A. baumannii 와 P. aeruginosa 의 ESBL 생성현황 15 인하여광범위 -lactam 제제일부를포함한여러항균제에내재적내성이지만, ceftazidime, piperacillin, ticarcillin 등은이들세균에비교적강한항균력을지닌다 [3]. Cla

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1 대한진단검사의학회지제 26 권제 1 호 2006 Korean J Lab Med 2006;26:14-20 원저 임상미생물학 임상검체에서분리된 Acinetobacter baumannii와 Pseudomonas aeruginosa의 Class A Extended-Spectrum -Lactamase 생성현황 오세진 이상욱 황현용 1 배일권 1 조현수 1 이병호 1 정석훈 1 고신대학교의과대학내과학교실, 진단검사의학교실 1 Prevalence of Class A Extended-Spectrum -Lactamases in Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa Se Jin Oh, M.D., Sang Uk Lee, M.D., Hyun Yong Hwang, M.D. 1, Il Kwon Bae, M.D. 1, Hyun Soo Jo, M.D. 1, Byung Ho Lee, M.D. 1, and Seok Hoon Jeong, M.D. 1 Departments of Internal Medicine and Laboratory Medicine 1, Kosin University College of Medicine, Busan, Korea Background : Prevalence of class A extended-spectrum -lactamases (ESBLs) has been investigated repeatedly in members of family Enterobacteriaceae in Korea, but only rarely in Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. The aims of this study were to determine the prevalence of class A ESBL-producing A. baumannii and P. aeruginosa and to characterize the genotypes. Methods : During the period of June to September 2004, clinical isolates of A. baumannii and P. aeruginosa were collected from patients in Kosin University Gospel Hospital, Busan, Korea. Antimicrobial susceptibility was determined by the disk diffusion and the agar dilution methods, and ESBLproduction by the double-disk synergy test. Transferability of ceftazidime-resistance of ESBL-producers were tested by conjugation. The isoelectric points of ESBLs were determined by isoelectric focusing. Searches for bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla PER-1, bla VEB, and bla GES/IBC genes were performed by PCR amplification, and the genotypes of ESBLs were determined by a direct nucleotide sequence analysis of the amplified products. Results : A total of 58 clinical isolates of A. baumannii and 77 P. aeruginosa were collected. Three (5.2%) isolates of A. baumannii and four (5.2%) P. aeruginosa isolates showed positive results in the double-disk synergy test using ceftazidime and imipenem disks, and one (1.7%) A. baumannii and two (2.6%) P. aeruginosa isolates showed positive results in that test using ceftazidime and cefoxitin disks. The most prevalent class A ESBL genotype in A. baumannii isolates was blaper-1 (n=6), and bla SHV-12 gene was also found in one P. aeruginosa isolate. Conclusions : It is concluded that class A PER-1 ESBL-producing A. baumannii isolates are spreading, and SHV-12-producing P. aeruginosa has emerged in Korea. The spread of class A ESBLs could compromise the future usefulness of expanded-spectrum -lactam antibiotics for the treatment of A. baumannii and P. aeruginosa infections. (Korean J Lab Med 2006;26:14-20) Key Words : Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Class A ESBL 접수 : 2005년 9월 22일접수번호 : KJLM1885 수정본접수 : 2006년 1월 6일게재승인일 : 2006년 1월 13일교신저자 : 정석훈우 부산광역시서구암남동 34 고신대학교복음병원진단검사의학과전화 : , Fax: kscpjsh@ns.kosinmed.or.kr 서론 Acinetobacter baumannii와 Pseudomonas aeruginosa는병원감염의중요원인균이다. 이들포도당비발효그람음성간균은특징적인세포외막 porin[1] 과염색체성 -lactamase 생성 [2] 으로 14

2 A. baumannii 와 P. aeruginosa 의 ESBL 생성현황 15 인하여광범위 -lactam 제제일부를포함한여러항균제에내재적내성이지만, ceftazidime, piperacillin, ticarcillin 등은이들세균에비교적강한항균력을지닌다 [3]. Class A의 extendedspectrum -lactamase (ESBL) 는이들항균제에대한내성을부여하므로 ESBL을생성하는 A. baumannii나 P. aeruginosa의확산은임상적으로심각한위협이된다 [4]. 장내세균과의세균들은 TEM형및 SHV형 ESBL을흔히생성하지만 A. baumannii나 P. aeruginosa는이들효소를드물게생성하는것으로알려졌다 [5]. 프랑스에서분리되는 P. aeruginosa의 1.9% 만이 TEM형효소를생성한다고하며 [6], TEM-4, TEM-21, TEM-24 및 TEM-42를생성하는 P. aeruginosa가보고되었다 [7-10]. SHV형효소를생산하는 P. aeruginosa가프랑스 [11] 및태국 [12] 에서, SHV-12를생성하는 A. baumannii 가중국 [13] 에서각각보고되었으나, 국내에서분리되는 A. baumannii나 P. aeruginosa의 TEM형혹은 SHV형 ESBL 생성현황에관한보고는아직없다. PER-1은 1993년에 P. aeruginosa에서검출되었으며 [14], 터어키및이태리에서이효소를생산하는 Acinetobacter와 P. aeruginosa가보고되었다 [15, 16]. Yong 등 [17] 과김등 [18] 은 PER-1 을생성하는 Acinetobacter를보고하였으나, 이효소를생성하는 P. aeruginosa는아직국내에서보고된바없다. VEB-1은 1999 년프랑스의병원에입원한베트남환자의검체에서분리된 Escherichia coli에서처음검출되었고 [19], 국내에서는 VEB-1 생성 Proteus mirabilis에의한감염의집단발생이보고된바있으나 [20], 이효소를생성하는 A. baumannii나 P. aeruginosa는아직보고된바없다. GES형 ESBL의경우 GES-1은 2000년프랑스에서분리된 Klebsiella pneumoniae, GES-2는남아프리카공화국에서분리된 P. aeruginosa, GES-3와 GES-4는 2004년일본에서분리된 K. pneumoniae에서처음검출되었다 [21-24]. 국내에서분리되는 E. coli나 K. pneumoniae의 class A ESBL 생성현황에대해서는여러차례조사가있었지만, A. baumannii 나 P. aeruginosa의이들효소생성현황에대한조사는매우드물다. 본연구에서는부산의한삼차병원에서분리된 A. baumannii와 P. aeruginosa를대상으로 TEM, SHV, PER, GES, VEB, IBC 등 class A의 ESBL 생성현황을조사하며, 이들세균이지닌 ESBL의유전형을규명고자하였다. 주의균종은전통적인생화학적방법및 Vitek GNI card (bio-.. Merieux Vitek Inc., Hazelwood, Mo., USA) 로확인하였다. 2. 항균제감수성시험미국의 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) 의기준에따라서 ampicillin, ampicillin-sulbactam, piperacillin, piperacillin-tazobactam, cefoxitin, cefotetan, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, aztreonam, imipenem, meropenem, amikacin, gentamicin, tobramycin, ciprofloxacin, trimethoprimsulfamethoxazole 및 tetracycline (BBL, Cockeysville, Mich., USA) 에대한감수성을디스크확산법 [25] 으로확인하였다. 항균제의최소억제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 는 NCCLS 한천희석법 [26] 으로측정하였다. 시험항균제로는 piperacillin ( 유한, 군포 ), piperacillin-tazobactam ( 한국와이어스, 서울 ), ceftazidime ( 한미, 화성 ), ceftazidime-clavulanic acid, cefotaxime ( 한독, 서울 ), cefotaxime-clavulanic acid 및 cefepime ( 보령, 안산 ) 을사용하였다. Clavulanic acid의농도는 4 g/ml 로고정하였다. E. coli ATCC 25933을표준균주로사용하였다. 3. ESBL 생성균주선별 Double-disk synergy 법으로 class A ESBL 생성하는균주를선별하였다 [5]. 세균부유액을면봉으로 Mueller-Hinton 한천 (Difco, Cockeysville, Mich., USA) 에고르게접종한후, 배지의중앙에는 ceftazidime 30 g 디스크, 주위에는 amoxicillin-clavulanic acid (20/10 g), imipenem (30 g) 및 cefoxitin (30 g, BBL) 디스크를놓았다. 중앙과주변디스크의가장자리간격은 1.5 cm 가되게하였다. GES/IBC, PER, VEB 등일부 non-tem, non-shv ESBL은 clavulanic acid뿐아니라 cefoxitin 혹은 imipenem에의해서활성이억제되기때문데이들디스크모두를사용하였다. 세균이접종된배지는 37 항온기에 18시간배양후결과를판독하였는데, 두디스크사이에서상승효과에의한억제대의확장현상이관찰되면양성으로판정하였다 (Fig. 1). 4. 접합에의한내성전달 재료및방법 1. 균주의수집 2004년 6-9월에고신대학교복음병원환자의임상검체에서분리된 A. baumannii와 P. aeruginosa를대상으로하였다. 항균제내성에상관없이분리된순서대로균주를수집하였으며, 동일환자에서반복분리된균주는수집대상에서제외하였다. 분리된균 Filter mating 법 [27] 으로시험하였으며, azide 내성인 A. baumannii YMC02/8/P534[17] 혹은 P. aeruginosa PA04089Rp[28] 을내성수여자로사용하였다. 내성공여자와수여자를각각 brain heart infusion (Difco) 액체배지에접종하여서 3시간진탕배양하였다. 공여자배양액 0.2 ml와수여자배양액 2.2 ml를시험관에넣어서 37 로 1시간배양후, ceftazidime 8 g/ml와 azide 100 g/ml가함유된 MacConkey 한천에접종하였다. 37 에서 18시간배양후 transconjugant를선별하였다. 내성전달의확인을위해서 transconjugant의 ceftazidime에대한감수성을디스크

3 16 오세진 이상욱 황현용외 4 인 확산법으로확인하였다. 붉은색의 band 를관찰하여 -lactamase 의 pi 를확인하였다. 5. Isoelectric focusing (IEF) 에의한등전점 (pi) 측정 세균추출액 10 L와동량의 sample buffer (TEFCO Corporation, Tokyo, Japan) 를섞어 agarose gel (ph 3-10, TEFCO Corporation) 에 100 V로 1시간, 200 V로 1시간및 300 V로 40 분간전기영동하였다. Nitrocefin (Oxoid, Hampshire, England) 에적신여과지로 gel을덮고 20초간염색하였다. Gel에나타난 Table 1. Antimicrobial susceptibilities of A. baumannii and P. aeruginosa isolates % Susceptibility Antimicrobial agents A. baumannii (n=58) P. aeruginosa (n=77) Intermediate Resistant Intermediate Resistant Ampicillin ND ND Ampicillin-sulbactam ND ND Piperacillin Piperacillin-tazobactam Cefoxitin ND ND Cefotetan ND ND Ceftazidime Cefotaxime Cefepime Aztreonam Imipenem Meropenem Amikacin Gentamicin Tobramycin Ciprofloxacin ND ND Trimethoprim ND ND sulfamethoxazole Tetracycline ND ND Abbreviations: ND, not done. 6. 분자생물학적방법에의한내성유전형확인 PCR로 class A ESBL의유전형을시험하였다. Ryoo 등 [29] 이고안한 primer로 TEM, SHV, CTX-M, PER, GES/IBC 및 VEB형 -lactamase 유전자를검출하기위한시험을하였다. 시험세균으로 PCR 반응액을만든후 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer Centus Corp., Norwalk, Ct., USA) 으로 94 로 30초간 denaturation, 58 로 1분간 annealing, 72 로1 분간 extension하는 30 cycle의 PCR를시행하여증폭산물의 band 를확인하고, PCR 증폭산물을추출하여서 Sequenase Version 2.0 DNA sequencing kit (U.S. Biochemicals, Cleveland, Oh., USA) 를이용하여양방향으로염기서열을분석하였다 [30]. 결과 1. 항균제감수성양상시험기간중총 58주의 A. baumannii와 77주의 P. aeruginosa 가환자의임상검체에서검출되었다. A. baumannii의 piperacillin, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, aztreonam, imipenem 및 meropenem에대한내성율은각각 24.6%, 25.8%, 32.7%, 22.4%, 67.2%, 24.1% 및 24.1% 였으며, P. aeruginosa의이들항균제에대한내성률은각각 39.0%, 29.9%, 58.7%, 26.0%, 29.9%, 31.2% 및 40.3% 이었다 (Table 1). 2. Double-disk synergy 시험및접합에의한내성전달 A. baumannii 3주 (5.2%) 와 P. aeruginosa 4주 (5.2%) 는 imi- Table 2. Characteristics of double-disk synergy-positive A. baumannii and P. aeruginosa isolates DDS (+) with Isolate Species Specimen MICs ( g/ml) PIP TZP CAZ CAZ/CLA* FEP Imipenem disk K20653 A. baumannii Sputum K22565 A. baumannii Sputum K22898 A. baumannii Urine K18885 P. aeruginosa Urine K19135 P. aeruginosa Urine K24002 P. aeruginosa Urine K24857 P. aeruginosa Pus >256 > Cefoxitin disk K24931 A. baumannii Sputum K23180 P. aeruginosa Sputum K23413 P. aeruginosa Sputum *clavulanic acid at a fixed concentration of 4 g/ml. Abbreviations: DDS (+), double-disk synergy-positive; PIP, piperacillin; TZP, piperacillin-tazobactam; CAZ, ceftazidime; CAZ/CLA, ceftazidime-clavulanic acid; FEP, cefepime.

4 A. baumannii 와 P. aeruginosa 의 ESBL 생성현황 17 penem 과 ceftazidime 디스크사이에 synergy 현상을보였으며, A. baumannii 1주 (1.7%) 와 P. aeruginosa 2주 (2.6%) 는 cefoxitin과 ceftazidime 디스크사이에 synergy 현상을보였다. Amoxicillin-clavulanic acid 와 ceftazidime 디스크사이에 synergy를보인균주는없었다 (Table 2, Fig. 1). 대상균주중 A. baumannii와 P. aeruginosa 각 1주의 ceftazidime 내성이 recipient에게로전달되었다. 3. Class A ESBL 유전형 bla TEM 유전자검출을위한 PCR에는 A. baumannii 21주 (36.2 %) 와 P. aeruginosa 7주 (9.1%), bla SHV 유전자검출을위한 PCR 에는 P. aeruginosa 1주 (1.3%), bla PER-1 유전자검출을위한 PCR 에는 A. baumannii 6주 (10.3%) 가양성반응을보였다. bla GES 혹은 bla VEB 유전자검출을위한 PCR 에대상균주모두음성반응을보 였다. Double-disk synergy 양성인균주중 K22898에서만 TEM- 116이검출되었을뿐, 다른균주에서는 class A -lactamase 유전자가검출되지않았다. 대상균주중 A. baumannii 13주와 P. aeruginosa 3주의 bla TEM 유전자증폭산물은 bla TEM-1 유전자의 84번째아미노산 valine (gtt) 이 isoleucine (att), 184번째아미노산 alanine (gca) 이 valine Fig. 1. An example of double disk synergy obtained with an A. baumannii isolate producing Ambler class A extended-spectrum -lactamase. Two 30 g-antibiotics disks (left, imipenem; right, cefoxitin) were placed 1.5 cm apart (margin to margin) around a disk containing 30 g of ceftazidime. (gta) 으로각각치환된 bla TEM-116 유전자였으며 (Table 3), A. baumannii 8주와 P. aeruginosa 4주의증폭산물은 bla TEM-1 유전자의염기서열과일치하였다. P. aeruginosa K19204에서검출된 bla SHV 유전자증폭산물의염기서열은 bla SHV-1 유전자의 35 번째아미노산 leucine (cta) 이 glutamine (caa), 238번째아미노산 glycine (ggc) 이 serine (agc), 240번째아미노산 glutamic acid (gag) 이 lysine (aag) 로각각치환된 bla SHV-12 유전자와일치하였다. A. baumannii 6주에서검출된 bla PER-1 유전자증폭산물은 bla PER-1 유전자와염기서열이일치하였다. IEF를통하여 TEM-116, SHV-12 및 PER-1에해당하는 pi 5.4, 8.2 및 5.3의 band를확인할수있었다. 4. Class A ESBL 생성균주에대한항균제 MIC 특성 bla PER-1 유전자를지닌 A. baumannii 6 주중 5 주에대한 pi- Table 3. Characteristics of TEM-116-producing A. baumannii and P. aeruginosa isolates Isolate Species Specimen MICs ( g/ml) CAZ/ PIP TZP CAZ FEP CLA* K21919 A. baumannii Sputum K22538 A. baumannii Bile K22615 A. baumannii Sputum > K22709 A. baumannii Sputum K22899 A. baumannii Urine K22842 A. baumannii Sputum K23145 A. baumannii Sputum K23308 A. baumannii Sputum K23499 A. baumannii Sputum K18396 A. baumannii Pus > > K18480 A. baumannii Sputum > > K18843 A. baumannii Bile K19583 A. baumannii Sputum > >256 > K25430 P. aeruginosa Sputum K24686 P. aeruginosa Urine > >256 K19204 P. aeruginosa Pus > >256 *clavulanic acid at a fixed concentration of 4 g/ml. Table 4. Characteristics of SHV-12 or PER-1-producing A. baumannii and P. aeruginosa isolates Genotype Isolate Species Specimen Underlying disease Prognosis MICs ( g/ml) PIP TZP CAZ CAZ/CLA* FEP blashv-12 K19204 P. aeruginosa Pus Rectal cancer Improved > >256 blaper-1 KB2660 A. baumannii Blood Bronchogenic cancer Improved KB2919 A. baumannii Blood Stomach cancer Expired K20936 A. baumannii Sputum Pulmonary tuberculosis Improved K21866 A. baumannii Sputum Stomach cancer Improved K23417 A. baumannii Sputum Epidural hemorrhage Improved K20039 A. baumannii Sputum Paroxysmal supraventricular Improved > >256 >256 >256 tachycardia *clavulanic acid at a fixed concentration of 4 g/ml. Abbreviations: PIP, piperacillin; TZP, piperacillin-tazobactam; CAZ, ceftazidime; CAZ/CLA, ceftazidime-clavulanic acid; FEP, cefepime.

5 18 오세진 이상욱 황현용외 4 인 peracillin, ceftazidime 및 cefepime의 MIC는각각 16 g/ml, 4-8 g/ml 및 4-8 g/ml로유사한분포를보였으나, 1주 (K20039) 에대한이들항균제의 MIC는각 256 g/ml 이상으로높았다. bla SHV-12 유전자를지닌 P. aeruginosa K19204에대한이들광범위항균제의 MIC는각각 >256, 32, 및 >256 g/ ml였다 (Table 4). 고찰시험기간중분리된 A. baumannii의 ceftazidime, cefotaxime, cefepime 및 aztreonam에대한내성률은각각 25.8%, 32.7%, 22.4% 및 67.2% 로 2003년전국 12개병원을대상으로한내성률조사 [31] 의 58%, 73%, 55% 및 81% 보다낮은분포를보였다. 다만 imipenem에대한내성률은 24.1% 로 2003년조사의 23% 와비슷한분포를보였다. 한편본연구의 P. aeruginosa의 ceftazidime, cefotaxime, cefepime, aztreonam 및 imipenem에대한내성율은각각 29.9%, 58.7%, 26.0%, 29.9% 및 31.2% 로 2003 년조사의 21%, 76%, 25%, 33% 및 25% 와유사한분포를보였다. PER-1은국내에서분리되는 A. baumannii가 cefepime에대한내성을획득하는중요한기전중하나로알려졌으며, 서울의한종합병원에서분리된 cefepime 내성 A. baumannii 중 86.9% (53/61) 가이효소를생성하였다고한다 [17]. 본연구에서는 PER- 1을생성하는 A. baumannii가 6주만이분리되어서고신대학교복음병원에서는이내성균주가확산되는초기임을추측할수있었다. 본연구에서분리된 PER-1 생성 A. baumannii 6주중 5 주에대한광범위 -lactam 항균제의 MIC는비교적낮은분포를보였으나, 1주 (K20039) 에대한 MIC는대단히높아서이세균이다른내성기전을지니고있음을시사하였고, 추가적인실험을통하여이균주는 class B metallo- -lactamase의일종인 VIM-2 를생성함을확인할수있었다 (data not shown). 터어키등지에서는 PER-1을생성하는 P. aeruginosa가분리되었으나국내에서는아직분리된바없으며 [15], 본연구에서도이세균의분리를시도하였으나검출되지않았다. P. aeruginosa나 A. baumannii가 TEM형혹은 SHV형 ESBL 을생성하는경우는드문것으로알려졌는데, 이는이들세균이광범위 -lactam 항균제에대한내성을획득하는데 plasmid성 TEM 혹은 SHV형 ESBL을생성하는것보다탈억제에의해서염색체성 cephalosporinase를과량생성하는것이더손쉬운방법이고 [6], 또한이들세균이 class B의 IMP 혹은 VIM형 metallo- -lactamase[32] 나 class D의 OXA형 ESBL[33, 34] 을흔히생성하기때문에 TEM 혹은 SHV형 ESBL의필요성이장내세균에비해상대적으로낮기때문인것으로추측한다. 본연구에서도 TEM형 ESBL은검출되지않았으며, SHV-12를생성하는 P. aeruginosa 1주만이검출되었다. 저자등은총 16주에서검출 된 TEM-116을 ESBL로간주하지않았는데 [35], 이는본연구진이시행한타실험에서 bla TEM-116 유전자 transformant 5주에대한 ceftazidime, cefotaxime 및 aztreonam의 MIC가모두 g/ml로낮아서 TEM-116이이들광범위 -lactam 항균제에대한내성을제공한다는증거를찾을수없었기때문이다 (data not shown). 향후 TEM-116의기질특이성에대한추가적인연구가필요할것이다. SHV-12는스위스에서분리된 E. coli와 K. pneumoniae에서처음검출되었다 [36]. 이효소는 SHV-1의아미노산 3개가치환된 (Leu35Gln, Gly238Ser 및 Glu240Lys) 것이며, SHV-2a 혹은 SHV-5와는각각아미노산 1개 (Glu240Lys 및 Leu35Gln) 의차이가있다. 이효소는국내에서분리되는장내세균이흔히생성하는것으로알려졌으며 [37], 국내에서이효소를생성하는 P. aeruginosa가분리된것은본연구가처음이다. 이효소는 ceftazidime에강한활성을지니고있으며, P. aeruginosa K19204에대한 ceftazidime의 MIC도 32 g/ml로비교적높았다. SHV-12 는 clavulanic acid에의하여활성이억제되는특성이있으나 P. aeruginosa K19204에대한 ceftazidime-clavulanic acid의 MIC 는 64 g/ml로 ceftazidime에비해서오히려높았는데, 이는 clavulanic acid의유도능에의하여이균주의염색체성 cephalosporinase가과량생성된때문으로추측한다. Double-disk synergy 시험은장내세균이생성하는 ESBL의검출에유용한검사법으로널리사용되고있다 [5]. 본연구에서 A. baumannii 3주 (5.2%) 와 P. aeruginosa 4주 (5.2%) 는 imipenem 디스크와 ceftazidime 디스크사이에 synergy 현상을보였으며, A. baumannii 1주 (1.7%) 와 P. aeruginosa 2주 (2.6%) 는 cefoxitin 디스크와 ceftazidime 디스크사이에 synergy 현상을보였다. Class A ESBL 중 PER형과 VEB형효소는 imipenem 과 cefoxitin, GES형과 IBC형효소는 imipenem에의해서활성이억제되는것으로알려졌다 [7]. 따라서 double-disk synergy 양성을보인이들균주에서이들 class A ESBL을검출할수있을것으로기대하였으나본연구에서는검출에실패하였으며, 다만 ceftazidime과 imipenem 디스크사이에억제대의상승효과를보인 P. aeruginosa K18885와 K24857에서 OXA-7과유사한유전자를검출할수있었다 (data not shown). 이들효소의존재를규명하기위한추가적연구가필요한것으로생각한다. 이상의결과에서부산의한대학병원에서분리되는 A. baumannii 중가장흔한 class A ESBL은 PER-1이며, SHV-12를생성하는 P. aeruginosa의존재도증명하였다. 이들 ESBL 생성균주의확산은광범위 -lactam 항균제임상적효용성을제한할것으로우려된다. 요약배경 : 국내에서분리되는 Escherichia coli나 Klebsiella pneu-

6 A. baumannii 와 P. aeruginosa 의 ESBL 생성현황 19 moniae의 class A extended-spectrum -lactamase (ESBL) 생성현황에대해서는여러차례조사가있었지만, Acinetobacter baumannii나 Pseudomonas aeruginosa의이들효소생성현황에대한조사는매우드물다. 본연구에서는부산의한대학병원에서분리된 A. baumannii와 P. aeruginosa를대상으로 TEM, SHV, PER, VEB, GES/IBC 등 class A의 ESBL 생성현황을조사하며, ESBL의유전형을규명고자하였다. 방법 : 2004년 6-9월에고신대학교복음병원환자의임상검체에서분리된 A. baumannii와 P. aeruginosa를대상으로하였다. 항균제감수성은디스크확산법과한천희석법으로시험하였고, ESBL 생성은 double-disk synergy 시험으로확인하였다. Ceftazidime 내성전달성은접합으로시험하였다. Isoelectric focusing으로 -lactamase의 pi값을측정하였으며중합연쇄반응으로 TEM형, SHV형, CTX-M형, PER-1형, VEB형, IBC형및 GES 형효소의유전자를검출하였고, 중합연쇄반응산물의염기서열을양방향으로분석하였다. 결과 : 시험기간중총 58주의 A. baumannii와 77주의 P. aeruginosa가환자의임상검체에서검출되었다. A. baumannii 3주 (5.2%) 와 P. aeruginosa 4주 (5.2%) 는 imipenem 디스크와 ceftazidime 디스크사이에 synergy 현상을보였으며, A. baumannii 1주 (1.7%) 와 P. aeruginosa 2주 (2.6%) 는 cefoxitin 디스크와 ceftazidime 디스크사이에 synergy 현상을보였다. 대상균주중 A. baumannii 6주는 bla PER-1 유전자를지니고있었으며, bla SHV-12 유전자를지닌 P. aeruginosa 1주및 bla TEM-116 유전자를지닌 A. baumannii 13주와 P. aeruginosa 3주도검출되었다. 결론 : 이상의결과에서부산의한대학병원에서분리되는 A. baumannii 중가장흔한 class A ESBL은 PER-1이며, SHV- 12를생성하는 P. aeruginosa의존재도증명하였다. 이들 ESBL 생성 A. baumannii와 P. aeruginosa 균주의확산은향후광범위 -lactam 항균제임상적효용성을제한할것으로우려된다. 참고문헌 1. Satake S, Yoshihara E, Nakae T. Diffusion of -lactam antibiotics through liposome membranes reconstituted from purified porins of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1990;34: Livermore DM. Interplay of impermeability and chromosomal - lactamase activity in imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1992;36: Chamberland S, L'Ecuyer J, Lessard C, Bernier M, Provencher P, Bergeron MG. Antibiotic susceptibility profiles of 941 gram-negative bacteria isolated from septicemic patients throughout Canada. The Canadian Study Group. Clin Infect Dis 1992;15: Medeiros AA. Evolution and dissemination of -lactamases accelerated by generations of -lactam antibiotics. Clin Infect Dis 1997;24 (S 1):S Weldhagen GF, Poirel L, Nordmann P. Ambler class A extendedspectrum -lactamases in Pseudomonas aeruginosa: novel developments and clinical impact. Antimicrob Agents Chemother 2003;47: Bert F, Branger C, Lambert-Zechovsky N. Identification of PSE and OXA -lactamase genes in Pseudomonas aeruginosa using PCR-restriction fragment length polymorphism. J Antimicrob Chemother 2002; 50: Mugnier P, Dubrous P, Casin I, Arlet G, Collatz E. A TEM-derived extended-spectrum -lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1996;40: Poirel L, Ronco E, Naas T, Nordmann P. Extended-spectrum -lactamase TEM-4 in Pseudomonas aeruginosa. Clin Microbiol Infect 1999; 5: Dubois V, Arpin C, Noury P, Quentin C. Clinical strain of Pseudomonas aeruginosa carrying a bla(tem-21) gene located on a chromosomal interrupted TnA type transposon. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: Marchandin H, Jean-Pierre H, De Champs C, Sirot D, Darbas H, Perigault PF, et al. Production of a TEM-24 plasmid-mediated extended-spectrum -lactamase by a clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2000;44: Naas T, Philippon L, Poirel L, Ronco E, Nordmann P. An SHV-derived extended-spectrum -lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1999;43: Chanawong A, M'Zali FH, Heritage J, Lulitanond A, Hawkey PM. SHV-12, SHV-5, SHV-2a and VEB-1 extended-spectrum -lactamases in gram-negative bacteria isolated in a university hospital in Thailand. J Antimicrob Chemother 2001;48: Huang ZM, Mao PH, Chen Y, Wu L, Wu J. Study on the molecular epidemiology of SHV type beta-lactamase-encoding genes of multiple-drug-resistant Acinetobacter baumannii. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi 2004;25: Nordmann P, Ronco E, Naas T, Duport C, Michel-Briand Y, Labia R. Characterization of a novel extended-spectrum -lactamase from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1993;37: Vahaboglu H, Ozturk R, Aygun G, Coskunkan F, Yaman A, Kaygusuz A, et al. Widespread detection of PER-1-type extended-spectrum -lactamases among nosocomial Acinetobacter and Pseudomonas aeruginosa isolates in Turkey: a nationwide multicenter study. Antimicrob Agents Chemother 1997;41: Luzzaro F, Mantengoli E, Perilli M, Lombardi G, Orlandi V, Orsatti A, et al. Dynamics of a nosocomial outbreak of multidrug-resistant

7 20 오세진 이상욱 황현용외 4 인 Pseudomonas aeruginosa producing the PER-1 extended-spectrum - lactamase. J Clin Microbiol 2001;39: Yong D, Shin JH, Kim S, Lim Y, Yum JH, Lee K, et al. High prevalence of PER-1 extended-spectrum -lactamase-producing Acinetobacter spp. in Korea. Antimicrob Agents Chemother 2003;47: Kim JM, Kang HK, Jeong SH, Bae IK, Kwon SB, Cho BK, et al. Prevalence of PER-1 Extended-Spectrum -Lactamase-Producing Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii in a University Hospital, Busan, Korea. Korean J Clin Microbiol 2004;7:20-6. ( 김정만, 강현경, 정석훈, 배일권, 권수봉, 조병규등. 부산의한대학병원에서분리된Acinetobacter baumannii의 PER-1 extended-spectrum -lactamase 생성현황. 대한임상미생물학회지 2004;7:20-6.) 19. Poirel L, Naas T, Guibert M, Chaibi EB, Labia R, Nordmann P. Molecular and biochemical characterization of VEB-1, a novel class A extended-spectrum -lactamase encoded by an Escherichia coli integron gene. Antimicrob Agents Chemother 1999;43: Kim JY, Park YJ, Kim SI, Kang MW, Lee SO, Lee KY. 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