February 2007

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1 November 2009 Vol. 17 No. 4 Ser. No. 67 Quarterly ISSN Antimicrobial resistance of bacteria isolated during July to September in 2009 at a KONSAR program participating hospital Antimicrobial resistance rates which were tested by the CLSI disk diffusion test and did not include intermediate categories are shown in Tables 1 to 3. The resistance rates of staphylococci, enterococci, and gram-negative bacilli except C. freundii, E. aerogenes, S. marcescens and A. baumannii were not significantly different from those in the previous period (April to June). Resistance rates of C. freundii, E. aerogenes, and S. marcescens to 3rd generation cephalosporins decreased by 8-21%. Decreased resistance rates of A. baumannii observed were: to cefoperazone-sulbactam by 13%, to amikacin by 7%, and to fluoroquinolone by 7%. Proportion of prevalent organism-antimicrobial agent combinations, excluding multiple isolates, were: extended-spectrum cephalosporin-resistant K. pneumoniae 31%, cefoxitin-resistant K. pneumoniae 24%, imipenem-resistant A. baumannii and P. aeruginosa 56% and 29%, respectively, fluoroquinolone-resistant E. coli, Acinetobacter spp. and P. aeruginosa 36%, 61%, and 33%, respectively, methicillin-resistant S. aureus by cefoxitin disk test 60%, and vancomycin-resistant E. faecium 29%. Table 1. Antimicrobial resistance rates (%) of frequently isolated gram-negative bacilli a Antimicrobial agents ECO KPN KOX CFR ECL EAE SMA PMI PVU MMO ACI SMP (1526/1126) (810/537) (91/80) (120/107) (224/184) (175/124) (133/95) (89/72) (25/20) (87/70) (721/328) (250/160) Ampicillin 73/70 99/98 99/99 96/95 98/97 97/96 98/98 44/40 96/95 100/100 97/93 99/98 Ampicillin-Sulbactam 31/26 50/39 20/18 44/43 66/63 55/45 89/86 17/15 12/10 63/57 75/57 92/90 Piperacillin 68/64 62/53 32/30 44/43 40/39 47/37 36/33 22/18 8/5 28/20 83/70 85/82 Cephalothin 62/58 56/45 37/36 100/ /99 99/98 100/100 26/22 96/95 100/ /99 100/100 Cefotaxime 23/17 29/21 4/5 30/32 38/34 33/28 26/22 10/10 4/0 10/60 81/65 85/83 Ceftazidime 10/70 43/31 4/4 38/38 38/35 39/30 5/6 1/1 4/5 14/70 79/63 40/36 Cefepime 11/80 11/80 0/0 2/2 4/2 1/2 5/5 3/3 0/0 0/0 78/62 56/52 Cefoperazone-Sulbactam 2/2 7/5 10/80 7/7 10/10 3/4 8/7 0/0 0/0 0/0 59/47 32/28 Cefoxitin 7/6 31/24 5/6 96/95 98/97 98/97 44/45 3/4 4/5 49/47 97/94 96/95 Aztreonam 15/11 43/31 5/4 27/27 35/32 22/18 11/12 1/1 0/0 5/4 88/79 94/93 Imipenem 0/0 <1/<1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 75/56 99/99 Amikacin 3/2 28/21 1/1 3/3 3/3 5/5 14/13 7/3 0/0 2/1 68/56 26/23 Gentamicin 30/28 24/20 3/4 8/7 8/8 7/6 19/19 20/18 4/5 21/17 71/55 32/31 Netilmicin 5/4 41/31 3/4 1/1 9/10 9/9 16/15 5/6 0/0 0/0 75/62 26/23 Tobramycin 23/20 42/31 5/6 7/7 15/14 8/7 24/24 17/11 4/5 2/3 73/58 36/33 Cotrimoxazole 41/40 27/22 10/10 13/13 14/14 7/7 23/20 45/39 4/5 24/21 80/65 9/9 Levofloxacin 40/36 38/26 3/3 8/7 7/5 2/3 8/9 22/15 4/5 7/3 79/61 16/13 Tetracycline 49/48 13/16 8/9 18/19 14/14 11/9 54/57 80/85 77/71 41/42 72/59 43/41 a Abbreviations: ECO, E. coli; KPN, K. pneumoniae; KOX, K. oxytoca; CFR, C. freundii; ECL, E. cloacae; EAE, E. aerogenes; SMA, S. marcescens; PMI, P. mirabilis; PVU, P. vulgaris; MMO, M. morganii; ACI, Acinetobacter spp.; SMP, S. maltophilia. b All isolates/excluding multiple isolates. c Natural resistances are green shaded. d Extended-spectrum -lactamase (ESBL) breakpoint of the 3rd-generation cephalosporins and aztreonam were not applied for E. coli, Klebsiella spp. and P. mirabilis.

2 Table 2. Antimicrobial susceptibility (%) of P. aeruginosa a Antimicrobial agents Resistant Intermediate Susceptible Piperacillin 51/35 <1/0 49/65 Ceftazidime 20/12 6/4 74/84 Cefepime 39/24 8/7 53/69 Cefoperazone-sulbactam 36/24 19/15 45/61 Aztreonam 30/18 28/28 41/55 Imipenem 47/29 5/4 48/67 Amikacin 34/23 2/2 65/75 Gentamicin 46/35 2/1 52/64 Netilmicin 46/34 2/2 52/65 Tobramycin 45/34 <1/2 54/65 Ciprofloxacin 52/33 5/1 43/66 a Total no. of isolates were 1,443 and total no. of isolates excluding multiple isolates were 576. b All isolates/excluding multiple isolates. Table 3. Antimicrobial resistance rates (%) of Staphylococcus and Enterococcus a Antimicrobial agents SAU (783/540) CNS (654/576) EFA (760/637) EFM (710/397) Ampicillin NT NT <1/<1 95/93 Penicillin G 96/95 92/91 NT NT Cefoxitin 66/60 61/57 NT NT Clindamycin 51/44 41/40 NT NT Erythromycin 63/58 59/58 67/68 91/89 Tetracycline 53/45 25/24 83/84 17/17 Cotrimoxazole 7/6 34/32 NT NT Ciprofloxacin 55/47 40/38 26/23 95/94 Teicoplanin <1/<1 <1/1 <1/<1 17/9 Vancomycin 0/0 0/0 <1/<1 42/29 Arbekacin <1/<1 <1/<1 NT NT Linezolid 0/0 0/0 0/0 <1/0 Quinupristin-dalfopristin 0/0 0/0 NT <1/<1 a Abbreviations: SAU, S. aureus; CNS, coagulase-negative Staphylococcus; EFA, E. faecalis; EFM, E. faecium; NT, not tested. b All isolates/excluding multiple isolates. 자의혈액에서 154 주를분리하였는데, 43 주 (28%) 는 CAZ 에내성이었다. 이들중 25 주는 ICU, 10 주는 Ceftazidime 내성 P. aeruginosa에서검출된 -lactamase P. aeruginosa의 -lactam제내성기전중관심이큰것은 metallo- -lactamase (MBL) 이다. 그러나다른 -lactamase도내성에중요한역할을한다. 브라질입원환자에서분리한 ceftazidime (CAZ) 내성 P. aeruginosa의 -lactamase에관한 Picao 등 (1) 의보고가종설은아니지만종설에버금가는연구이기에요약하여소개한다. P. aeruginosa에서보고된 ESBL은 SHV, TEM, PER, VEB, BEL 및 GES이고, 근래 CTX-M도보고되었다. GES 효소중활성부위의아미노산이치환된일부형은 carbapenem을가수분해하는점이특이하다. ESBL 생성 P. aeruginosa가브라질에서보고되었으나그빈도는알려져있지않았다. P. aeruginosa에는 IMP, VIM, SPM, GIM 및 AIM 의 5가지 MBL이있음이알려져있는데, 브라질분리 P. aeruginosa에서는 IMP, VIM 및 SPM형이보고되었다. 브라질에는 SPM 생성균한가지 clone이널리퍼져있다. 이연구자들은브라질에서분리된 CAZ 내성 P. aeruginosa의 ESBL과 MBL의형및빈도를규명하였다. 항균제감수성및 lactamase 생성 P. aeruginosa는 2005년에상파울로병원입원환 응급실, 4주는소아과암환자에서분리되었다. 이환자들중 24명 (55.8%) 은적절한항균제치료를받았고, 14명 (32.5%) 에대한경험적선택은부적절하였다. 5명에대한의무기록은조사할수없었다. 적절한항균제치료를했거나감수성시험에따라서적절한항균제로바꾼 24명중 10명은회복되었고, 9명은 7일이후에사망하였고, 5명은 7일이내에사망하였다. 치료가부적절하였던 14명중 10명은항균제감수성시험이끝나기전에사망하였고, 4명은퇴원하였다. 많은환자에게 carbapenem과 polymyxin B가투여되었으나 38명중 20명에대한효과는없었다. CAZ 내성인 43주는 ticarcillin, ticarcillin-clavulanic acid, cefpirome 및 cefepime에도내성이었다. 감수성비율은 colistin에 100%, aztreonam에 44.1%, piperacillin-tazobactam에 39.5%, piperacillin에 34.8%, imipenem에 18.6% 및 amikacin에 18.6% 이었다. Piperacillin 및 piperacillintazobactam에대한해석은유럽의기준에따라서 MIC 16 g/ml를감수성으로해석하였다. 4 균주 (9.3%) 의 CAZ 내성은단지 AmpC의과량생성 (overproduction) 때문이었다. AmpC 과량생성은 cloxacillin을 250 g/ml 넣은 Mueller-Hinton agar로시험하였다. 9주는 ESBL을생성하였다. 30주는 imipenem을가수분해하였고, 모두 imipenem에내성이었다. Imipenem 가수분해활성

3 (specific activity, 단백질 mg당 ) 의평균은 28주가 0.2 U/mg, 2주는 U/mg 이었다. Double disk synergy 시험양성으로 ESBL 생성이추정된 9주중에는 bla GES-1 양성 7주와 bla CTX-M-2 양성 2주가있었다. 또한 ESBL 표현형이아니고, 약한 carbapenemase 활성을가진 2주에서는 bla GES-5 유전자가검출되었다. Imipenem 가수분해활성이큰 28주중 27주 (62.8%) 에서는 MBL 유전자 bla SPM-1 이, 1주 (2.3%) 에서는 bla IMP-1 이검출되었다. SpeI으로염색체 DNA를절단하여 PFGE를시행한결과 43주는 7가지의주된유전형을보였다. SPM-1 생성 27주는한가지유전형 A (Brazilian epidemic clone에해당 ) 이었고, 이들은 2가지아형 A1과 A2를보였다. GES-1 생성주는 6주가유전형 B, 1주가유전형 C1이었다. GES-5 생성 2주는 C2 형이었다. AmpC 과량생성 4주는유전형 G가 1주, D 가 3주이었다. CTX-M-2 생성 2주는 E형이었고, IMP-1 생성 1주는 F형이었다. -lactamase 유전자의구조 PCR mapping과염기서열분석결과 bla CTX-M-2 서열앞에는 ISCR1이, 뒤에는 qace 1과 sul1이있어서 Enterobacteriaceae에서보고된구조와같았다. ISCR 인자는삽입서열이고인접한서열을전이시킨다. SPM-1 생성균주는 bla SPM-1 앞에 ISCR4, 뒤에는 groel 및 ISCR4가있음이전에보고된바와같았다 ( 그림 1). bla IMP-1 유전자는 class 1 integron의첫째위치에있는유전자 cassette 이었고, 이어서 aada1이있었다. I-CeuI로절단한염색체 DNA를전기영동한결과로는 bla CTX-M-2, bla SPM-1 및 bla IMP-1 의위치가염색체인지확실히알수없었다. bla CTX-M-2 양성인 2 균주와 bla SPM-1 양성인모든균주에서 plasmid가검출되지않았으나, bla IMP-1 양성균주에서는 100 kb의한가지 plasmid가검출되었다. 그러나 bla CTX-M-2, bla SPM-1 및 bla IMP-1 양성인균주에서추출한 plasmid를각 probe로 Southern blot hybridization 하였으나양성반응이없었다. 또한접합에의해서 E. coli와 P. aeruginosa PAO1 recipient로내성인자가전이되지않았다. bla GES 양성균주의성상 bla GES 유전자의주변서열을규명하고자 cloning 을시행하였다. 전체 DNA를 HindIII로절단하여 bla GES-5 가들은재조합 plasmid를얻었다. bla GES-5 유전자는 class 1 integron의첫째에, 이어 서 aaca7 및 aaca4 cassette가위치하였다. aaca4 유전자 cassette의 59-base element (59-be) 는 IS1111 family에속한 ISPa29의삽입으로중단되었다. IS1111 family의삽입서열은 gene cassette의재조합위치에 site-specific recombination에의해서삽입될수있음이알려져있다. ISPa29은길이가 1,534 bp이었고, 12 bp의불완전한역방향반복서열이있었고, IS1111 family의다른삽입서열과는다르게 target site duplication을끼고있지않았다. ISPa29의 transposase 서열은 P. putida에서관찰된 IS1492와 63% 가같았다. 이 class 1 integron은방향이서로반대인 2 copy의 IS26 사이에끼어있었다. 이러한 composite transposon 구조는 bla VEB-1 을가진 integron인 In53에서도볼수있다. bla GES-5 양성및 bla GES-1 양성균주의 class 1 integron 구조는같았다. 이 integron에는 promoter P ant 가있었으나, promoter P 2 는불활화된형태이었다. 프랑스령기아나에서분리된 K. pneumoniae ORI-1 균주의 bla GES-1 과마찬가지로이연구의 bla GES-1 및 bla GES-5 유전자 cassette의 59-be는 19 bp가결손되어있었다. 이연구에서높은 CAZ 내성률은주로 ESBL과 MBL 유전자를가진세균의 clonal spread 때문이었다. 흥미로운것은 AmpC 과량생성한가지기전만으로 CAZ 내성인균주는드물었다. 염려스러운현상은 CAZ 내성균중 82% 는 imipenem에, 95% 는 meropenem에내성인점이었다. 이결과는 carbapenem 분해효소를안가진균주의경우 porin 소실이나유출펌프의고도발현때문으로추정된다. 이연구에서 bla GES 형 ESBL 유전자가 CAZ 내성 P. aeruginosa의 13.9% 에서검출되었다. 이연구에서 CTX-M이 Enterobacteriaceae에만확산되지않고 P. aeruginosa에도확산된결과를보였다. 브라질의같은병원연구에의하면 K. pneumoniae 중의 44.8% 가 CTX-M-2 생성균이었음은흥미롭다. 또한 CTX-M-2를생성하는 P. aeruginosa 1주가 CAZ에감수성이었음이이병원에서보고되었다. CTX-M 생성균은 cefotaxime에더내성이고, CAZ 내성수준은덜하므로이와같은표현형인 CTX-M 생성균의확산은검출하기가어려울것이다. 이연구에서는 CAZ 내성 P. aeruginosa를대상으로연구하였으므로 CTX-M 생성 P. aeruginosa의비율은실제보다낮게추정되었을것이라고하였다. bla CTX-M 과 bla GES 유전자의주변구조는 P. aeru-

4 (A) IS26 inti1 bla GES aac(6 )-Ib aaca7 ISPa29 qace 1 IS26 (B) ISCR4 bla SPM-1 groel2 ISCR4 (C) inti1 bla IMP-1 aada1 qace 1 (D) ISCR1 bla CTX-M-2 qace 1 그림 1. 브라질의 ceftazidime 내성 P. aeruginosa 에서검출된 -lactamase 유전자 ( 적색 ) 의주변구조모형. Coding 유전자는번역방향이화살표로표시되었다. 청색원은 59-be 이고, 청색화살표는 IS element 이다 (Picao 등, 2009 에서인용 ). ginosa에있는것과 Enterobacteriaceae에있는것이같았으며, 따라서그근원이같음을시사한다. 즉, P. aeruginosa에있는이들 -lactamase 유전자는 Enterobacteriaceae에서유래되었을것이다. CAZ 내성 P. aeruginosa의 62.8% 가 SPM-1 carbapenemase를생성하여서이기전이 CAZ 내성의주된원인이었다. 브라질여러도시에는같은clone인 SPM-1 생성 P. aeruginosa가널리퍼져있다. 이 clone은근래스위스의 P. aeruginosa 균주들에서도검출되었다. 이연구에서 SPM-1 생성 P. aeruginosa 균주가 27명의입원환자에집단적인균혈증을일으켰고, 적어도 15명을사망케하였다. 이연구결과는분해활성이넓은여러가지 -lactamase를가져서다제내성을나타내는 P. aeruginosa가브라질다른곳에도퍼져있을가능성을시사한다. 이러한균주를찾아내지못하고, 또한보균자를격리하지못하면이세균은더욱확산될것이다. [ 참고문헌 : (1) Picão RC, Poirel L, Gales AC, Nordmann P: Diversity of -lactamases produced by ceftazidime-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates causing bloodstream infections in Brazil. Antimicrob Agents Chemother 53: , 2009] MBL 검출방법에따른정확성 MBL 생성세균중에는 carbapenem에대한감수성이조금낮아졌을뿐인것이있으며, 따라서표현형에의한검출이쉽지않을수있다. 이러한균주감염에대해서도 carbapenem의임상효과는없다고추정된다. 따라서 MBL의정확한검출은임상적으로중요하다고생각되나, 검출방법이표준화되지않아서연구자에따라서여러가지방법이이용되고있다. 검출방법에관한연구중에는상상하지못했던결과를보이는것이있다. 이러한연구결과를요약하여싣는다. P. aeruginosa에서 MBL 검출위양성 Ratkai 등 (1) 은헝가리에서분리된다제내성 P. aeruginosa 51주를대상으로 MBL Etest (AB BIODISK) 와 combined disk test (CDT) 의정확성을비교하였다. CDT 시험은 10 g imipenem 디스크및 Imipenem 10 g + EDTA 750 g 디스크주변의억제대를비교하는방법을사용하였다 (2). 시험균주모두에대한 MIC는 imipenem과 meropenem이 16 g/ml이었다. 이들을양성으로판단한기준은 Etest MBL의경우 IPI (imipenem + EDTA) 의 MIC가 imipenem의 1/8인것, CDT의경우 imipenem + EDTA 750 g 디스크억제대지름이 imipenem 디스크억제대보다 >7 mm인것으로하였다. 시험된 51주중 49주 (96%) 는 Etest MBL과 CDT 양성이었다. 그러나 Bioassay와분광광도계를사용한가수분해시험은모두음성이었다. Bioassay는세균추출액을 imipenem 10 g/ml와섞고 15분간두었다가 Mueller-Hinton agar (MHA) 의 well에넣고, E. coli ATCC 25922를배지에접종하였다. 또한 2 mm EDTA를넣은액도이와같이시험하였다. Imipenem으로처리한것은억제대를안보이고, imipenem과 EDTA로처리한검체가억제대를보이면양성으로판단하였다. 나중에시행한 PCR로도 MBL 유전자가검출되지않았다. 이들은통상시험시에 EDTA만들은디스

5 크로음성대조시험이필요하다고주장하였다. ( 주 : 이시험결과는다른연구자의 Etest MBL과 CDT 시험성적과는너무다른데, 그까닭을알수없다.) OXA carbapenemase 생성 A. baumannii의 Etest MBL 위양성 Segal과 Elisha (3) 는남아프리카에서 2002년에집단발생한 carbapenem 내성 A. baumannii 균주에대한 imipenem의 MIC가 16 g/ml이었으므로 MBL이나 oxacillinase 생성을추정하였고, MBL 생성을검출하기위해서 Etest MBL로시험하였다. 시험된 A. baumannii 49주는모두가양성이었다. bla IMP-1 과 bla VIM-2 검출을위한 PCR을시행한바양성대조균주는양성이었으나, 시험균주모두는음성이었다. 그러나 OXA carbapenemase 유전자는 49주모두가양성이었고, 일부균주의 amplicon을써서염기서열을분석한바 bla OXA-23 이확인되었다. 따라서 carbapenem 내성의기전은 OXA-23 생성으로해석하였다. Danel 등 (4) 에의하면, Zn 2+, Cu 2+ 및 Ca 2+ 등금속이온은 OXA-10 및 OXA-14의 dimer ( 이량체 ) 상태를안정시키고, monomer ( 단량체 ) 로되는것을막아서 carbapenemase의효소작용을강화한다. 따라서 EDTA가있으면 OXA 효소의활성이적은 monomer로되기때문에 OXA carbapenemase 활성이낮아진다고해석하였다. 이러한설명으로미루어볼때 Etest MBL의 imipenem과 imipenem + EDTA의 MIC의차이가 8-64배가되어도, 이것이 MBL 활성때문이아니고, EDTA 때문에 OXA-23이활성이더적은단량체로바뀌기때문일수있으며, 이가설을증명할시험이필요하다고하였다. 특히 A. baumannii가 Etest MBL 양성일때는조심해서해석해야하고, PCR로 MBL과 OXA 유전자를검출할필요가있다고하였다. ( 주 : OXA carbapenemase 생성 A. baumannii는대단히흔하다. 이들이 Etest MBL 시험에위양성결과를보이는지확인할필요가있다 ). Etest MBL의개발초기평가 Etest MBL법은 MBL 검출을위해서널리쓰이고있다. 위에설명한연구와는결과가다른연구가많은데, 이를인용한다. Walsh 등 (5) 은 Etest MBL strip 개발초기에그성능을비교하였다. Strip에는항균제 imipenem이나 ceftazidime, MBL 저해제 EDTA나 2-mercaptopropionic acid (MPA) 가들어있었다. 비교한바, 항균제는 imipenem이 ceftazidime보다, 저해제는 EDTA가 MPA보다, 배지는 MHA가 Isosensitest agar보다더좋은결과를보였다. Etest MBL strip은한쪽에 imipenem, 다른쪽에 IPI (imipenem + EDTA) 를써서 MHA에서시험한민감도는 94%, 특이도는 95% 이었다. 시험된세균중에는혐기성세균과선천성 MBL 생성균도있었으며, IMP-1 생성균은 12주뿐이었다. 이 strip의제한점은최소 MIC 눈금이 imipenem은 4 g/ml, IPI의 imipenem MIC 눈금은 1 g/ml이기때문에 imipenem 단독의 MIC가 <8 g/ml인균주에서는양성기준인 MIC 1/8 감소를측정할수없는것이문제이다. Lee K 등 (6) 은 Etest MBL 평가에서 bla IMP-1 양성인 Acinetobacter spp. 와 P. aeruginosa 57주모두및 bla VIM-2 양성인 Acinetobacter spp. 와 Pseudomonas spp. 137주중 135주 (98.5%) 가양성이어서, 민감도 99%, 특이도 97% 이었다. 이결과는 Walsh 등 (5) 의결과와비슷하며, Ratkai 등 (1) 및 Segal과 Elisha (3) 의결과와는다르다. P. aeruginosa에서 VIM 및 IMP 검출 Qu 등 (7) 은중국에서분리한 264주의 imipenem 비감수성 P. aeruginosa를써서 Etest MBL, DDS, CDT를비교하였다. 시험균주중 10주는 bla VIM-2, 13주는 bla IMP-9, 1주는 bla IMP-1 양성이었다. MBL 양성균주 24주중 21주는 RT-PCR로 MBL 발현이확인되었고, 3주는발현이음성이었다. P. aeruginosa에서 MBL을검출하기에가장좋은방법은 CDT (IMP-EDTA; 750 g의 EDTA 디스크를사용하고 6 mm 차이를양성으로판단 ) 이었고, CDT법의억제대증가는 P. aeruginosa의 VIM-2 생성균의경우 IMP-9 생성균의경우보다컸다. VIM-2 생성균 11주에대한 imipenem의 MIC는 g/ml이었는데 MIC 16 g/ml과 32 g/ml인 2주는 Etest MBL이위음성이었다. 한편 IMP-9 생성 13주와 IMP-1 생성 1주에대한 imipenem의 MIC는 g/ml이었는데, MIC 32 g/ml인 2주와 64 g/ml인 2주는 Etest MBL 위음성이었다. MBL 유전자의상대적발현수준은 이었는데, 0.00인 3주에대한 imipenem의 MIC는 g/ml이었고 Etest MBL 음성이었다. ( 주 : 이연구에서 MBL 유전자발현은음성이지만, 다른표현형 MBL 시험이양성인까닭을알수없다.) SMA를사용한 VIM 생성 P. aeruginosa 검출 Giakkoupi 등 (8) 이그리스에서분리한 imipenem 비감수성 P. aeruginosa 48주중 36주는 bla VIM 을보유하였다. 이들을대상으로 ceftazidime이나 imi-

6 penem 디스크와 mercaptoacetic acid (SMA) 3 mg 디스크를쓴 DDS 시험으로 MBL 검출을시험하였다. Ceftazidime과 SMA를쓴 DDS 시험반응은 bla VIM 음성인균주를포함한대부분의 imipenem 비감수성균주에대해서불확실하였다. Imipenem과 SMA 디스크를사용한 DDS 시험은 bla VIM 음성인 22주는모두가 DDS 음성이어서특이도가 100% 이었으나 bla VIM 양성 36주중 26주만이분명한양성을보여서민감도가 72% 뿐이었다. ( 주 : 2-MPA 즉 2-mercaptopropionic acid는냄새가심하고, 부식성인액체이어서일본에서는냄새가덜한고체인 SMA 즉, sodium mercaptoacetic acid: thioglycolic acid가 3 mg 들은디스크가판매되고있다. 이화합물은 DDS 시험시 MBL 저해작용이 EDTA보다약하여 Lee K등 (9) 은 EDTA 750 g + SMA 2 mg 디스크를사용한다.) Enterobacteriaceae에서의 MBL 검출 Galani 등 (10) 은 imipenem의 MIC가다양한 Enterobacteriaceae 균종을대상으로 MBL 검출을시험하였다. 이들은 VIM 생성 Enterobacteriaceae 다수를시험한점이특이하다. PCR로 bla VIM 을확인한결과를기준으로하였고, 비교한 MBL 검출방법은 DDS 시험, CDT, Etest MBL 및 modified Hodge 시험이었다. 시험균주중 VIM 생성균은 95주, 비생성균은 99주로총 194주이었다. Imipenem의 MIC가 VIM 생성균주에대해서는 0.5->32 g/ml이었고, 음성균에대해서는 g/ml이었다. VIM 생성 95주중 30주 (31.6%) 에대해서는 imipenem의 MIC가 4 g/ml이어서 Etest MBL의성적은평가할수없었다. 민감도와특이도가 CDT는 imipenem과 EDTA 1900 g을쓴경우 95% 와 98%, ceftazidime과 EDTA 1900 g를쓴경우 100% 와 88%, DDS 시험은 2 디스크의가장자리사이를 10 mm 으로놓고시험한경우 imipenem 디스크와 EDTA 1900 g 방법은 100% 와 92%, ceftazidime과 EDTA 1900 g 방법은 78% 와 90% 이었다 ( 표 1). 이연구자들은 imipenem/imipenem + EDTA 1900 g 또는 ceftazidime/ceftazidime + EDTA 750 g를쓴 CDT 및 imipenem 디스크와 EDTA 1900 g 디스크를 10 mm 간격으로놓고시험한 DDS시험이 Enterobacteriaceae에서 VIM을검출하기에가장유용한방법이라고하였다. 이들시험이 Enterobacteriaceae에서 VIM을검출하기위해서는 Etest MBL보다좋다고하였다 Imipenem lysate MBL functional assay 캐나다의 Tan 등 (11) 은 Imipenem lysate MBL functional assay 라는 MBL 검출방법을보고하였다. 이방법은 EDTA의살균작용으로인한위양성을배제할수있고, 검사비가적으며, Etest MBL 만큼정확하다고하였다. 이방법의원리는세균을용균시켜 MBL을유리시킨검체를 imipenem 디스크에넣어서 MBL 활성으로인한억제대가없음을확인하고, 다른 imipenem 디스크에는용균액과 EDTA 섞은것을넣어서 MBL의불활화로 imipenem 억제대가커짐을확인한다. EDTA는유출펌프나, 세포벽불투과성에는영향이없으므로, 2가지디스크로인한 imipenem 억제대는달라지지않는다. 시험의개요는다음과같다. Imipenem 내성인 P. aeruginosa 균주를 LB 35 ml에서하루밤배양한다. 원침한후에세균침사를 0.05 M sodium phosphate buffer (ph 7) 1 ml에부유시킨다. -20 o C와실온에서얼리고녹이는조작을 5번반복하여용균시킨다. 다시원침하여상청을 membrane filter로여과한다. 여과액을 YM30 Microcon device (Millipore) 에넣어 14,000 x g로 8분간원침하여농축한다 l의농축액을모은다. 9 l의농축액을 0.5 ml의 0.5M EDTA (ph 8) 와시험관에서섞는다. E. coli ATCC 25922를 McFarland 0.5 표준에맞추고, MHA에접종하여배지표면에면봉으로접종한다. Imipenem 디스크 2개를 60 mm 간격으로배지표면에놓는다. 즉시한디스크에는용균액농축액 9 l를놓고, 다른 imipenem 디스크에는 9.5 l의용균액 + EDTA 혼합액을놓는다. 37 o C에 15-17시간배양하고 2 디스크의억제대지름을측정하여비교한다. 시험된 imipenem 내성 34주중 Etest MBL 양성 17주모두에대해용균액디스크로는억제대가작았고, 용균액 + EDTA 디스크에의해서억제대는커져서, 이차이가 7 mm 이상이었다 ( 평균 15 mm 커짐 ). EDTA를용균액에넣은검체로는 IPM 디스크의원래억제대 26 mm가회복되었다. 유출펌프나투과성감소로 imipenem에내성인균주는두디스크의억제대증가는 1 mm 이하여서이시험이음성이었다. 두디스크의억제대가 4 mm 이상다르면 MBL 생성균주를구별하는기준으로적당하다고하였다. 같은균주가시험할때마다다른결과를보인예가있었는데, 이는용균한세균의양이다르기때문이었다. 용균액을여과하지않고시험하면용균

7 안된 P. aeruginosa가 IPM 디스크주변에증식되어서해석이어려웠다. 또한용균액을농축하지않으면 imipenem 디스크에대한 carbapenemase 활성을볼수없었다. 따라서농축조작이추가로필요하였다. 이연구자들의결론은이방법이 Etest MBL과잘맞으며, 경비가적게들고, Etest 보다시간이걸리지만, modified Hodge 시험만큼빠르며, 한번에여러균주를시험할수있어서개발도상국임상검사실에서쓰기에적당할것이라고하였다. ( 주 : 이방법은 Hodge 시험과 DDS 시험을결합한형태라고할수있을것이다. 고체배지에서배양한세균을사용할지라도, 용균, 농축, 여과등조작은복잡하며, 투과성감소나유출증가로인한 imipenem 내성과 class A carbapenemase 생성으로인한내성과는감별이안될것으로생각된다. Yong D (2) 의 CDT시험은 MBL을추출하지않고시험하므로간단한데 Tan 등의방법이 MBL 양성및음성인 P. aeruginosa 억제대차이는더컸으나 MBL 양성및음성세균이구별은두방법이비슷하였다.) [ 참고문헌 : (1) Ratkai C, Quinteira S, Grosso F, Monteiro N, Nagy E, Peixe L: Controlling for false positives: interpreting MBL Etest and MBL combined disc test for the detection of metallo- -lactamases. J Antimicrob Chemother 64:657-8, 2009; (2) Yong D, Lee K, Yum JH, Shin HB, Rossolini GM, Chong Y: Imipenem-EDTA Disk method for differentiation of metallo- -lactamase-producing clinical isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol 40: , 2002; (3) Segal H, Elisha BG: Use of Etest MBL strips for the detection of carbapenemases in Acinetobacter baumannii. J Antimicrob Chemother 56:598, 2005; (4) Danel F, Paetzel M, Strynadka NC. Effect of divalent metal cations on the dimerization of OXA-10 and -14 class D - lactamases from Pseudomonas aeruginosa. Biochemistry 40: , 2001; (5) Walsh TR, Bolmström A, Qwärnström A, Gales A: Evaluation of a new Etest for detecting metallo- -lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol ; 40:2755 9, 2002; (6) Lee K, Yong D, Yum JH, Lim YS, Bolmstrom A, Qwarnstrom A, Karlsson A, Chong Y: Evaluation of Etest MBL for detection of bla IMP-1 and bla VIM-2 allele-positive clinical isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol 43:942-4, 2005; (7) Qu TT, Zhang JL, Wang J, Tao J, Yu YS, Chen YG, Zhou JY, Li LJ: Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo- -lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa strains in China. J Clin Microbiol 47: , 2009; (8) Giakkoupi P, Petrikkos G, Tzouvelekis LS, Tsonas S, Legakis NJ, Vatopoulos AC, WHONET GREECE Study Group: Spread of integronassociated VIM-type metallo- -lactamase genes among imipenem-nonsusceptible Pseudomonas aeruginosa strains in Greek hospitals. J Clin Microbiol 41:822 5, 2003; (9) Lee K, Lim YS, Yong D, Yum JH, Chong Y: Evaluation of the Hodge test and the imipenem-edta double-disk synergy test for differentiating metallo- -lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol 41: , 2003; (10) Galani I, Rekatsina PD, Hatzaki D, Plachouras D, Souli M, Giamarellou H: Evaluation of different laboratory tests for the detection of metallo- -lactamase production in Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother 61:548 53, 2008; (11) Tan J, Pitout JD, Guttman DS: New and sensitive assay for determining Pseudomonas aeruginosa metallo- -lactamase resistance to imipenem. J Clin Microbiol 46:1870 2, 2008] 표 1. VIM 생성 Enterobacteriaceae를대상으로한 MBL 검출시험비교 a MHA Combined disk test b Double disk synergy test c 시험균주수 PCR + Hodge + IPM/IPM+EDTA CAZ/CAZ+EDTA IPM CAZ Total (194) 민감도 (%) 특이도 (%) a 시험된 VIM 생성균주수는 K. pneumoniae 91, E. coli 49, Enterobacter spp. 27, P. mirabilis 17, C. freundii 2, P. stuartii 3 및 Serratia spp. 5임. b 디스크당 EDTA 양은 1900 g. c 2 디스크가장자리사이거리는 10 mm이고, 디스크 당 EDTA 양은 1900 g.

8 Metallo- -lactamase NDM-1 NDM-1 (GenBank accession No. FN396876) 은 Yong D 등 (1) 이보고한새로운 metallo- -lactamase (MBL) 이다. 당뇨병인 59세의인도계스웨덴남자가 2007년뉴델리여행중발병하여인도병원에입원하였었고, 2008년스웨덴에돌아와서입원중요배양에서 carbapenem에내성인 K. pneumonia 가 1,000 CFU/ml 분리되었으나요로감염의소견은없었다. 또한나중에이환자가노인요양원에있을때변배양을하여분리된 E. coli도 carbapenem에내성이었다. 이 MBL 생성 K. pneumoniae에대한 MIC는 imipenem, meropenem 및 ertapenem 모두가 >32 g/ml이었다. Etest MBL에의한 MIC는 imipenem이 256 g/ml, imipenem + 저해제가 3 g/ml로 MBL 양성을뜻하였다. 또한분광광도계를써서 carbapenem 가수분해가확인되었고, imipenem-edta DDS 시험이양성이었다. 그러나 bla IMP, bla VIM, bla GIM, bla SIM, bla AIM 등다른 MBL 유전자가 PCR로검출되지않았다. K. pneumoniae의전체 DNA를써서 genomic library를만들었다. MBL 유전자는 4.3 kb의조각 (fragment) 에위치하였고, 이것을 New Dehli를뜻하는 bla NDM-1 으로명명하였다. 또다른 4.8 kb의조각에는 class 1 integron이들어있었다 ( 그림 1). bla NDM-1 유전자의위치는 K. pneumoniae의염색체 DNA와결손된 IS26 및 Tn3 transposase 유전자사이이었다. K. pneumoniae의염색체 DNA 는유출단백질 (efflux protein) 유전자와결손된 lactate hydrogenase 유전자가있었다. Lactate hydrogenase 유전자바로상류에는양쪽이결손된 ampc 유전자인 bla DHA-1 이있었다. 이어서 phoshoriosyl anthalinate isomerase 유전자가있었다. bla NDM-1 의 상류에는 250개의 nucleotide가있었는데그곳에는 promoter 서열과비슷한부분이있었다. 더상류에는결손된 IS26 삽입서열이있었고, 그곁에는결손된 Tn3-like transposon의 tnpa 유전자가있었다. 획득성 MBL 중 bla IMP, bla VIM, bla GIM, bla SIM 및 bla KHM 는그유전자가 integron 중에있다. 예외는 bla AIM-1 과 bla SPM-1 인데, 이들은 ISCR에인접해있고, 이삽입서열에의해 MBL 유전자가이동된다고추정된다. bla NDM-1 은 integron에들어있지도않고, IS- CR1 곁에있지도않은첫예라고하였다. bla NDM-1 의 open reading frame은 269개의아미노산으로구성된단백질을만드는데, 그분자량은약 27.5 kda이다. NDM-1은다른 MBL과의동일성이낮고, 가장비슷한 VIM-1/VIM-2와도동일성이 32.4% 에불과하다. 완성된 NDM-1의 pi는 6.9 이다. NDM-1이 aztreonam 이외의모든 -lactam 제를가수분해하는점은다른 MBL과같았다. bla NDM-1 은같은환자의변에서분리한 E. coli의 140-kb plasmid에서발견되어서, 인체내에서접합에의해서전달되었다고추정되었다. K. pneumoniae와 E. coli에있는 bla NDM-1 을가진 plasmid는접합에의해서 E. coli J53로전달되었다. Plasmid의크기는 K. pneumoniae에있는것이 180 kb, E. coli에있는것이 140 kb이었다. [ 참고문헌 : (1) Yong D, Toleman MA, Giske CG, Cho HS, Sundman K, Lee K, Walsh TR: Characterization of a new metallo- lactamase gene, bla NDM-1, and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother 53: , 2009]. Metallo- -lactamase KHM-1 Sekiguchi 등 (2008) 은일본에서분리한 C. freundii에서새로운 MBL인 KHM-1 (Kyorin Health Science MBL 1, GenBank accession No. AB443- efflux pump ldh PAI IS26 Tn3 bla DHA-1 bla NDM-1 Class 1 integron 4.3 kb 4.8 kb 그림 1. bla NDM-1 은 4.3 kb 의 DNA 조각에위치하였고, 그에인접한 4.8 kb 의 DNA 조각에 class 1 integron 이있었다. (Yong D 등, 2009 에서요약하여인용.)

9 628) 을보고하였다. 이세균은 1997년에도쿄의 Kyorin University Hospital의요로삽관환자의요검체에서분리되었다. C. freundii 분리주에대한 MIC는 imipenem이 2 g/ml, meropenem이 4 g/ml이었고, aztreonam이 0.25 g/ml이었다. 이세균은 sodium mercaptoacetic acid (SMA) 디스크를사용한 DDS 시험이양성이어서 MBL 생성이추정되었다. C. freundii 분리주에는약 70 kb와 200 kb의 2가지 plasmid가있었는데, -lactam제내성이접합으로전달된 E. coli transconjugant에는 200 kb의 plasmid가있었다. 이 plasmid를써서 subcloning을시행하였다. bla KHM-1 의 ORF에는 241개의아미노산부호가있었다. KHM-1 단백질은크기가 25 kda이었다. KHM-1의동일성은배양안된세균의 MBL인 Uvs123과는 82%, IMP-1 및 SIM-1과는 59%, VIM-1과는 38%, GIM-1과는 50%, SPM-1과는 46% 이었다. KHM-1은 aztreonam 이외의 -lactam 제를가수분해하였고, EDTA에의해서그활성이저하되며, Zn 2+ 에의해서다시활성화되는점이다른 MBL과같았다. 이세균에는 class 1 integron이한개있었으나 bla KHM-1 는그안에위치하지않았다. bla KHM-1 상류의 774 bp에는 site-specific cointegration event, ORF, 혹은전이성인자와상동인서열이없었다. bla KHM-1 의하류에는 360 bp의 ORF가있었고, 이것은 119개의아미노산으로구성된단백질을만든다고추정되었는데, 이서열은 Vibrio parahaemolyticus의 VP1798과 77% 가동일하였다. 1997과 1998년에 C. freundii 104주, C. koseri 13주및다른 Citrobacter 균종 5주를같은병원임상 검체에서분리하여 MBL 생성을선별하였다. 이들중 C. freundii 4주는 imipenem에대한감수성이저하되었으나 (MIC >8 g/ml) bla KHM-1 은음성이었다. [ 참고문헌 : (1) Sekiguchi J, Morita K, Kitao T, Watanabe N, Okazaki M, Miyoshi-Akiyama T, Kanamori M, Kirikae T: KHM-1, a novel plasmidmediated metallo- -lactamase from a Citrobacter freundii clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother 52:4194-7, 2008] Genomic library 와 cdna library 분자생물학에서 library라고함은 DNA 조각을 cloning의과정을거쳐서미생물에저장한것을뜻한다. Genomic library는 DNA의조각으로 library로만든것이고, cdna library는 RNA에서유래된 cdna를써서 library를만든것이다. Genomic library를만드는과정은 (1) 세포에서 genomic DNA를분리하고, (2) 제한효소로 DNA를큰토막으로자르고, (3) 그토막 DNA를 vector에삽입하고, (4) 이것을세균등미생물에삽입한다. cdna library를만드는과정은 (1) 세포에서 RNA 를얻고, (2) RNA를역전사하여 cdna를만들고, (3) cdna를 vector에삽입하고, (4) 이것을미생물에삽입한다. Genomic library에는발현이안되는염기서열도들어있지만, cdna library에는세포에서발현된유전자만들어있게된다. 따라서최종적으로발현되는유전자연구를위해서는 cdna library를이용하는것이좋고, 유전자로발현되지않는서열즉, intron이나 promoter 등의연구를위해서는 genomic library가필요하다. 동남아시아에서분리한세균의 ESBL 생성비율 ESBL 을생성하는 E. coli 나 Klebsiella spp. 의 분리빈도는나라에따라서차이가크다. 아시아와 태평양지역나라환자의복강내감염에서 2007 년에 분리된균주중의 ESBL 생성률은 E. coli 가 42.2%, Klebsiella spp. 가 35.8% 이었다. 특히인도에서 분리된 ESBL 생성균의비율은높아서 E. coli 가 79.0%, K. pneumoniae 가 69.4%, K. oxytoca 가 100% 이었다. ESBL 생성 E. coli 의비율은중국에서 도높아서 55.0% 이었고, 태국에서는 50.8% 이었다. E. coli 보다 K. pneumoniae 의 ESBL 생성률이 높았던나라의 ESBL 생성 K. pneumoniae의비율은필리핀 40.0%, 싱가포르 37.5%, 대만 18.3%, 베트남 39.1% 이었다. 한국의 ESBL 생성균비율은 E. coli 22.7%, K. pneumoniae 32.4%, K. oxytoca 25.0% 이었다. E. coli, K. pneumoniae 및 K. oxytoca를합하여 ESBL 생성률이낮았던나라는호주 6.3% 와뉴질랜드 4.4% 이었다. [ 참고문헌 : (1) Hawser SP, Bouchillon SK, Hoban DJ, Badal RE, Hsueh PR, Paterson DL: Emergence of high levels of extended-spectrum -lactamase-producing gram-negative bacilli in the Asia-Pacific region: data from the Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (SMART) program, Antimicrob Agents Chemother 53: , 2009]

10 획득성 MBL 유전자는모두가 integron 중에위치하는지물은분께다음회신을드립니다. 획득성 MBL 유전자에는 bla IMP, bla VIM, bla GIM, bla SPM 및 bla SIM 의 5가지형이있었습니다 (1). 그후 bla KHM bla AIM 및 bla NDM 이보고되었습니다 ( 참조미니사전 ). 이들중에서는 IPM과 VIM의변형이가장많아서각각 26가지와 23가지가 알려져있습니다 ( IMP, VIM, GIM 및 SIM의 4가지 MBL 유전자는 integron 중에, 대부분은 class 1 integron 중에위치합니다. 그러나 SPM-1, KHM-1과 NDM-1 유전자는 integron에들어있지않습니다. [ 참고문헌 : (1) 이경원, 정윤섭, 용동은, 염종화, 정소영 : 항균제내성진화와다약제내성세균의확산. 서흥출판사, 2007, P.128] 항균제내성소식제 17 권제목별찾아보기 내성과대책 -WHO 가정한사람의감염치료에중요한항균제, 제 1 호 : 6 미니사전 -Acinetobacter-derived cephalosporinase (ADC), 제 3 호 : 8 -Correia element, 제 2 호 : 7 -ESBL A, ESBL M, ESBL CARBA: 제안된 ESBL 의새로운이름, 제 1 호 : 6 -Genomic library 와 cdna library, 제 4 호 : 9 -Metallo- -lactamase KHM-1, 제 4 호 : 9 -Metallo- -lactamase NDM-1, 제 4 호 : 8 -ORF, 제 2 호 : 7 -Partially vancomycin dependent Staphylococcus aureus, 제 3 호 : 7 -Plasmid 의형태와전기영동제 2 호 : 7 -RUP, 제 2 호 : 7 -trans 와 cis 제 2 호 : 8 -Triclosan, 제 3 호 : 8 토막뉴스 - 동남아시아에서분리한세균의 ESBL 생성비율, 제 4 호 : 9 - 미국소아병원환자의 MRSA 감염증가, 제 2 호 : 9 - 우리나라분리 A. baumannii 의특성, 제 3 호 : 9 - 진정한지역사회획득 VIM-1 생성 E. coli 외이도염, 제 2 호 : 8 -ESBL 생성 E. coli 의미국지역사회확산, 제 1 호 : 9 -GES-11 생성 A. baumannii, 제 3 호 : 9 -Panresistant K. pneumoniae, 제 1 호 : 8 편집인의회신 - 임균의 penicillin G 와제 3 세대 cephalosporin 내성, 제 1 호 : 9 - 손소독제의유효성, 제 3 호 : 10 -S-1 효소를이용한거대 plasmid 의검출, 제 2 호 : 9 - 획득성 MBL 유전자, 제 4 호 : 10 Breakpoint -새기준에따른 S. pneumoniae 의 penicillin G 감수성의변화, 제 1호 : 3 -M. catarrhalis 의디스크법감수성시험해석기준, 제 3호 : 2 Drug Evaluation -Quinolone 내성의장염치료에대한영향, 제 2호 : 5 Focal Point Data -Antimicrobial resistance of clinical isolates of bacteria in 2008, 제 1호 : 1 -Antimicrobial resistance of bacteria isolated during January to March in 2009 at a KONSAR program participating hospital 제 2호 : 1 -Antimicrobial resistance of bacteria isolated during April to June in 2009 at a KONSAR program participating hospital, 제 3 호 : 1 -Antimicrobial resistance of bacteria isolated during July to September in 2009 at a KONSAR program participating hospital, 제 4 호 : 1 Method Evaluation -자동화방법으로 carbapenem 내성이검출안된 Enterobacter aerogenes, 제 3호 : 6 -AmpC와 ESBL 검출을위한디스크확산법, 제 1호 : 4 -MBL 검출방법에따른정확성, 제 4호 : 4 -qnr 유전자로인한 quinolone 내성세균검출, 제 2호 : 5 Review Digest -Campylobacter의 macrolide 내성기전, 제 3호 : 3 -Ceftazidime 내성 P. aeruginosa 에서검출된 -lactamase, 제 4 호 : 2 -IS, MITE 및 IMU, 제 2 호 : 2 -Mupirocin을사용한 S. aureus 제거효과, 제 1호 : 3

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