticus sp. nov., Acinetobacter johnsonii sp. nov., Acinetobacter junii sp. nov., and Emended descriptions of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter lwoffii. Int J Bacteriol 36: , ) Bouvet PJ, Jeanjean S: Delineation of new proteolytic genomic species in the genus Acinetobacter. Res Microbiol 140: , ) Bradford PA: Extended-spectrum β-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology therapy, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 14: , ) Carr EL, Kampfer P, Patel BK, Gurtler V, Seviour RJ: Seven novel species of Acinetobacter isolated from activated sludge. Int J Syst Evol Microbiol 53: , ) Corbella X, Montero A, Pujol M, Domiguez MA, Ayats J, Argerich MJ, Garrigosa F, Ariza J, Gudiol F: Emergence and rapid spread of carbapenem resistance during a large and sustained hospital outbreak of multiresistant Acinetobacter baumannii. J Clin Microbiol 38: , ) Gautom RK: Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing of Escherichia coli O157:H7 and other gramnegative organisms in 1 day. J Clin Microbiol 35: , ) Gerner-Smidt P, Tjernberg I: Acinetobacter in Denmark. II. Molecular studies of the Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 101: , ) Hsueh PR, Teng LJ, Chen CY, Chen WH, Yu CJ, Ho SW, Luh KT: Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerg

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