그람양성알균의 감수성시험

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1 항균제감수성검사와 항균제내성 안산대학교박정준

2 목차 1. 항균제감수성시험의원칙 2. 감수성시험방법의종류 3. 액체배지미량희석법 (broth microdilution method) 4. 우무배지희석법 (agar dilution method) 5. 디스크확산법 (disk diffusion test) 6. 특별한세균의감수성시험 1) Haemophilus influenzae 2) Neisseria gonorrhoeae 3) Neisseria meningitidis 4) Streptococcus pneumoniae의 penicillin G 내성

3 목차 5) Methicillin 내성 Staphylococcus 6) Vancomycin 내성 Staphylococcus aureus 7)Mupirocin 내성 Staphylococcus 8) 유도성 clindamycin 내성 Staphylococcus 9) Enterococcus g1ycopeptide 내성 10) Etest 11) β-lactamase 시험 12) Extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 시험 13) Carbapenemase 시험 7. Disk diffusion: Troubleshooting Guide

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5 1. 항균제감수성시험의원칙 1) 감수성시험대상세균 감염을일으킨병원균만시험, 단기회감염병원체 (opportunistic pathogen) 인폐렴사슬알균 (Streptococcus pneumoniae) 은해석을잘해야함. 분리한균주의감수성을예측할수없을때만감수성시험필요, Streptococcus pyogenes 와무산소성세균은통상감수성시험하지않음. 대상세균 : (1) S. aureus, Enterococcus, Enterobacteriaceae 및 P. aeruginosa 와 Acinetobacter 등포도당비발효그람음성막대균. (2) β-lactamase 생성 H. influenzae, N. gonorrhoease 및 M. catarrhalis.

6 2) 시험대상항균제 - 시험대상항균제 CLSI의권장과그병원에서사용되는항균제의종류를고려하여각검사실이정해야함. - 자연내성인항균제는감수성시험하지않음 그람음성막대균인경우 penicillin, vancomycin - 항균제에따라서조직중의농도가다르며, 어떤조직에는항균제가도달하지않음. 어떤항균제는 (nitrofurantoin 등 ) 요검체에서분리된세균에만시험하고, 어떤항균제는 (cefazolin, vancomycin 등 ) 척수액에서분리된세균에서는시험하지않음

7 항균제선택 분류 A군 B군 C군 U군 O군 InV군 일차적으로검사하고보고할약제 설명 임상적으로특히병원감염에유용한약제로일차적으로검사가필요하지만, 보고는다음과같은조건을고려하여선택할수있다. 검체의종류 :CSF 에서장내세균이분리되었을때 3 세대 Cephalosporin, 소변분리균주에서 SXT 다종의세균에의한감염 여러부위의감염 A 군에속하는약제에반응을보이지않을때. 대체또는보조적인항균제그룹, 일차적인약제에다재내성인균이토착화되어있거나유행이발생했을때, 일차약제에알레르기가있을때, 비전형적인세균감염, 감염관리를위한역학조사시검사를한다. 소변분리균에대해서만검사가필요한약제, Nitrofurantoin 미국에서통상검사로서사용되지않는약제 FDA 에승인을받지못한약제

8 (1) 계열대표항균제 - 같은계열항균제의시험관내항균력은비슷한경우가많으므로, 계열대표 (class representative) 약에대해서만시험하고, 그결과를같은계열의여러항균제에대해서도적용하게됨 ( 표 1). (2) Cluster 및 related group( 표2) - Cluster는그시험관내감수성이나임상효과가비슷한것임. 한 cluster에속하는항균제들을빨간색원으로묶었고, 적색으로묶인항균제중에서는병원에서사용하는항균제에대해서시험함. 시험결과에는실제시험한항균제의이름으로보고하고, 그결과가적용되는항균제종류를임상의사에게알림. - 청색원으로묶인항균제중에서는한가지만을시험하며, 예 ) Staphylococcus 를 시험할때 azithromycin or clarithromycin or erythromycin 으로표시됨. 이들에대 한감수성혹은내성이거의같음을뜻하며, 각각에대해시험할필요가없음.

9 표 1. 감수성시험에사용한항균제와그결과가적용되는항균제 감수성시험에사용된항균제 Penicillin G 시험된세균 Staphylococcus spp., Neisseria gonorrhoeae 결과가적용되는다른항균제 Phenoxymethylpenicillin, phenethicillin, ampicillin, amoxicillin, bacampicillin, cyclacillin, hetacillin, carbenicillin, mezlocillin, azlocillin, ticarcillin, piperacillin Ampicillin 모든균종 Amoxicillin, becampicillin, cyclacillin, hetacillin Ampicillin Enterococcus spp. Penicillin Oxacillin (cefoxitin) Staphylococcus spp. 모든 penicillin제, 모든 cephalosporin제, 모든 β-lactamase 저해제복합제, 모든 carbapenem제, loracarbef Cephalothin Enterobacteriaceae Cephapirin, cephradine, cephalexin, cefaclor, cefadroxil Cephalothin 또는 cefazolin ( 감수성 ) Enterobacteriaceae 모든 cephalosporin 에감수성 Clindamycin 그람양성세균 Lincomycin Erythromycin 그람양성알균 Azithromycin, clarithromycin, dirithromycin, roxithiomycin, Tetracycline Staphylococcus 및 Acineto- bacter 이외의모든균종 Doxycycline, minocycline, chlortetracycline, democlocycline, oxytetracycline, methacycline Sulfisoxazole 모든균종모든 sulfonamide 제 MCM (2007) P 에서인용.

10 표 2. 균종별로감수성시험이권장되는항균제 (CLSI, 2012) 세균별로시험이권장되는항균제군 항균제 Enteroba c- P. aeruginosa Acinetobacter s Stapylococcus Enterococcus Haemophilus N. gono - S. pneu - β용혈성 Strepto- triaceae pp. rrhoeae moniae coccus Ampicillin-sulbactam B A Amoxicillin-clavulanate B B Piperacillin-tazobactam B B Ticarcillin-clavulanate B B Cephalothin A Cefazolin A Gentamicin A A A C C ( 고농 Tobramycin A A A 도 ) Amikacin B B B C ( 고농 Streptomycin 도 ) Azithromycin A C Clarithromycin A C A A Erythromycin A C B A Telithromycin B B Clindamycin A

11 2. 항균제감수성시험방법의종류 1) 희석법 (Dilution method) (1) 액체배지시험관희석법 (broth macrodilution method) (2) 액체배지미량희석법 (broth microdilution method) (3) 우무배지희석법 (agar dilution method) 2) 디스크확산법 (Disk diffusion method) 3) Etest 4) ß-lactamase 검사

12 (1) 희석법 (Dilution method) 1 액체배지미량희석법 (broth microdilution method) - Microtiter plate 를이용한상품화된방법이근래널리사용 - 최소발육저지농도 ( 최소증식저지농도, minimum inhibitory concentration, MIC) - 액체배지시험관희석법 (macrodilution) 은 최소살균농도 (minimum bactericidal concentration, MBC) 도 시험할수있음.

13 2 우무배지희석법 (agar dilution method) - 많은수의균주에대한감수성시험할때 - 액체배지희석법보다편리하고오염을알아보거나감수성이다른소수의변이세균이섞여있음을알수있으며, 재현성이더높음. - MIC 시험은항균제의투여량을조절해야할경우 - 느리게증식되므로디스크확산법으로는시험할수없는세균의감수성시험 - 디스크확산법으로결과가불확실한경우의확인시험에이용 - 우무배지희석법은환자검체를시험하기에는쓸수없고, 연구목적으로여러세균의 감수성을시험할때사용된다. (2) 디스크확산법 (Disk diffusion method) - 가장널리쓰이는것은소위변법 Kirby-Bauer법 (CLSI법). - 한균주를여러가지항균제에대해시험 - 시험할항균제의종류를쉽게변경할수있고, 방법이간단하여통상시험에편리함. - 디스크확산법은증식이빠른세균에대해서만시험 - 감수성수준을 MIC로표시할수없고, 감수성, 중간및내성의정성적으로나타냄.

14 (3) E test - 대상균주 : 잘자라는세균뿐만아니라배양이어려운영양요구도가큰세균과진균등에항균제 MIC를측정. - 배지 : Mueller-Hinton 우무나영양강화우무에접종하고 E test strip을글자가위쪽을향하게놓고항온. - Strip 밑배지에는위치에따라서항균제의낮은농도부터높은농도의구배 ( 句配 ) 가생긴다. 억제대는독특한모양이며타원형 (ellipse) 이라고하고옆에있는눈금에서 MIC를읽음. - 다른방법의 MIC 시험에서는 1, 2, 4 ug/ml 등 2배차이로결과를읽지만 E test는중간 MIC도판독됨. 수시로 MIC를시험하기에편리함. - Strip의반대면의항생제농도구배 ( 句配, 기울기 ) 는각각의항생제에따라 μg /ml 또는 μg /ml strip의반대면의항생제농도기울기는각각의항생제에따라 μg /ml 또는 μg / ml의연속적인농도로구성의연속적인농도로구성

15 E test strip 을이용한 Streptococcus pneumoniae 에대한 penicillin G 의 MIC 시험. Streptococcus pneumoniae penicillin G MIC = 0.64 μg /ml.

16 (1) Breakpoint 와해석 3) 감수성시험결과의해석 - 억제대의지름또는항균제의 MIC 에따라서감수성 (susceptible), 중간 (intermediate) 혹은내성 (resistant) 으로해석. - 감수성의해석기준 대부분은항균제의보통용량을투여했을때의혈중농도를기준 요로감염에만쓰이는 nalidixic acid 등의경우 : 요중농도를기준. 수막염치료항균제 : 척수액중의농도를기준.

17 (1) Breakpoint 와해석 감수성 (S, susceptible) : 권장되는용량의투여로감염부위에도달되는항균제 의농도가시험된세균의증식을억제할수있음을뜻함. 중간 (I, intermediate) : 1 시험균주에대한항균제의최소억제농도가혈중이나조직에도달하는농도와비슷함을뜻하며, 감수성인균주에대해서보다치료효과가낮을것임을뜻함. 2 항균제가농축되는부위 ( 예, 요중 quinolone과 β- lactam제 ) 의감염이나, 다량을투여할수있는약제 ( 예, β-lactam제 ) 를보통보다다량투여했을때는치료효과가있을것임뜻함. 3 감수성시험시의기술적인과오를피하기위한완충대의역할을함 내성 (R, resistant): 보통용량을투여했을때도달되는항균제농도로는세균증식 이억제되지않음을뜻함. 또한특별한내성기전 ( 예, β-lactamase 생성 ) 이있어서 치료효과가없을것임을뜻함.

18 6) 감수성시험의정확성유지 (1) 통상검사시유의사항 - 감수성시험 각시험균주를수작업으로한균주씩처리하므로정도관리균주의결과가정확하여도그날의모든시험이정확하다고는할수없음. - - 표.3 는드물거나관찰된일이없는내성표현형. - 검사자는시험세균의균종과그내성양상을고려하면서감수성시험결과를판독. - 항균제감수성을판독하는자동기기 : Expert system 컴퓨터프로그램있음. - 균종의동정과감수성시험결과잘못이없는지, 또는보통과는다른이해할수없는결과가없는지를자동적으로지속적으로알려주기위한것임. - 이프로그램을이용하면동정이나감수성시험의과오를줄일수있게됨.

19 6) 감수성시험의정확성유지 (1) 통상검사시유의사항 세균 표 3. 드문내성또는관찰된일이없었던내성 드물거나없었던내성 Enterobacteriaceae Staphylococcus aureus Coagulase 음성 Staphylococcus Enterococcus faecalis Enterococcus faecium β용혈성 Streptococcus Streptococcus pneumoniae Streptococcus, viridans Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Imipenem, meropenem Vancomycin, teicoplanin, daptomycin, linezolide, quinupristin-dalfopristin Vancomycin, daptomycin, linezolide Ampicillin, daptomycin, linezolide Quinupristin-dalfopristin, daptomycin, linezolide Penicillin, ampicillin, extended spectrum cephalosporin, daptomycin, linezolide, vancomycin Fluoroquinolone, linezolid, vancomycin Daptomycin, linezolide, vancomycin Aztreonam, carbapenem, extended spectrum cephalosporin, fluoroquinolone Extended spectrum cephalosporin Azithromycin, extended spectrum cephalosporin, carbapenem, chloramphenicol, minocycline, fluoroquinolone, rifampin

20 (2) 정도관리 항균제감수성시험은규정된방법대로시험하고, 감수성시험의정확성을유지하기위해 서는표준 ( 참조 ) 균주를써서정기적인정도관리함 ( 표 4.). Enterococcus faecalis ATCC 는희석법고농도 gentamicin 과 streptomycin 감수성 시험의정도관리에쓰임. 참조균주의일부는 15% glycerol 을넣은액체배지, 20% 탈지분유 (skim milk) 등에진하게 풀어서 -70 이하에보관함. 사용균주는 1 달에 1 번씩, 또는변이가일어났을때는냉 동한균주에서 soybean casein digest agar (TSA) 에계대배양하여사용함. Pseudomonas aeruginosa 는변이되기쉽다. 사용균주는 1 주일에 1 회계대하여냉장함.

21 표 4. 디스크법감수성시험정도관리의빈도 변경된방법 일련의 (consecutive) 정도관리가필요한일수 1 일간 5 일간 일간 디스크새제조회사, 새제조번호 x 배지새제조번호 x 접종균탁도 새제조회사 육안으로맞추다가광도계로 바꿈 x x 억제대측정 육안으로판독하다가자동기기 로바꿈 x

22 정도관리빈도 : 디스크확산법의정도관리에대해주로설명. 1 감수성시험을처음정도관리시매일 20-30일간한다. 2 각항균제와각표준균주의부정확한결과가 20 시험중 1회이하, 또는 30회시험중 3 회이하이면정도관리빈도를매일 1회에서 1주일에 1회로줄일수있음. 3 1주일에 1회정도관리를하다가억제대범위를벗어나는경우가있으면그원인을제거해야함. 4 만일과오의원이밝혀지지않으면그원인이밝혀질때까지정도관리를매일해야함. 5 새배지나새디스크, 혹은새로운방법으로바뀌었을때는표 4에표시된기간동안매일정도관리를해야함. 정도관리결과와과오의원인은기록으로남겨야함. 허용범위 : 매회의정도관리결과는억제대의지름이규정된허용범위에들어야함.

23 흔한과오의원인 : 감수성시험이부정확해지는흔한과오의원인 첫째는디스크확산법으로시험할수없는세균을시험하는경우. 둘째는배지의 ph (ph ) 나성분이부적당한경우와두께 4 mm가아닌경우. 셋째는항균제디스크를잘못저장하거나유효기간이지난것을쓰는경우. 감수성시험방법의과오 접종균액의탁도를잘못맞추었을때, 배양조건 ( 온도, 시간, 가스환경 ) 을잘못했을때, 억제대를잘못재거나, 해석기준을잘못적용할때등.

24 (3) 접종할세균부유액의탁도 -Haemophilus 와 methicillin 내성 S. aureus 이외의세균은 3-5 개의집락을따 서 Tryptic soy broth (Difco) 4-5 ml 에접종하여배양. - 탁도를 McFarland nephelometer 의 0.5 관 ( 세균수약 10 8 CFU/ml) 에맞추고, 이 것을다시액체배지나식염수를써서 1:20 으로희석. - 세균액 180 ul 를각 well 에접종한다. 최종접종균수는 5 x 10 5 CFU/ml 가됨. - 이표준은 mol BaCl 2 (1.175% W/V BaCl 2.2H 2 O) 0.5 ml 를 0.36N H 2 SO 4 (1% V/V) 99.5 ml 에넣어서밀봉하여실온어두운곳에둠. - 사용하기전에세게흔들어섞음. 검은줄이있는흰바탕을배경으로밝은조 명아래에서비교 ( 그림 2). 분광광도계로탁도를맞추어도됨 ( 그림 3.).

25 McFarland 0.5 유의사항 그림 2. 접종할세균의탁도맞추기. 검은줄을친흰바탕앞에 0.5 탁도표준 (0.5 McFarland standard) 시험관과접종할세균부유액을나란히비교하면서탁도를맞춤 McFarland 는표준탁도는실온에서 6 개월유효 2. 표준탁도는 625 nm 의흡광도가 의수치를보여야한다 3. 동일한흡광도를가지는대조균주희석액을고체배지에도말시형성되는집락 의밀도가 10 8 CFU/ml 이어야함 (10 배희석후도말하여형성된집락계수 )

26 그림 3. TREK Sensititre AutoInoculator 를사용한감수성시험용세균의탁도맞추기와접종 (Uniscience Co.).

27 2. 산소성세균의감수성시험 액체배지희석법 - 시험관법 (macrodilution broth method) - 액체배지미량희석법 (microdilution broth method) 법 여러가지상품화된후자의방법이널리쓰임 ( 그림1 ). 그림1. Broth microdilution 감수성시험용 tray의예. Candida albicans에대한 MIC 시험에사용된 TREK Sensititre YeastOne. 청색왼쪽첫째칸의항균제농도가 MIC이다.

28 (4) 결과판독 배양후에육안으로관찰하여증식을억제시킨항균제의최소농도를 MIC로함. 극히연한혼탁이나, 극히소량의침전은증식이억제된것으로판독 ( 그림4). CLSI 해석기준에따라서결과를감수성 (S), 중간 (intermediate) 및내성 (R) 으로해석. Lan 1 Lan 2 Pos Neg μg /ml 그림 4. Broth microdilution 감수성시험. Oxacillin MIC of S. aureus Lan. 1. MIC = ug/ml Lan. 2. MIC = 128 ug/ml

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31 (5) 최소살균농도 (minimum bactericidal concentration, MBC) 시험 1 액체배지희석법의대조시험관액원액 ( 항균제없는시험관 ) 과 1/10 희석액 10 ul를평판에펴서배양. 하룻밤배양한후에집락수를셈 2 MIC 시험후세균증식이없는시험관액체 0.1 ml씩각각평판에접종하고하룻밤배양. 대조집락수의 0.1% 이하의집락수를보인시험관의항균제농도가 MBC. 3 MIC와 MBC치의차이가큰지적은지에따라서항균제를정균성 ( 停菌性, bacteriostatic) 과살균성 ( 殺菌性, bactericidal) 으로구별. 4 살균성항균제 : Aminoglycoside, cephalosporin, metronidazole. penicillin, polymyxin, rifampin, vancomycin 정균성항균제 : Chloramphenicol, nalidixic acid, sulfonamide, tetracycline. 그러나살균성인지정균성인지는항균제의종류에따라서만정해지는것이아니고, 항균제의농도, 배양시간, 시험세균의균종에따라서도달라짐. 살균성항균제의 MBC가 MIC의 32배이상일때그세균은 tolerance 가있다고함.

32 제 1 일 배지 1ml( 숫자는배지중의항균제, μg /ml) μl 시험세균액 (1X10 6 CFU/ml) 1ml 를접종 ( 배지중의항균제농도는반으로줄고세균수는 5X10 5 CFU/ml 가된다 ) 즉시 1/10 희석액 10 μl를대조배지평판에접종한다 제 2 일 하룻밤배양 육안으로관찰한다 MIC=8 μg /ml 혼탁하지않은시험관에서는 0.1ml 를평판에접종한다 각각 0.1ml씩하룻밤배양 500CFU 집락을세어서 control tube 의 CFU 를계산한다 (500 CFU/0.001ml=5X10 5 CFU/ml) 제 3 일 70 CFU 집락수를센다 70 CFU/0.1ml = 700 CFU/ml 는원래의 CFU 5X10 5 /ml 의 0.1% 가넘으므로이경우의 MBC 는 8 μg /ml 가아님 MBC=16 μg /ml Macrodilution broth 법에의한 MIC 와 MBC 시험

33 (2) 배지 신속히증식하는산소성혹은조건무산소성세균 : Mueller-Hinton agar 사용. Staphylococcus의 methicillin 감수성을시험할배지에는 NaCl을 2% 되게넣는다. 영양요구성이큰세균을시험할때는면양, 말또는다른동물의혈액을 5% 되게넣는다. 1 Streptococcus : 혈액첨가 2 임균 : GC agar base에 1% 의 defined supplement첨가 3 Haemophilus: Haemophilus test medium (HTM) 사용 혈액을넣으면 novobiocin이나 nafcillin 등단백질결합률이높은항균제의 MIC는달라질수있음. 100 mm의평판 1개당배지와항균제용액을합한양이 20 ml가되게하면편리함. 중간농도항균제용액 2 ml와멸균한후 로식힌배지 18 ml를섞어서평판한개를만듬 ( 표 1-7). 접시에붓는다. 배지의 ph는 가되어야함.

34 (3) 시험세균접종 1 액체배양법 (growth method) 4-5개의집락을 TSB 4-5 ml에접종, 엷게혼탁될때까지 35, 2-5시간배양 식염수나 TSB로 McFarland 제0.5관표준탁도에맞춤 2 직접집락현탁법 (direct colony suspension method) 까다로운 Haemophilus influenzae, 임균, 폐렴사슬알균, methicillin내성 Staphylococcus (MRSA 또는 MRCNS) 및다른균종도사용. 하루밤배양된집락을 TSB에현탁시킨후 McFarland 제0.5관표준탁도가되도록멸균식염수나 TSB로희석. 탁도를맞춘후 30분이내에 ml백금이로점모양으로접종 - Enterobacteriaceae 는약 5 x 10 7 CFU/ml 가, P. aeruginosa 는 1 x x 10 7 CFU/ml. 이균액을다시식염수나 Mueller-Hinton broth 를써서 1:10 으로희석.

35 (3) 시험세균접종 - 계속 - 희석한균액을만든 30 분이내에 ml 의백금이를써서점모양으로 접종. Steers 의 inoculator 등을쓰면편리. Steers 의기구는 32 개의균주를한번 에접종할수있다. 약 10 4 CFU 가접종. - 항균제농도가낮은배지부터접종. Steers 의한접종판으로너무많은배지 를접종하면오염이되기쉬우므로항균제배지 5 가지이상을접종해서는안된 다 ( 그림 5). - 항균제가들어있는배지를접종하기전과후에항균제가안들은대조배지각 1 개에접종하여충분한세균이접종되었는지와오염균이없는지를확인해야함.

36 (3) 시험세균접종 - 계속 - 접종한배지는접종액이완전히흡수될때까지놓아두었다가시험균 종에따라서 35 공기환경이나 CO 2 환경에보통 시간 ( 혹은균 종에따라서권장되는시간 ) 배양. - CO 2 환경에배양하면 ph 가내려가므로결과가부정확해짐. 수막알균, 임균, 폐렴사슬알균과사슬알균은 5-7% CO 2 항온기에배양. -Methicillin 내성 Staphylococcus 를시험하기위해서는정확히 24 시간 배양

37 그림 5. 우무배지희석법시험용배지의접종에사용되는 Steers replicator ( 좌 ) 와혈액첨가배지로무산소성세균시험후일부균주만증식된모양 ( 우 ).

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39 (4) 시험결과판독 - 검은색검사대로판독. 증식을완전히억제시킨항균제최소량을 MIC 로함. 한개의집락이나접종균액때문에뿌옇게보이는것은무시. Cotrimoxazole 은 증식을 80% 억제시킨농도를 MIC 함. - MIC로생각되는농도보다높은농도의배지에 2개이상의집락이계속해서증식될때나, 낮은농도에서는증식이없는데높은농도에서다시증식이있을때는오염균이아닌지계대배양해서확인. - MIC의해석 (interpretation) 은균종에따라서 CLSI 기준 (criteria) 에따름. -Heteroresistance S. aureus 는 35 에배양하면 methicillin, oxacillin 및 nafcillin 내성을나타내지만, 37 에서는 48 시간배양해야만내성을나타냄.

40 (5) 정도관리 - 시험항균제나시험세균에따라서적절한참조균주를동시에시험하여 그결과가허용범위에들어야함. CLSI 기준 : 정도관리용균주에대 한희석법 MIC (μg/ml) 의허용범위사용 - 통상시험으로우무희석법을쓰는검사실에서는정도관리세균에대한 MIC 의 95% 가범위에들어야하고대부분이중앙치에맞아야함. - 접종이끝나고남은세균부유액을희석하여혈액우무에배양하면오염 이되었는지를알아낼수있으며, 여기에서생긴집락은재검사가필요 할때에쓸수있음.

41 3) 디스크확산법 (disk diffusion test): 변법 Kirby-Bauer 법 (CLSI 법 ) - 시험방법을잘지키면상당히정확하고재현성있는결과를얻을수있음. - 억제대의지름과그세균에대한 MIC와는역상관관계를보임. - 억제대의크기 : 약제의확산성에따라서도달라짐. 종류가다른항균제억제대크기로그항균제들의항균력의우열을비교할수는없음 - 증식이빠른 Enterobacteriaceae, S. aureus, P. aeruginosa 등을시험. - 영양요구성이큰세균인 H. influenzae, N. gonorrhoeae 및 S. pneumoniae, MRSA는배지, 접종균액, 판독방법등이다르다.

42 (1) 항균제디스크 디스크는 2-8 냉장고나 -14 이하의냉동고에보관. Penicillin류나 cephalosporin류의디스크장기간보관은냉동해야함. 사용중인디스크는 1주일간은냉장고에보관가능. 냉장했던디스크는실온에 1-2시간두었다가용기를열어야함. 디스크놓는기구는탈습제와함께뚜껑이꼭맞는용기에보관해야함. 유효기간확인후사용. (2) 배지 - Mueller-Hinton agar ( ph ) 사용. 배지두께약 4 mm. - 냉장고에보관하되 1주일이상보관할때는비닐주머니에넣어서보관함. -제조번호에따라서성능이다를수있으므로, 참조균주를시험하여억제대가허용범위에들어야함.

43 (3) 배지의접종 1 액체배양법 (growth method) 4-5 개의집락을 TSB 4-5 ml 에접종, 엷게혼탁될때까지 35, 2-5 시간배양 식염수나 TSB 로 McFarland 제 0.5 관표준탁도에맞춤 2 직접집락현탁법 (direct colony suspension method) 까다로운 Haemophilus influenzae, 임균, 폐렴사슬알균, methicillin - 탁도를맞춘후 20 분이내에평판에접종해야함. - 다른균종도직접집락현탁법으로부유액을만들수있으며, 배양시간을필요로 하지않으므로편리함.

44 (3) 배지의접종 - 면봉을이용해서과량의세균액을짜내고평판에한방향으로바르고이어서 120 o 돌려서바르고, 또한번 120 o 돌려서발라, 고르게접종하며, 마지막으로 면봉으로평판주위를돌려서접종함. - 배지표면을 3-5 분간말리고, 15 분이내에 disk dispenser 를써서디스크를놓는 다 ( 그림 6). 디스크는접시가장자리에서 15 mm 이상떨어져야한다. 100 mm Petri 접시에는 4-5 개, 150 mm Petri 접시에는 개디스크를놓음. - 핀셋끝으로디스크를눌러서배지표면에밀착시킴. 디스크를놓고 15 분이내 에 35 공기중항온기에넣어배양한다. Haemophilus 와 N. gonorrhoeae 는 5-7% CO 2 항온기에다른세균은보통항온기에서배양함.

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46 그림 6. 항균제디스크를놓기위한 disk dispenser (Becton Dickinson.)

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55 (4) 결과판독 시간또는규정된시간배양후에억제대지름을 caliper 나자를써서 mm 단위로 잼 ( 그림 7). - S. aureus oxacillin 또는 vancomycin 내성과 Enterococcus vancomycin 내성판독 24시간배양, 투과광선사용, 미세한집락이라도있으면내성으로판단함. - 첨가물을넣지않은배지는접시뒤쪽에서잼. 검은색배경에반사광선으로관찰. 불투명한배지의억제대는배지표면에서잼. -일반적으로증식이완전히억제된곳까지의지름을잼. 세밀히관찰하거나, 투과광선이나확대경을써야만관찰되는미세한집락은무시함. -억제대안큰집락 : 대개내성변이주또는오염균이므로동정과감수성시험을다함. Sulfonamide나 trimethoprim-sulfamethoxazole (cotrimoxzole) 의억제대중에엷게증식된집락 : 무시하고 80% 가억제된곳, 즉두껍게증식된가장자리까지를잼. Proteus의유주는무시하고, 진한증식이끝난곳까지를잼.

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59 그림 7. 디스크확산법 (disk diffusion method) 감수성시험. 억제대의지름을검은색을배경으로배지뒤쪽에서잼.

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61 4) 특별한세균의감수성시험 - 영양요구성이큰세균을시험하려면방법을달리해야함. - 몇가지종류의항균제에대한내성은방법을달리해야함 ( 표 5) -CLSI (M45-A Vol 26 No. 19) 에는아래균주의감수성시험지침이따로있음. Abiotrophia와 Granulicatella, Aeromonas, Bacillus anthracis, Corynebacterium, Erysipelothrix, Haemophilus, Actinobacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, Moraxella, Pasteurella, Pediococcus, Vibrio spp.

62 표 5. 균종별디스크법감수성시험의조건 세균배지접종방법 배양 시간가스환경참고 Enterobacteriaceae MHA DCS/GM 공기 P. aeruginosa MHA DCS/GM 공기 Acinetobacter, B. MHA DCS/GM 공기 cepacia, S. maltophilia Haemophilus HTM DCS % CO 2 β-lactamase 시험필요. N. gonorrhoeae GC-DS DCS CO 2 β-lactamase 시험필요. N. meningitidis BMHA DCS CO 2 Staphylococus MHA DCS 공기 Oxacillin: 투과광선관찰. (OXA, VAN: 24) Enterococcus MHA DCS/GM 공기 Vancomycin: 투과광선관찰. (VAN: 24) S. pneumoniae BMHA DCS CO 2 Oxacillin 디스크를 β-lactam 감수성을선별하기위해씀 Streptococcus BMHA DCS CO 2 M. catarrhalis MHA DCS 공기필요시 β-lactamase 시험 CLSI (2009) 에서인용. 약어 : MHA, Mueller-Hinton agar; BHMA, 5% 면양혈액첨가 MHA; GC-DS, defined supplement 를넣은 GC agar base; HTM, Haemophilus test medium; DCS, direct colony suspension 법 ; GM, 액체배지에서증균하여탁도를맞추는 growth method. OXA, oxacillin; VAN, vancomycin. 배양온도는임균은 36 이고, 다른세균은 35 o C 이며 5% CO 2 농도임.

63 (1) Haemophilus influenzae - CLSI 법 : Hemophilus test medium (HTH) 의사용을권장. - 초콜릿우무배지집락을 MH broth 에풀어서 McFarland 0.5 관탁도의균액을 만들어접종. 5% CO 2 항온기에서 시간배양한후판독. - β-lactamase 시험으로 penicillin, ampicllin 이나 amoxicillin 내성을알아볼수 있음.

64 (2) Neisseria gonorrhoeae - GC-DS 배지 : GC agar 를멸균후 defined supplement 를 1% 첨가. - 접종균액은초콜릿우무배지에서하룻밤배양한집락을 MH broth 에풀어서 McFarland 0.5 관탁도로맞춤. 면봉으로세균을배지에접종하고디스크를놓 은후, 35 의 5% CO 2 항온기에서 시간배양한뒤에판독. - β-lactamase 생성균주는 penicillin G 10 U 디스크에의한억제대가대개 19 mm.

65 (3) Neisseria meningitidis -혈액우무(Blood agar plate) 배지 MHA supplemented with 5% sheep blood - 접종균액은초콜릿우무배지에서하룻밤배양한집락을 MH broth에풀어서 McFarland 0.5관탁도로맞춤. 면봉으로세균을배지에접종하고디스크를놓은후, 35 의 5% CO 2 항온기에서 20-24시간배양한뒤에판독. - Neisseria meningitidis 의디스크법 ampicillin 과 penicillin 감수성시험 신빙성이낮으므로 CLSI (2012) 기준이없으며, MIC 를시험해야함.

66 (3) Streptococcus pneumoniae 의 penicillin G 내성 Penicillin 내성선별시험 : Oxacillin disk screening test -Penicillin 의 MIC 해석기준 ; 수막염에서분리된경우 : Peniciilin MIC 0.06 ug/ml 감수성, 0.12 내성. 다른검체분리된균주 : 2 ug/ml 감수성, 8 ug/ml 내성 (CLSI, 2009). -Ceftazidime, cefixime, ceftibuten은폐렴알균에대한항균력이약하나, 다른 β-lactam제는penicillin 감수성인폐렴구균에대해항균력이있음. - Penicillin에중간감수성인폐렴알균에의한수막염이외의감염은 penicillin으로치료가되지만수막염은 penicillin이나 cefotaxime으로치료가안되는경우가있음 -척수액분리된균주 : penicillin, cefotaxime 또는 ceftriaxone 또는meropenem 에대한감수성시험이필요함.

67 (3) Streptococcus pneumoniae 의 penicillin G 내성 계속 - Penicillin 내성선별시험 (screening test): Oxacillin 디스크법이널리사용. - 배지와디스크 : 혈액우무 (5% 혈액첨가된 MH agar) 배지, 1 ug oxacillin 디스크. - Penicillin 10 U 디스크로는감수성이저하된균주가검출되지않음. Oxacillin 디스크시험하고억제대가 19 mm이면 penicillin에중간또는내성으로판단함 ( 선별시험임 ) - Penicillin 내성균주중 : cephalosporin 감수성과내성균주가있어서척수액에서분리된균주에대해서는 MIC를시험해야함. - 수막염분리균주기준 : 감수성은 cefotaxime MIC 0.5 ug/ml, 내성 : 2 ug/ml. Cefotaxime 결과는 ceftriaxone에도적용함. - Meropenem은 MIC 0.25 ug/ml를감수성, 1 ug/ml를내성으로해석함. - 수시로 MIC를시험하기위해서는 Etest를쓰는것이편리함.

68 (4) Methicillin (oxacillin) 내성 Staphylococcus - Methicillin (penicillinase에안정한 penicillin, 즉 methicillin, oxacillin, nafcillin) 내성은정확히시험하기어려움. -Methicillin 내성기전 meca gene penicillin-binding protein (PBP) 2a MRSA or MRS - Methicillin resistant S. aureus (MRSA) Heteroresistance형 : 일부만내성, 특별한배양조건에서만내성을보임, 1 MRSA 디스크법 (ⅰ)Methicillin 디스크는불안정하므로 oxacillin 디스크사용 (ⅱ) 접종균액 : 직접집락현탁법 (direct colony suspension method) 사용 (ⅲ) 37 가아니고, 35 에, 18시간이아니고 24시간배양한후에판독. 반사광선이아니고투과광선으로관찰. 디스크주변에엷은증식이나, 소수의집락이있어도내성으로판독.

69 (4) Methicillin 내성 Staphylococcus 계속 - Oxacillin 내성포도알균은 methicillin 내성으로부름 - 모든 β-lactam 항균제 (penicillin, cephalosporin, carbapenem 및 β-lactam 과 β-lactamase 저해제복합제 ): 감수성일지라도내성보고. -MRSA 검출 Oxacillin (1 ug) 디스크대신에 cefoxitin (30 ug) 디스크의사용이권장. Oxacillin디스크법보다 cefoxitin 디스크법이판독이쉽다. -S. epidermidis 이외의 coagulase 음성 Staphylococcus를 oxacillin 디스크로시험할때 : 위내성결과를보일수있는데, cefoxtin 디스크법은감도는같지만특이도가더높다. -디스크법및희석법으로 methicillin 내성감별기준 : S. aureus와 coagulase 음성 Staphylococcus에대해서다르다

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71 2 Oxacillin salt-agar 선별법 - MRSA 선별시험배지 : MH agar + NaCl 4% + oxacillin 6 ug/ml. - 접종균액 : 직접집락현탁법즉 0.5관 McFarland standard - 접종 : 1 1 ul 백금이로 mm의지름이되게접종. 2 면봉을세균액에담갔다가짜내고배지에 mm의넓이로접종. - 배양 : (37 가아님 ), 공기항온기, 24시간배양한후, 투과광선관찰 - 판독 : 집락이 2개이상, 엷은증식이있으면 oxacillin 내성선별시험양성, meca 유전자를가지고있음을시사. - meca 유전자있으나 heteroresistance형이므로 oxacillin MIC가 4 ug/ml인균주는이방법으로검출되기어렵다. 이러한균주는 cefoxitin 디스크법으로더잘검출. 이방법은 coagulase 음성 Staphylococcus 의 methicillin 내성선별법으로권장되지않는다

72 (5) Vancomycin 내성 Staphylococcus aureus - S. aureus vancomycin (VM) 감수성기준 감수성 2 ug/ml, 중간 4-8 ug/ml. 내성 16 ug/ml. - Coagulase 음성 Staphylococcus의 vancomycin MIC 기준 : 감수성 4 ug/ml; 중간 8-16 ug/ml; 32 ug/ml가내성. - Vancomycin(glycopeptide) intermediate S. aureus (VISA 또는 GISA) 일본에서처음보고 (1997), 한국 (1999) 등세계여러나라에서도분리됨 - Vancomycin-resistant S. aureus (VRSA) MIC ug/ml, 미국에서처음보고 (2002). - 디스크법 : VM 감수성 (MIC 2 ug/ml) 과 VM 중간감수성 (MIC4-8 ug/ml) 균주가구별않됨. CLSI (2009) 법에는 VRSA 선별디스크법없음, 우무희석선별법권장. VRSA 우무희석법을써서통상으로선별하기는어렵다.

73 (5) Vancomycin 내성 Staphylococcus 계속 -Vancomycin 감수성저하균주의선별법 배지 : BHI agar + Vancomycin 6 ug/ml. 균액준비 : 직접집락현탁법사용 접종 2가지방법 1 10 ul를배지에접종. 2 면봉으로 mm 지름으로접종. 배양 : 35 공기환경에 24시간배양. 판독 - 2개이상의잡락이생기거나투과광선으로관찰하여엷은증식이있으면 vancomycin감수성저하세균의예비시험양성임. - MIC를시험하여확인해야함.

74 (6) Mupirocin 내성 Staphylococcus - Mupirocin P. fluorescens가생성하는항균제, 피부감염치료제로연고나크림제 (Bactroban) 로사용 세균 isoleucyl-trna synthetase저해 단백질합성저해로항균작용 MRSA 또는 MSSA항균력이큼, 특히비강내보균 MRSA 제거목적으로도사용 - 고도 (High-level) mupirocin 내성 S. aureus: Mupirocin MIC 512 μg /ml by plasmid-mediated mupa gene - 저도 (Low- level) mupirocin 내성 S. aureus: Mupirocin MIC μg /ml 염색체에위치한 IIeS-2 gene 점변이에의해서내성

75 (6) Mupirocin 내성 Staphylococcus- 계속 - 고도 mupirocin 내성 S. aureus 검출 디스크확산법또는액체배지미량희석법 (microdilution broth method) -디스크확산법 디스크 : Mupirocin 200- μg디스크 배양시간 : 24시간 결과 : mupa negative : Mupirocin 200- μg디스크, >18 mm mupa positive : Mupirocin 200- μg디스크, no zone - 액체배지미량희석법 (microdilution broth method) Mupirocin MIC 512 μg /ml : 고도 mupirocin 내성 Mupirocin MIC 256 μg /ml : 저도 mupirocin 내성

76 (7) 유도성 clindamycin 내성 Staphylococcus - Macrolide와 clindamycin 작용기전 : 단백질합성저해. - 내성기전중유출로인한 M형 Macrolide에대해서만내성이며, 그유전자는 msra. -다른내성인 MLS B 형 Macrolide, lincosamide 및 streptogramin B에내성, 그유전자는 erm. -Staphylococcus의 MLS B 형내성 : 구성형 (constitutive) + 유도형 (inducive). -유도형 MLS B 내성균 보통방법시험 : Clindamycin 감수성, erythromycin에유도되면내성보임. Erythromycin 내성이면서 clindamycin 감수성균주 : 유도성으로 clindamycin에내성인지시험해야하다.

77 (7) 유도성 clindamycin 내성 Staphylococcus - 계속 - Disk법유도성 clindamycin 내성 Clindamycin 디스크옆 mm 거리 + Erythromycin 디스크 배양후 clindamycin 억제대가 D자처럼찌그러지면양성이고 clindamyin에내성으로보고 자동으로디스크를놓는기구 : 한가지디스크를손으로놓는다. 보통의액체배지법 : 유도성 clindamycin을검출할수없음. - Erythromycin 비감수성, clindamycin 감수성균주중 D zone 시험양성 ( 유도성 clindamycin 내성 ) 균주 : MRSA 중 32%, MSSA : 35%, MRCNS : 90%, MSCNS: 94% 가보고됨 (Lim HS, 2004).

78 그림 8. S. aureus 의유도성 MLS B 내성시험 (D-zone 시험 ). Erythromycin 디스크 (E) 에의해내성이유도되어 clindamycin (CL) 의억 제대가 D 자모양으로작아진양성결과.

79 Clindamycin 유도내성

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81 (8) Enterococcus 의 g1ycopeptide 내성 - Vancomycin 디스크법 : 디스크 : Vancomycin 30 ug 배양시간 : 만 24시간 판독 : 투과광선사용, 17 mm 이상억제대면감수성으로해석, 억제대 14 mm이거나억제대안에엷은증식이면내성으로판독. 중간감수성결과균주 : MIC 시험권장함. - Teicoplanin 디스크법 : 14 mm억제대면감수성, 10 mm를내성해석. - 우무배지선별법 배지 : BHIA + Vancomycin 6 ug/ml. 세균부유액 : 직접집락현탁법사용. 접종 : 1-10 ul를접종. 35 에만 24시간배양한후에관찰. 판독 : 2개이상의집락이생겼거나희미한증식이있어도내성으로판독.

82 (8) Enterococcus 의고농도 aminoglycoside 내성 - 장알균요로감염 : β-lactam제로치료가잘됨, - 심내막염, 균혈증, 수막염, 골수염등 : 한가지약제로는치료가잘안됨, -상승효과위해 β-lactam제나 glycopeptide와 aminoglycoside의병합요법을사용. - Aminoglycoside에고도내성세균 : 상승효과가없음. - 고농도 aminoglycoside 내성시험이필요. -고농도 aminoglycoside 내성시험 1 우무희석법 2액체배지미량희석법 3 디스크확산법 - 장알균이분리시시험방법 디스크확산법이나액체배지희석법이편리 ( 시험방법은표 1-10).

83 표 7. Enterococcus 의고농도 aminoglycoside 내성시험 방법배지접종균수 (CFU) 배양시 간 Gentamicin 항균제농도 Streptomycin 판독 우무희석법 BHIA McFarland 0.5 관 24, 48 a 500 ug/ml 2000 ug/ml >1 집락은내성 10 ul (10 6 ) 액체배지 BHIB McFarland 0.5 관 24, 48 a 500 ug/ml 1000 ug/ml 조금이라도증식은내성 미량희석법 (5 x 10 4 /0.1 ml) 디스크 MHA McFarland 0.5 관 ug/ 300 ug/ 억제대 (mm) 6 은내성, 7-9 는불 확산법 디스크 디스크 확실, 10 은감수성 CLSI (2009) 및 MCM (2007) P 에서인용. 약어 : BHIA, brain heart infusion agar; BHI B, brain heart infusion broth. a 24 시간배양후에 streptomycin 에증식이없으면다시 24 시간배양.

84 (8) Enterococcus 의고농도 aminoglycoside 내성 - 계속 1 디스크확산법 - 배지 : MH agar. - 디스크 : Gentamicin 120 ug과 streptomycin 300 ug 디스크두가지사용. - 균주부유액 : McFarland 0.5관의탁도로맞춘부유액, - 배양 : 접종후 35 공기중항온기에서 18-24시간배양. - 판독 10 mm 이상의억제대가있으면감수성으로판단. 7-9 mm의억제대균주는대부분이고농도내성이지만, MIC가그다지높지않은일부균주가이범위의억제대를보일수있으므로그결과가불확실. 이러한균주는표준희석법으로확인. 억제대가전혀없으면 (6 mm) 고도내성으로판단함.

85 (8) Enterococcus 의고농도 aminoglycoside 내성 - 계속 2 우무희석선별법 -배지: Brain heart infusion agar (BHIA) + 각각 gentamicin 500 ug/ml와 streptomycin 2,000 ug/ml를넣음. -세균부유액: 18-24시간배양한세균을 McFarland 0.5관의탁도로맞추고 10 ul를접종하여 10 6 CFU가되게접종. -배양: 35 에만 24시간배양한후에판독. - 판독 집락 1개이상이생기거나엷은증식이있어도내성으로판독. Streptomycin 첨가배지에 24시간후증식이없을때는 24시간더배양한후에다시판독.

86 (8) Enterococcus 의고농도 aminoglycoside 내성 - 계속 3 액체배지미량희석법 - 배지 : Brain heart infusion broth (BHIB). MH broth는증식이않좋음 - 항균제농도 : Gentamicin 500 ug/ml, streptomycin 1,000 ug/ml. - 접종량 : McFarland 0.5관의탁도 1: 20 희석후 5 x 10 5 ( 한 well 당배지는 0.1 ml이고, 접종균수는 5 x 10 4 가됨 ). - 배양 : 35, 공기중배양기, 만 24시간 - 판독 : 조금이라도증식이있으면내성

87 (9) Etest - 대상균주 느리게증식, 특별한배양조건세균, 즉 1 신속증식 Mycobacterium, 2 무산소성세균, 3수막알균, 4폐렴알균, 및 5진균등 MIC를 Etest (biomereux, 종전의 AB BIODISK, Solna, Sweden) 로시험할수있음 ( 그림 9). - 수시로소수의균주를시험하기편리, 우무희석법과상관관계가좋음. - 세균의접종량, 배지의성분과 ph, 가스환경과배양기간, 판독방법에따라서결과가달라질수있음. - Staphylococcus methicillin 이나 oxacillin 감수성을시험 Mueller-Hinton agar + NaCl 2% 되게넣음. 다른세균을시험할때는 표 8. 의조건으로시험해야한다.

88 그림 9. Etest strip 을이용한 Streptococcus pneumoniae 에대한 penicillin G 의 MIC 시험. Streptococcus pneumoniae penicillin G MIC = 0.64 μg /ml.

89 표 8. 시험할균종에따른 Etest 의시험조건 세균배지접종세균부유 시간 배양 가스환경 Enterobacteriaceae MHA DCS/GM 공기 Pseudomonas aeruginosa MHA DCS/GM 공기 Stenotrophomonas maltophilia MHA DCS/GM 24 공기 Acinetobacter spp. MHA DCS/GM 24 공기 Haemophilus spp. HTM DCS CO 2 Staphylococcus spp. MHA (oxacillin 시험배지에는 2% NaCl 넣음 ) DCS (oxacillin 과 vancomycin 은 24) 공기 Enterococcus spp. MHA DCS/GM 24 (HLAR 은 48) 공기 Streptococcus spp. BMHA DCS 24 CO 2 Streptococcus pneumoniae BMHA DCS CO 2 Corynebacterium spp. BMHA DCS (JK 균은 48) 공기 Eikenella corrodens BMHA DCS CO 2 Listeria monocytogenes BMHA DCS 공기 Moraxella catarrhalis MHA DCS CO 2 Neisseria gonorrhoeae GC-DS DCS CO 2 Neisseria meningitidis BMHA/CMHA DCS 24 CO 2 Pasteurella multocida BMHA DCS 공기 Anaerobes BBA DCS/GM 무산소성 Isenberg: Clin Microbiol Proc Handbook (2006) P 에서인용. 약어 : BBA, hemin, vitain K1 및혈액첨가 brcella agar; BHMA, 5% 면양혈액첨가 MHA; CMHA, chocolate MHA; GC-DS, defined supplement 를넣은 GC agar base; HLAR, high level aminoglycoside resistance; HTM, Haemoph ilus test medium; MHA, Mueller-Hinton agar; DCS, direct colony suspension 법 ; GM, 액체배지에서증균하여탁도를맞추는 growth method.

90 (10) β-lactamase 시험 1 통상의 β-lactamase 시험 - H. influenzae, N. gonorrhoeae, M. catarrhalis집락에서 β-lactamase 생성 신속시험. - S. aureus는 penicillin 내성인균주는 β-lactamase 양성으로간주함. - Chromogenic cephalosporin법이 β-lactamase 생성시험으로널리쓰임. Chromogenic cephalosporin인 nitrocefin이들어있는 cefinase 디스크 (BBL) 등이편리하고감도가높다. 디스크를물로축이고시험세균을문지른다음노란색이분홍이면양성. 대개 5분이내에반응이나타나지만 S. aureus는 1시간이걸릴때도있음. - β-lactamase 시험 : 치료제선택을위해 Enterobacteriaceae, 포도당비발효 그람음성막대균및 Bacteroides fragilis 군의시험을권장되지않음.

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95 β-lactamase 분류 아미노산 1차서열에따른 Ambler 분류법 : class A, B, C, D Class A는주로 penicillin 계열의항균제를잘분해하는 penicillinase, penicillin 내성, 황색포도구균의 β-lactamase, 장내세균에 ampicillin, cephalosporin 내성을일으키는 TEM-1, SHV-1 등의효소, ESBL이속한다. plasmid에내성유전자가존재하여균간전이가가능하며 clavulanic acid에억제

96 β-lactamase 분류 Class B, β-lactamase 는효소의활성에아연을필요로하는 metaloenzyme 으로서 P. aeruginosa, S. maltophilia, Acinetobacter spp 등이고, Enterobacteriaceae 균종중에서도드물게보고 Class C 효소는주로 cephalosporin을잘분해하는 cephalosporinase 로그람음성균의염색체성 β-lactamase 이며흔히 AmpC 효소로불리운다. Class D 효소는 penicillinase 이나특히 oxacillin 의분해능이뛰어나며주로녹농균, 대장균에서발견

97 Lorian 4 판 p.525 Table 12.11

98 19 1 ESBL(Extended-spectrum-ß-lactamase) 은그이름처럼활성범위가매우넓은효소로 Carbapenem 과 Cephamycin 을제외한 ß-lactam 항균제대부분을가수분해한다. 이들효소는 TEM-1, TEM-2 혹은 SHV-1 의아미노산중 1-4개가유전자의점변이에의하여다른아미노산으로치환됨으로서제 3세대 Cephalosporin 에대한가수분해활성을지닌다. 유전자의분자구조에따른분류에선 Class A, Bush 등의효소기질특이성과억제특이성에따른분류에선 2be군에속하며, 유전자형은 TEM형은 172종류, SHV형은 127종류, CTX-M형은 90종류, OXA형은 158 종류이며 Toho, PER, VEB, GES, CME, TLO, BES,TLA, SFO, IBC형등이있다.

99 ESBL 종류 TEM형 : E. coli 가분리된그리스환자의이름 Temoniera 에서유래 SHV형 : sulphhydryl variable. ( 국내, K.pneumoniae 에서 SHV-12 가가장유행하는 ESBL형 ) CTX-M형 : ceftazidime보다 cefotaxime을더잘분해 ( 국내,E.Coli 에서 CTX-M14,15 가가장유행하는 ESBL형 ) OXA형 : ceftazidime 내성, oxacillin, cloxacillin을가수분해 PER형 : P. aeruginosa 에서관찰 B-LACTAMASE : 340종류 ESBL : 200종이상 TEM형 B-LACTAMASE : 172 종류 SHV형 B-LACTAMASE : 127 종류 OXA형 B-LACTAMASE : 158 종류 PER형 B-LACTAMASE : 5 종류 CTX-M형 B-LACTAMASE : 90 종류

100 (2) Extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 시험 - E. coli나 K. pneumoniae 등 ampicillin 내성 (TEM 및 SHV 등β-lactamase) 유전자는점변이 (point mutation) 를일으키면 모든 penicillin계, 제1세대, 3세대 cephalosporin (extended spectrum cephalosporin; 예, cefotaxime, ceftriaxone, ceftizoxime, ceftazidime), 및제4세대 cephalosporin계 (cefoxitin 등 cephamycin계는제외 ) 와 aztreonam에내성, Clavulanic acid 등의저해제에저해 ( 감수성 ) Cephamycin (cefoxitin 등 ), carbapenem 분해하지못함 ( 감수성 ) 이런 β-lactamase를 ESBL이라고함. - 현재 CLSI (2012) 가권장하는 ESBL 검출대상세균 E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca 및 P. mirabilis 뿐이나늘어나고있음

101 -ESBL 생성균선별방법 : 액체배지법과디스크법 ESBL 생성균제 3 세대 cephalosporin 내성수준은낮은경우가있음. 보통의감수성시험으로쉽게검출되지않을수도있음. 따라서별도의선별시험기준을쓰고확인시험을함. - 확인시험에서두항균제중한가지만이라도 clavulanic acid 에의해서디스크억제대 : 5 mm 커지거나 ( 표 9.), MIC 가 1/8 이하로낮아지면 ( 표 10. ) 양성으로판단. - ESBL 생성균 : 모든 penicillin계, cephalosporin계 (cefoxitin 등 cephamycin계는제외 ) 및 aztreonam에내성으로보고. - 정도관리 : K. pneumoniae ATCC 를사용 ( 표 9, 10.). - Etest로도 ESBL 생성균을시험할수있으나 strip의값이비쌈 ( 그림 10.).

102 표 9. ESBL 생성 E coli, K. pneumoniae, K. oxytoca 및 P. mirabilis 의디스크법선별과확인 항균제 ( 디스크중농도, ug) 선별시험양성기준억제대 (mm) ECO, KP P. mirab N, KOX ilis 억제대 (mm) 확인시험양성기준 ( 억제대의차, 정도관리허용범위억제대 (mm) (K. pneumoniae ATCC ) mm) Cefpodoxime (10) Ceftazidime (30) (A) (E) Ceftazidime/clavul anic acid (30/10) - - (B) (B)-(A) = 5 (F); (E)-(F) = 5 Cefotaxime (30) (C) (G) Cefotaxime/clavul anic acid (30/10) - - (D) (D)-(C) = 5 (H); (G)-(H) = 3 Ceftriaxone (30) Aztreonam (30) CLSI (2009) 에서인용. 약어 : ECO, E. coli; KPN, K. pneumoniae; KOX. K oxytoca.

103 표 10. ESBL 생성 E coli, K. pneumoniae, K. oxytoca 및 P. mirabilis 의액체배지희석법선별과확인 항균제 선별시험양성기준 (ug/ml) ECO, KP P. mira N, KOX bilis 시험범위 확인시험 (ug/ml) MIC 양성기준 (MIC 의차 ) 정도관리허용범위 MIC (ug/ml) (K. pneumoniae ATCC ) Cefpodoxime Ceftazidime (A) 2 (E) Ceftazidime/clavulan ic acid /4-128/4 (B) (A) 가 (B) 의 8 배 (F); (E) 가 (F) 의 8 배 Cefotaxime (C) 2 (G) Cefotaxime/clavulan ic acid /4-64/4 (D) (C) 가 (D) 의 8 배 (H); (G) 가 (H) 의 8 배 Ceftriaxone, aztreon am 1 2 CLSI (2009) 에서인용. 약어 : ECO, E. coli; KPN, K. pneumoniae; KOX. K oxytoca.

104 ESBL 선별시험 1) 디스크확산법 cefpodoxime, ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone 혹은 aztreonam 대한감수성을시험하여 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 기준에따라선별한다. (ESBL 선별 ) Cefpodoxime 억제대 17mm, Ceftazidime 22mm, Aztreonam 27mm Cefotaxime 27mm, Ceftriaxone 25mm ESBL 생성추정함

105 - Double disk synergy (DDS) 시험 CLSI 권장방법안들어있으나 ESBL 생성균검출에널리이용됨. -방법 디스크확산법에따라서접종한 MH agar에 amoxicillin-clavulanic acid 디스크 ( 각각 10 ug/ml) 를중앙에놓고, 그옆 mm ( 중심과중심 ) 에 ceftazidime, cefotaxime 등제3세대 disk를놓고배양하여억제대가커지면양성으로판단 통상감수성시험시에이들디스크를적절한위치에놓으면 24시간후에그결과를알수있음. 균주에따라디스크사이의거리에따라서불확실한결과를보일수있으며, 이경우에는거리를달리하여재시험을해야함.

106 2) Double disk synergy 법 ESBL 선별시험 McFarland 0.5 균부유액 Mueller-Hinton agar 중앙에 amoxicillin-clavulanate acid (AMC) 디스크를놓은다음, 주변에 cefotaxime, ceftazidime, aztreonam, cepefime 등의디스크를 1.5~2 cm간격으로놓는다. 35 에서하룻밤배양후 cefotaxime, ceftazidime, cepefime 혹은 aztreonam 디스크에의한억제대가 amoxicilln-clavulanate acid 디스크쪽으로확장되거나 ( 상승효과 ) 새로운억제대가생기면양성으로판정한다

107 ESBL(Extended-spectrum-β-lactamase) ESBL+ ESBL+ ampc+ CAZ CTX FEP CTX FEP 확인시험 : 양성 CAZ CTX FEP CAZ ATM + CA10μl + CA10μl + CA10μl CAZ AMC CTX CTT CAZ CTX FEP CTT + BA10μl + BA10μl + BA10μl + BA10μl ATM AMC FEP DDS 시험 : 양성 CAZ + CA10 μl + BA10 μl CTX + CA10 μl + BA10 μl FEP + CA10 μl + BA10 μl DDS 시험 IPD 시험 Boronic Acid Disk Test

108 그림 10. Etest 에의한 ESBL 생성검출. 항균제의위치는위 strip 은 cefotaxime + clavulanate (CTL) 와 cefotaxime (CT), 아래 strip 은 ceftazidime + clavulanate (TZL) 와 ceftzidime(tz) 이다. Clavulanate 에의해서 MIC 가 1/8 이하로낮아지면양성으로판단한다.

109 * Carbapenem Imipenem,meropenem,ertapenem,doripenem 분자량이적음 양성하전및친수성구조 ( 세포막을잘통과함 ) 항균범위가가장넓고, ESBL 이나 AmpC ß-lactamase 를포함한 Class A, C 및 D ß-lactamase 에안정한가장강력한 ß- lactamase 제 Automated instruments unreliable - Reduced carbapenem susceptibility may be missed - Expert system poor, sometimes misleading

110 * Carbapenem 제내성기전 PBP 의변화 : 매우드뭄 염색체성 AmpC 다량생성 항균제의투과성감소 - 세포외막단백질 (OMP, Porin) 의소실 Efflux system 의고도발현 Carbapenemase 의생성

111 * Carbapenemases 의종류 Class A 1. Inhibited by clavulanate, but not EDTA 2. KPC1-11, IMI-1,2, SME1-3, NMC-A, GES 2,4,5,6,8, SHV-38, SFC-1 Class B (Metallo-ß-lactamase) 1. Divalent cation(zinc) dependent (inhibited by chelators such as EDTA) 2. IMP 1-27, VIM 1-24, SPM-1, GIM-1, SIM-1, KHM, NDM-1, AIM Class D 1. Poorly inhibited by clavulanate, not inhibited EDTA 2. OXA-23, OXA 24-26,40, OXA-51,64-71,78-79,80,82, OXA-58

112 (3) Carbapenemase 시험 - Enterobacteriaceae - K. pneumoniae 의 KPC-1 carbapenemase 를생성하여 ertapenem 내성세균출현. - Ertapenem 내성검출법추가 선별및확인법 CLSI (2009). - Carbapenem 중간혹은내성균주의확인시험 감염관리나역학적목적을위해서는필요. 표 1-15 에따라서변법 Hodge test 를시행.

113 (3) Carbapenemase 시험 Enterobacteriaceae - 계속 -Carbapenemase 선별시험 Modified Hodge test - Ertapenem 디스크사용 - Carbapenemase 확인시험 Etest MBL Double disk synergy - imipenem 디스크와 EDTA 등의저해제디스크사용

114 Cabapenemase screening criteria Initial screen Test method DD Broth microdilution medium MHA CAMHB Ertapenem: mm Meropenem: mm Ertapanem: 2 μg/ml IPM or MEM: 2-4 μg/ml (note: IPM disk test performs poorly as a screen for carbapenemase)

115 Screening of carbapenemase Modified Hodge test E.coli ATCC25922 를 Mac 0.5 로맞춘뒤 10 배희석 M-H 배지에고르게접종 35, 10 분방치 하룻밤배양 시험균주로진하게획선접종. Meropenem 디스크를중앙에놓는다. 만곡된억제대있으면양성

116 Modified Hodge 시험 Ertapenem 10 ug Meropenem 10 ug disk E. coli ATCC McF 의 1/10 희석균액 음성 음성 양성

117 Modified Hodge Test McFarland 0.5 ATCC E.coli Test 균주 MEM KPC 생성균주 117

118 Ⅲ. Metallo-ß-lactamase 검출시험 1. Double disk synergy 시험. imipenem-edta (Lee et al) ceftazidime-2-mecaptopropionic acid 디스크 (Arakawa) imipenem-sodium mercaptoacetic acid + EDTA 2. Hodge 시험. 3. E test MBL strip 시험. 4. KPC+MBL ID kit 5. PCR 시험

119 Imipenem- EDTA DDST 와 IPD test IPM disk 공디스크 + 10 μl 0.5M EDTA 10 μl 0.5M EDTA + IPM

120 그림 11. Metallo-β-lactamase 검출을위한 Double disk synergy 시험. Imipnem (IPM) 디스크와 EDTA + SMA 디스크사용. Metallo-β-lactamase 양성 ( 위 ) 과음성 ( 아래 ) 세균. Sodium mercaptoacetic acid(sma); Imipenem(IPM).

121 Imipenem 32 μg /ml Imipenem <1 μg /ml 그림 10. Etest MBL 에의한 metallo-β-lactamase 생성검출. Imipnem (IP) 의 MIC 가 IPE (imipenem + EDTA) 의 EDTA 에의해서 1/8 이하로낮아지면양성으로판단.

122 Metallo-β-lactamase(IMP-1) (KPC+MBL ID kit)

123 KPC cabapenemase(kpc-2)

124 항균제작용의기본원리

125 정의 (definitions) 항생제 (antibiotics) 미생물에의해생성되어, 다른미생물을죽이거나그성장을억제하는물질로서항균제의한갈래이다 년 Waksman 이처음으로사용했다. 항균제 ( 항미생물제제, antimicrobial drugs) 미생물 ( 세균, 진균, 바이러스 ) 감염증치료에쓰이는약물 화학요법 (chemotherapy) 미생물이나암에선택적으로작용하는화학물질을이용한치료를의미하는의미로쓰인다.

126 항균제의조건 인체 ( 숙주 ) 에게독성없이병원균에만 선택적으로작용해야 인체에빠르게침투하고효과가오래 지속되야 세균에쉽게내성을획득하지못해야

127 Classification III ; Bacterostatic vs.bactericidal Antibiotics 살균제 (bactericidal drugs) 세균의세포벽형성에장애를초래하거나세포막의투과성을변화시키는등의위해를가하여죽게하는약물을말한다. 정균제 (bacteriostatic drugs) 핵산이나각종단백질의합성을방해하여세균의증식을억제함으로써체내면역기전에의한박멸을보조하는약물을말한다.

128 History of Antibiotics Penicillin (1928); first clinically useful antibiotics, Alexander Fleming

129 War-History : Human vs. Bacteria 1942 : Penicillin 사용 1948 : Penicillinase-producing bacteria 출현 beta-lactamase stable penicillin 1961 : MRSA, 영국 1983 : ESBL, 독일 1988 : VRE, 프랑스 1997 : VISA, 일본 2002 : VRSA, 미국

130 베타락탐항균제

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136 항생제의작용기전 1. 세포벽합성저해 (Beta - Lactam 계 ) 세포벽은세균의형태를유지하게하는기관으로계속합성되야하는데그과정에작용하는효소인 transpeptidase에잘결합하는특성이있어 PBP(penicillin binding protein) 이라고부른다. Penicillin은 PBP에결합하여세포벽합성을저해한다. STAPHYLOCOCCUS STAPHYLOCOCCUS ON PENICILLINS Penicillin Cephalosporin Cabapenem

137 항생제의작용기전 2. 세포막파괴 양이온성세제와유사하게 gram(-) 세균의세포막을파괴한다 ( 살균성 ) Polypeptide (Bacitracin) Polymixuns(Colistin, Polymyxin B)

138 항생제의작용기전 3. 단백질합성저해 Aminoglycoside (Gentamicin, Amikacin, Streptomycin..) mrna에서 start codon에결합하여단백질합성을시작하지못하게함 Tetracycline(Tetracycline) 30S Ribosome에결합하여 trna가 mrna의 codon을읽지못하게한다. Chloramphenicol Macrolide(Erythromycin, Azithromycin) 50S Ribosome에결합하여 30S Ribosome을분리시켜 Ribosome 형성을막는다. Lincosamide(Clindamycin)

139 항생제의작용기전 4. 대사작용방해 화학구조가내재성화합물과유사하여세포의대사를억제 Sulfonamide Isoniazid Ethanbutol Nitrofuran

140 Quinolone 5. DNA, RNA 합성저해 항생제의작용기전 Quinolone 은 DNA gyrase (topoisomerase II) 와 topoisomerase IV 에결합하여 DNA 합성을억제한다. Rifampin DNA RNA PROTEIN

141 Antibiotic resistance

142 내성균의출현 약물내성 (drug resistance) 숙주가견딜수있을만큼의항생제의최대농도로도세균의증식을억제하지못할경우 약물내성의종류 자연내성 (natural resistance) Insensitive strain 획득내성 (acquired resistance) 돌연변이 (mutation)

143 약물내성 DNA 의전이방법 1. Plasmid transfer 세균접합 (bacterial conjugation) 에의한다. 가장중요하다. 2. Transduction Phage 에의한형질도입이다. 3. Transformation Free DNA 에의한형질전환이다.

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146 How they express resistance 적극적으로맞서싸운다. Enzyme inactivation Bata-lactamase : beta-lactam 계항생제가파괴된다. R O C NH beta-lactam ring N q N O COOH Target for beta-lactamase Aminoglycoside modifying enzyme

147

148 How they express resistance 들어와도정착을못하게한다. Target 변형, 혹은아예없애버린다. Alteration of PBP(protein binding protein) : MRSA b-lactam peptido - glycan Cy ㅊㅊㅊㅊㄴ toplasmic membrane Mutant PBP PBP

149 How they express resistance Alteration of ribosome(aminoglycoside, marcrolide,cm etc..) Alteration of gyrase(quinolone) Aminoglycoside can t bind RNA Protein Ribosome 50S 30S

150 How they express resistance 원천봉쇄 : 못들어오게하고, 들어오더라도퍼낸다. Impairment of permeability to beta-lactam Efflus mechanism : quinolone, tetracycline 세포막투과성의감소 예, Pseudomonas aeruginosa 세포외로항생제의적극적인방출

151 항생제의내성

152 Classification I;Bacterial Targets for Antibiotics