<28B0A1C7F6BCF6C1A C0FD2DC3E0BCF6BBEAB9B020C0AFC7D8B9B0C1FA20BAD0BCAEB9FD20C6EDB6F E687770>

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3 발 간 사 최근 축 수산물의 소비가 급속히 늘어남에 따라 축산업 및 수산업도 점차 기업화, 대규모화 되고 있습니다. 이에 따라 질병 예방을 위해 사 용되는 동물용의약품과 환경으로부터 기인된 유해물질이 축 수산식품 에 잔류될 가능성이 더욱 높아가고 있습니다. 국제교역도 가속화되고 있 어 수입 축 수산식품의 안전성 관리도 더욱 강화되어야 할 시점입니다. 또한 한국인의 식생활에서도 동물성 단백질인 축 수산식품이 차지하는 비중이 날로 커짐에 따라 국민 건강 보호와 증진을 위하여 안전한 축 수산식품의 생산과 공급은 그 어느 때 보다도 중요하다 하겠습니다. 이러한 추세에 부응하기 위하여 저희 농림수산검역검사본부에서는 국내산 및 수입 축 수산물에 대하여 철저한 유해화학물질 검사를 실시하고 있습니다. 더불어 안전하고 위생적인 동물성식품의 생산기법 연구, 유해화학물질의 잔류 예방을 위한 첨단분석기술개발 등 동물성 식품의 안전성 확보를 위하여 다각적인 노력을 경주하고 있습니다. 특히 각종 유해화학물질 을 신속하고 정확하게 검출하기 위하여 초정밀 분석기기를 확보하고 전문가를 양성하는 등 세계 최고 수준의 전문성과 신뢰성을 유지하기 위하여 지속적인 연구와 노력을 기울이고 있 습니다. 이번 축 수산물 유해물질 분석법 편람 은 2009년도 우리 본부에서 펴낸 바 있는 축 산물의 유해물질 분석법 편람 - 동물약품 편 에 수산물의 잔류분석법을 추가 보완하여 최 신화 한 것으로 잔류검사 기술의 표준화와 국제화를 위하여 관련업무 담당자들간 최신 검사 기술을 공유하는데 그 취지가 있습니다. 이들 분석방법은 CODEX, 미국, EU 등에서 권장하 는 분석 지침을 최대한 준수하였습니다. 아울러 이번 편람에 수록된 잔류분석법들은 국내외 분석기법을 참고하여 일부 변형한 개량법이 포함되어 있으며 향후 보완 및 검증을 거쳐 공 정검사법으로 발전시켜 나가고자 합니다. 아무쪼록 이 편람이 축 수산물 안전관리를 담당하고 있는 저희 검역검사본부 뿐만 아니라 시 도 지자체 관련업무 담당자들에게 잔류화학물질 분석법의 기본원리와 세부방법을 익히 는데 지침서가 되길 바라며, 축 수산식품뿐 아니라 농산물의 안전성 확보에도 활용될 수 있 기를 기대합니다. 끝으로 바쁜 업무 수행 중에도 이 편람 발간을 위하여 수고하여 주신 직원 여러분께 깊이 감사드립니다. 농림수산검역검사본부장 수의학박사

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5 축산물의 잔류 동물용의약품 분석법 1 Ⅰ. 총 칙 3 II. 간 이 검 사 법 7 Ⅱ-1 식육의 잔류 항균물질 간이검사법 9 II-1-1. EEC 4-plate 법 11 II-1-2. 퀴놀론계 항균물질 간이검사법 17 II-1-3. 식품공전의 항균물질 간이검사법 19 Ⅱ-2 우유의 잔류 항균물질 간이검사법 23 II-2-1. TTC-II 법 23 II-2-2. 식품공전의 디스크법 26 Ⅱ-3 식용란의 잔류 항균물질 간이검사법 27 II-3-1. Four-plate법 27 II-3-2. 퀴놀론계 항균물질 간이검사법 30 Ⅱ-4 혈청 등 체액시료의 잔류 항균물질 간이검사법 32 II-4-1. 박층크로마토그래피 (SOS 검사) 32 II-4-2. 미생물학적 방법 (BmDA 법) 35 Ⅱ-5 신속간이검사킷트 소개 39 II-5-1. Premi Test kit 39 II-5-2. KIS (Kidney Inhibition Swab) Test kit 41 II-5-3. ROSA (Rapid One Step Assay) kit 43 II-5-4. SMART kit 45 II-5-5. SensiCheck kit 50 III. 미생물수용체법 (Charm II Receptor Assay) 55 Ⅳ. 축산물의 잔류 동물용의약품 동시 다계열 스크리닝법 65 V. 정밀정량검사법 79 Ⅴ-1 잔류 동물용의약품 확인정량검사 매뉴얼 81 Ⅴ-2 페니실린계 항균물질 분석법 89 Ⅴ-3 세팔로스포린계 항균물질 분석법 94

6 Ⅴ-4 테트라싸이클린계 동시 분석법 99 Ⅴ-5 마크로라이드계 항균물질 분석법 104 Ⅴ-6 아미노글리코사이드계 분석법 109 Ⅴ-7 설파제 및 답손, 오르메토프림, 트리메토프림 동시분석법 115 Ⅴ-8 퀴놀론계 항균물질의 동시분석법 121 Ⅴ-9 폴리에테르계 항균물질 분석법 128 Ⅴ-10 항원충제 잔류분석법 132 Ⅴ-11 구충제 (벤지미다졸계, 아버멕틴계, 레바미졸, 클로산텔 등) 분석법 137 Ⅴ-12 암페니콜계열 분석법 141 Ⅴ-13 β- agonists (클렌부테롤, 락토파민, 질파테롤)의 잔류분석법 146 Ⅴ-14 Glucocorticoids 잔류분석법 150 Ⅴ-15 NSAIDs 잔류분석법 154 Ⅴ-16 호르몬 잔류분석법 159 Ⅴ-17 DES 및 Zeranol 분석법 163 Ⅴ-18 발네물린 및 티아물린 동시 분석법 168 Ⅴ-19 린코마이신 분석법 172 Ⅴ-20 아자페론, 카라졸롤 잔류시험법 175 Ⅴ-21 퀴녹살린계 (카바독스, 올라퀸독스)의 잔류분석법 178 Ⅴ-22 니트로푸란계 잔류분석법 183 Ⅴ-23 디메트리다졸, 메트로니다졸, 로니다졸 동시 분석법 190 Ⅴ-24 클로르프로마진, 피리메타민, 콜치신 잔류분석법 194 Ⅴ-25 반코마이신 (Vancomycin) 잔류분석법 197 Ⅴ-26 티오우라실 (Thiouracil) 잔류분석법 200 Ⅴ-27 메드록시프로게스테론 아세테이트 잔류분석법 204 Ⅴ-28 유기염소계 농약 잔류분석법 207 Ⅴ-29 카바메이트계 농약 잔류분석법 211 Ⅴ-30 중금속 잔류분석법 215 Ⅴ-31 잔류성유기오염물질 (POPs) 분석법 219

7 수산물의 잔류 동물용의약품 분석법 237 I. 수산물의 잔류 동물용의약품 분석법 237 Ⅰ-1 간이시험법 239 Ⅰ-2 정밀정량검사법 244 Ⅱ. 수산물의 유해물질분석법 303 Ⅱ-1 납 잔류분석법 305 Ⅱ-2 카드뮴 잔류분석법 306 Ⅱ-3 총수은 잔류분석법 307 Ⅱ-4 메틸수은 잔류분석법 308 Ⅱ-5 벤조피렌 잔류분석법 309 Ⅱ-6 엔도설판 잔류분석법 312 Ⅱ-7 트리플루라린 잔류분석법 315 Ⅱ-8 PCBs 잔류분석법 318 참고자료 (잔류물질 실험실 운영가이드) 323

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9 축산물의 잔류 동물용의약품 분석법 - 1 -

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11 Ⅰ 총 칙 - 3 -

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13 Ⅰ. 총 칙 1. 이 편람에 등재된 시험법은 축산물위생관리법 시행규칙 별표 9의 3 <축산물위생 검사기관의 검사 업무 수행에 관한 규정 (제28조의4 관련)> 제5항, 축산물위생검사 기관은 축산물의 가공기준 및 성분규격에 정한 규정에 따라 검사를 하되, 검사결과의 신뢰성 정확성을 확보할 수 있는 범위에서 검역검사본부장이 인정하는 경우에는 다른 시험방법으로 검사할 수 있다. 에 의거하여 수입산 및 국내산 축산물 검사 방법으로 활용할 수 있음. 2. 시험에 있어 규정된 값 (규격치라 한다)과 시험에서 얻은 값 (실험치라 한다)을 비교하여 적부판정을 할 때에, 실험치는 규격치보다 한자리 수까지 더 구하여 더 구한 한자리수를 반올림해서 규격치와 비교 판정한다. 또 규격치가 a~b라고 기재된 것은 a 이상 b 이하임을 말한다. 예시> 겐타마이신의 소근육에서의 잔류허용기준 : 0.1 mg/kg 적부판정시 0.14 mg/kg 적합 0.15 mg/kg 기준 초과로 위반 3. 별도로 잔류허용기준이 정해지지 아니한 경우, 다음 각 항의 기준을 순차적으로 적용한다. 가. CODEX (국제식품규격위원회) 기준 나. 유사 식용동물의 잔류허용기준 중 해당부위의 최저기준. 즉, 기준이 정하여지지 아니한 포유류 중 반추동물, 포유류 중 비반추동물, 가금류, 어류 및 갑각류는 각각 기준이 정하여진 반추동물, 비반추동물, 가금류, 어류, 갑각류 해당 부위의 기준 중 최저기준 (단, 비반추동물 중 말은 기준이 있는 반추동물에 해당하는 기준 적용) 다. 항생물질 및 합성항균제에 대하여 축 수산물 (유, 알 포함) 및 벌꿀 (로얄젤리, 프로폴리스 포함)의 잔류기준을 0.03 mg/kg으로 일괄 적용 4. 단위는 국제단위계 (SI)의 단위를 사용한다. 1) 수치와 단위 기호를 표시할 때 그 사이를 반 칸 (컴퓨터로서는 1 바이트) 띄운다. 백분율 (%)도 한 칸 띈다. 예시> 35 mm ( ) ; 35mm ( ), 25 ( ) ; 25 C ( ) - 5 -

14 2) 자릿수가 많은 숫자를 표시할 때는 소수점을 중심으로 세 자리마다 한 칸씩 띄어서 (컴퓨터로서는 1바이트) 기록한다. 단, 4 자리인 경우에는 사이를 띄우지 않아도 된다. 3) 양의 범위를 표시하는 경우에는 수치 부분을 괄호로 묶고 공통되는 단위 기호는 뒤에 쓴다. 예시> 23.4 ± 0.1 ( ) ; 23.4 ± 0.5 ( ), ( 23.4 ± 0.5) ( ) 23.4~25.7 ( ) ; ( 최저 23.4, 최고 25.7 ) ( ) 4) 괄호를 사용할 때는 괄호 앞을 약간 (0.5~1칸, 컴퓨터에서는 1 바이트) 띄우는 것이 좋다. 단, 화합물이나 계산식 등에서는 괄호 앞을 띌 수 없다. 5) 양 ( 量 )의 기호는 이탤릭체 (사체)로 쓰며, 단위 기호는 로마자 (직립체)로 기록한다. 단, 단위의 명칭이 고유명사에서 유래한 것은 첫 글자를 대문자로 기록한다. 예시> 양 의 기호 : m ( 질량), t ( 시간 ), l ( length), 단 위 기호 : m ( meter), t ( ton), L or l ( liter) 단 위 기호 : K, Pa, Hz, N, W, F, V, Da 등 6) 농도를 표시할 때 ppm, ppb, ppt 등은 SI 단위가 아니므로 사용할 수 없으며 질량 또는 부피 단위를 확실하게 표시해야만 한다. 부피를 나타낼 때의 리터는 대문자를 사용하는 것이 혼동을 줄일 수 있다. 예시> 2 mg/l ( ) ; 2 mg/kg ( ) ; 2 p p m ( ), 2 p p b ( ), 2 p p t ( ) 5 mg/l ( ) ; 5 mg/l ( ), 5 mg/l ( ) 5mg/L ( ) 1 L ( ) ; 1L ( ) ; 1 l ( ) ; 1l ( ) ; 1l (?) -십일?, 일 리 터? 7) 가능한 한 m, kg, L 단위를 사용하도록 조정하는 것이 좋다. 예시> mg/kg ( ), μg/g ( ), ug/g ( ) ; mg/l ( ) ; μg/ml ( ), ug/ml ( ) 8) 극미량의 수치 표현에서 prefix (접두어) 로서 micro- (μ, 10-6 )를 사용할 때, u" 를 사용해서는 안 된다. 1 u"는 1 Da 이며 kg 의 atomic mas s unit 이기 때 문이다. 예시> μm ( ), um ( ) ; μg ( ), ug ( ) ; μl ( ), ul ( ) 9) 단위 기호는 복수의 경우라 해도 복수로 표시하지 않으며, 단위 기호 뒤에 마 침표 등 다른 기호나 다른 문자를 첨가해서는 안 된다. 예시> 3 kg ( ) ; 3 Kg ( ), 3 kgs ( ) 5 s ( ) ; 5s ( ) ; 5 s ec ( ) ; 5 s ec. ( ), 5 s ec s ( ) 5 min ( ) ; 5min ( ) ; 5 min. ( ), 5 mins ( ) 5 h ( ) ; 5h ( ) ; 5 h. ( ) ; 5 hr. ( ) ; 5 hrs ( ) - 6 -

15 10) 두 개 이상의 단위가 분수로 표시되는 때에는 사선, 횡선, 음의 지수, 또는 괄호 묶는 등의 방법으로 표기해야만 한다. 사선 (/) 다음에 두 개 이상의 단위가 올 때에는 반드시 괄호로 묶어 표시한다. 예시> m s, m/s, 또는 m s -1 ( ) 11) 어떤 양을 한 단위와 수치로 나타낼 때 보통 수치가 0.1과 사이에 오도록 접두어를 선택하여 표시하는 것이 좋다. 예시> mm ( ) 12.3 m ( ), μm ( ) 1.23 nm ( ) 단, 다음의 경우는 예외임. 가 넓이나 부피를 나타낼 때 헥토, 데카, 데시, 센티가 필요한 경우. 나 같은 종류의 양의 값이 실린 표나 주어진 문맥에서 그 값을 비교하거나 논의할 때 다 관례적인 특수한 분야 : 기계공학 도면에서 단위는 항상 mm 임. 12) 원소들의 기호는 한 자 또는 두 자로 되어 있다. 한 자인 경우는 반드시 대문 자이고, 두 자로 되어 있는 경우에는 첫 자는 대문자임. 예시> Na ( ), NA ( ), Pb ( ), PB ( ), Cl - ( ), cl - ( ), SO 2-4 ( ), So 2-4 ( ) 13) 장치 및 기구에서 수시로 오류를 범하는 용어 예시> Chromatograp h: 크로마토 그 래 프 ( ins trument, 기기) Chromatography : 크로마토그래피, 크로마토그래프법 (method, 시험법) Balanc e : 저울 ( ), 천칭 ( ), 천평 ( ) 14) rpm ---> r/min 15) MΩ ---> MΩ c m 2 16) 습도를 나타낼때는 상대습도 (relative humidity, RH)로 표기한다. 예시> 27 % R H ( ), 27 % ( ) - 7 -

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17 Ⅱ 간이검사법 - 9 -

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19 II. 간 이 검 사 법 Ⅱ-1 식육의 잔류 항균물질 간이검사법 II-1-1. EEC 4-plate 법 1. 원 리 이 방법은 축산물의 가공기준 및 성분규격 (농림수산검역검사본부 고시)에 정하여진 간이검사법으로서 잔류 항균물질의 검출범위를 넓힐 목적으로 Bacillus subtilis (Bs)와 Micrococcus luteus (Ml) 두 종류 균주를 사용하고 배지의 ph 조건을 6.0, 7.2, 8.0, 8.0으로 한다. 이와 동시에 ph 7.2 배지에는 설파제의 검출감도를 높일 목적으로trimethoprim (TMP)을 일정농도로 첨가하여 검사한다. 즉, ph 조건과 시험균을 조합하여 ph 6.0 Bs, ph 7.2 Bs, ph 8.0 Bs 및 ph 8.0 ml 4가지 종류의 평판을 만들고 사방1 cm의 식육이나 체액을 흡수시킨 디스크를 평판에 올려 배양하여 일정 크기 이상의 균발육 억제대가 형성되면 항균물질이 잔류하는 것으로 판정하는 방법으로 디스크법과 직접법이 있다. 신선육의 경우 필터페이퍼 디스크 (filter paper disc)에 의해 육즙 흡수가 용이하지 않아 냉동시 1일이 추가 소요되며 직접법 (사방 1 cm, 두께 2 mm 정도로 식육을 잘라 시험용 평판에 올려 검사하는 방법)을 사용하는 경우 검사시간을 단축할 수 있고 기존의 디스크법과 직접법간의 검출능의 비교 검토결과에서도 두 방법간에는 동등한 수준의 검출감도를 나타내는 것으로 확인되어 현행 EEC 4-plate법의 디스크법과 직접법을 병용하는 방법을 사용할 수 있다. 2. 시험 재료 가. 시험균 1) Bacillus subtilis (Bs) 2) Micrococcus luteus (Ml) 나. 배지 1) 계대, 증식용: Nutrient agar slant, tryptic soy broth (TSB) 2) 시험용: Merck's test agar (ph 6.0, ph 7.2, ph 8.0) 등 동등품 3) 아포 조제용: AK #2 sporulating agar (BBL) 4) 균수 측정용: plate count agar (PCA) 또는 nutrient agar 다. 표준품 : Penicillin G, sulfamethazine, streptomycin, trimethoprim

20 라. 페트리접시 : perti-dish (87 15 mm, 녹십자 또는 이와 동일한 규격품) 마. 디스크 직경 6 mm paper disc (Schleicher & Schuell No 또는 Adventec No ), 지육 검사용 디스크 (직경 10 mm paper disc, Adventec No ) 바. 기타 균질기 (Stomacher), 캘리퍼스 또는 눈금자, 원심분리관 (50 ml), 항온수조 (50 ), 배양기 (30 ), 멸균 피펫 (10 ml), Roux bottle, 외과용 메스 (No. 22) 등 3. 시험균액의 조제 가. B. subtilis BGA 아포액 조제 1) 증류수 1 L에 해당하는 AK #2 sporulating agar (BBL) 또는 MnSO 4 H 2 O 0.05 g을 보충한 nutrient agar에 agar 5 g을 추가하여 끓인 후 Roux bottle에 250~300 ml를 분주하여 121, 15분간 고압증기 멸균한 다음 굳힌다. 2) Nutrient agar slant로 37 에서 하룻밤 배양한 종균을 멸균증류수2~3 ml로 집균한다. 3) Roux bottle 평판에 이식하여 37, 18~24시간 배양한 후 실온에 6일간 방치한다. 4) 멸균 유리구슬 (직경 4 mm)과 멸균증류수 25 ml를 넣고 조심스럽게 흔들어 집균하여 멸균 원침관에 옮긴 후 항온 수조 65, 30분간 가열한다. 5) r / min으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 일정량의 멸균 증류수를 넣어 vortex mixer로 부유시켜 원심분리한다. 이와 같이 침전물에 멸균증류수로 부유하여 원심분리하는 세척과정을 총 3회 반복한다. 6) 마지막으로 원심분리하여 상층액을 버리고 남은 침전물에 20 ml의 멸균증류수로 재부유시켜 70, 30분간 가열한다. 7) 이 아포원액을 plate count agar (PCA) 또는 nutrient agar를 이용해 나.항의 방법에 따라 아포액의 농도를 측정하여 멸균 증류수로 10 7 ~10 8 CFU/mL가 되도록 조정한 stock suspension 상태로 4 냉장보관하면서 사용한다. 8) 시험용 평판을 만들기 위하여stock suspension 1 ml을 취하여 멸균 증류수 9 ml 또는 99 ml을 가하여 CFU/mL로 희석한다 (working suspension). 나. 아포액의 농도 측정 1) 멸균증류수를 사용하여 가. 6)항의 아포원액을 10배 단계 희석하여 10-4 ~10-7 이 되는 희석용액을 만든다. 2) 희석용액의 1 ml씩을 각 희석농도별 3개의 perti-dish에 분주한다. 여기에 멸균하여 약 50 로 유지한 plate count agar 또는 nutrient agar 배지를 적당량 첨가하여 좌우로 잘 흔들어 희석균액과 배지를 고르게 혼합하여 굳힌다

21 3) 그 위에 같은 배지를 적당량 중층시켜 굳힌 후 30 배양기에서 48시간 배양한다. 4) 집락수가 30~300개 되는 희석배수의 plate를 선택하여 평균집락수를 구하고 가. 6)항 아포원액의 ml당 아포 농도를 환산한다. 예를 들어 10-6 희석 농도에서 평균 집락수가 50개일 경우, 아포 원액의 균수는 CFU/mL이다. 다. M. luteus ATCC 9341 균액 Tryptic soy broth (TSB) 20 ml에 계대 보존균을 직경2 mm 백금이로 1 loop를 접종하여 32 water bath에서 16시간 진탕배양 (약 80 r / min)한다. 이 균액 1 ml를 19 ml의 멸균증류수에 희석하여 사용하며 (이때 균농도는 약 2x10 7 CFU/mL이 된다), 이 희석균액은 4 냉장보관 하면서 약 1주일간 사용할 수 있다. 4. 시험용액의 조제 가. Penicillin G (PG) 용액 일정 단위 (unit)의 PG Na 또는 PG K 60 mg을 100 ml의 용량플라스크에 취해 멸균 증류수로 표시선까지 맞춘 다음 다시 1 000배 희석하여 1 IU/mL (또는 0.6 μg ml -1 )이 되도록 희석하여 사용한다 (PG 1 unit= 0.6 μg). 나. Sulfamethazine (SMZ) 용액 100 mg의 SMZ를 100 ml의 용량플라스크에 취해 10 ml의 methanol로 녹인 다음 멸균 증류수로 표시선까지 맞추어 혼합하고 (1 mg ml -1 ) 다시 동일한 크기의 용량플라스크에 이 용액 5 ml을 취해 희석하여 사용한다 (50 μg ml -1 ). 다. Streptomycin (SM) 용액 100 mg의 SM을 100 ml의 용량플라스크에 취해 멸균증류수로 혼합하고 (1 mg ml -1 ) 다시 동일한 크기의 용량플라스크에 이 용액5 ml을 취해 희석하여 사용한다(50 μg ml -1 ). 라. Trimethoprim (TMP) 용액 10 mg의 TMP를 100 ml의 용량플라스크에 취해 10 ml의 methanol로 녹인 다음 멸균 증류수로 표시선까지 맞추어 다시 이 용액을 10배 희석하여 사용한다 (1 mg ml -1 ). 5. 시험용 평판 조제 검사할 시료의 수와 소요될 한천평판의 수를 산출하여 필요한 배지량을 결정한 후 증류수 1 L당 Peptone 6.9 g, NaCl 5.1 g, KH 2 PO g 및 agar 13.0 g을 평량하여 삼각플라스크에 취한다. 이 배지 대신에 배지조성이 거의 동일하며 ph의 조정이 필요 없이 사용할 수 있는 제품으로 Merck사에서 시판되고 있는 Test agar, ph 6.0 (No ), ph 7.2 (No ) 및 ph 8.0 (No )를 사용할 수 있다. 증류수를 넣어 끓인 배지를 고압증기멸균한 다음4개의 삼각플라스크 또는 공병에 동일한 양을 분주한다. 멸균한 배지를 약 50 항온수조에 약 2시간 동안 방치한 후 1 N NaOH, 1 N HCl을 사용하여 ph를 조정한다 (Bs: ph 6.0, 7.2, 8.0, ml: ph 8.0). 필요한 수량의 perti-dish를 준비하여 균주명, ph, 제조일 등을 기입한다

22 가. Bacillus subtilis (Bs) 평판 1) Bs 아포액이 사용되는 Bs, ph 6.0 등 세 종류의 배지에는 아포액 working suspension ( CFU/mL)을 65, 30분간 가열한 후, 배지 100 ml당 1 ml씩을 첨가한다. 이 때 배지내 시험균의 최종농도는 Bs CFU/mL이 된다. 2) Bs, ph 7.2 평판에는 희석한 아포액을 첨가하고, 동시에 TMP 10 μg ml -1 용액도 함께 배지 100 ml 당 1 ml를 첨가한다 (0.1 μg TMP/mL agar). 3) 아포액과 TMP 첨가 후 즉시 1분간 잘 혼합하여 피펫으로 6 ml씩 perti-dish (87 15 mm)에 분주하여 고르게 편 후 굳힌다. 이때 배지두께는 약 1 mm가 된다. 4) perti-dish의 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 시험용 평판은 냉장 보관하면서 2~3일간 사용할 수 있다. 특히, Bs ph 6.0 평판은 보관기간을 준수하여야 한다. 나. Micrococcus luteus (Ml) 평판 1) ml, ph 8.0 배지에는 증류수 ml당 약 CFU로 희석한 균액을 Bs 평판과 동일한 비율로 배지 100 ml 당 1 ml를 첨가한다. 이 때 배지내 시험균의 최종농도는mL CFU/mL이 된다. 2) 시험균액을 첨가한 후 약 1분간 잘 혼합하여 피펫으로 6 ml씩 perti-dish에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 시험용 평판은 냉장보관하면서 1주일 이내에 사용한다. 6. 시험용 평판 및 시료의 검사 가. 시험용 평판의 검사 시험용 평판을 검사하기 위한 항균물질과 표준용액농도는 아래의 표와 같다. 미리 준비한 항균물질 표준용액을 사용하여 각 10 μl씩 취해 시험용 평판에 올려놓은 직경 6 mm paper disc에 흡수시킨 후 32 에서 16시간 배양하여 시험균의 발육 억제대를 관찰한다. 이때 발육억제대의 크기는 디스크 바같쪽의 최소 주변 발육억제대가6~8 mm 이상이어야 한다. 시험용평판의 검사조건 시험용평판 항균물질 표준용액농도 디스크당 함량 최소주변억제대 Bs (ph 6.0) Bs (ph 7.2) Bs (ph 8.0) Ml (ph 8.0) Penicillin G-Na Sulfamethazine Streptomycin Steptomycin 1 IU/mL 50 μg ml μg ml μg ml IU 0.5 μg 0.5 μg 0.5 μg 6 mm 이상 6 mm 이상 8 mm 이상 6 mm 이상

23 나. 시료의 검사 1) 디스크법 (1) 가능한 한 외과용 메스 (No. 22)를 사용하여 무균적으로 도살된 식용동물의 근육을 절개한 후 핀셋으로 시료 당 지육 검사용 디스크 (직경 10 mm paper disc) 4개씩을 삽입하여 30~60분간 육즙을 흡수시킨다. (2) 육즙을 흡수시킨 후 디스크를 꺼내어4종류의 검사용 평판에하나씩 올려놓고 가볍게 눌러준 다음 실온에 약30분간 방치하여 32 배양기에 넣어 16시간 배양한 후 결과를 판정한다. 2) 직접법 (1) 시료를 가능한 한 무균적으로 사방 1 cm, 두께 2 mm 정도로 잘라 4 종류의 검사용 평판에 각각 올려놓고 실온에서 약 30분간 방치한 후 페트리접시를 도치하지 않고 32 배양기에 넣어 16시간 배양하여 결과를 판정한다. 7. 시험결과 판정 가. 결과판정 방법 캘리퍼스 또는 zone reader 등을 사용하여 시험균의 발육 억제대를 측정한 결과, 디스크법의 경우 디스크 직경 10 mm를 포함하여 억제대가14 mm 이상인 평판이 하나 또는 그 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정하며, 직접법의 경우 최소주변억제대 폭이 1 mm 이상인 평판이 하나 또는 그 이상일 때 양성으로 판정한다. 억제대 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다. 나. 양성시료의 항균물질 계열 추정 이 시험법으로 각 항균물질의 표준용액을 각 disc 당 75 μl씩 흡수시킨 다음 배양했을 경우 다음 표에 나타낸 바와 같이4종의 평판에서 억제대가 형성되는 양상을 비교함으로써 잔류 항균물질의 계열을 어느 정도 추정할 수 있다. 그러나 잔류량이 높은 경우나 여러 항균물질이 복합적으로 잔류할 경우 추정은 거의 불가능하다. 따라서 이 시험법은 단순한 추정에 불과하고 양성인 시료에 대하여는 미생물수용체법, HPLC 등을 이용하여 확인분석이 필요하다

24 EEC 4-plate 법의 표준 항균물질에 대한 최저검출한계 (μg ml -1 ) 항 균 물 질 Bs 평판 ph 6.0 Bs 평판 ph 7.2 Bs 평판 ph 8.0 Ml 평판 ph 8.0 β-lactams Penicillin G Ampicillin Amoxicillin Cloxacillin Nafcillin Cephalexin Cephazolin Aminoglycosides Streptomycin Dihydrostreptomycin Gentamicin Neomycin Macrolides Erythromycin Spiramycin Tylosin Oleandomycin Lincomycin Tetracyclines Tetracycline Chlortetracycline Oxytetracycline Sulfonamides Sulfamethazine Sulfamerazine Sulfadimethoxine Sulfamonomethoxine Sulfaquinoxaline Sulfathiazole Polypeptides Bacitracin Polyethers Monensin Nitrofurans Furazolidone Quinolones Oxolinic acid Others Spectinomycin Chloramphenicol Trimethoprim > > >100 >100 > >100 > >100 >

25 II-1-2. 퀴놀론계 항균물질 간이검사법 1. 원리 EEC 4-plate법이 퀴놀론계 항균물질에 대한 검출감도가 떨어지는 점을 보완하기 위하여 이들 물질에 민감한 E. coli 균주를 이용하여 퀴놀론계 항균물질을 잔류허용기준 수준까지 검출할 수 있도록 한 스크리닝법이다. 2. 시험재료 가 시험균: E. coli ATCC 나. 배지: 1) 계대용: Nutrient agar 2) 증균용: Nutrient broth 3) 시험용: Test Agar (이하 TA 라고 한다), ph 6.0±0.1 (Merck사, 독일) 또는 동등 규격품 다. 지육검사용 디스크: 직경 10 mm 라. 페트리디쉬: mm 마. 기타 균질기 (stomacher), 캘리퍼스 또는 눈금자, 원심분리관 (50 ml), 항온수조 (50 ), 배양기 (30 ), 멸균 피펫 (10 ml) 등 3. 시험균액의 조제 시험균액은 20 ml nutrient broth에 계대보존 균주를 직경 1 mm 백금이로 1 회 접종하여 30 배양기에서 16~18시간 배양한 후 이 균배양액을 시험균액으로 사용한다. 4. 시험용평판 조제 검사시료수를 고려하여 소요될 시험용평판의 수를 산출하고 필요한 배지량을 결정한 후 다음과 같이 시험용평판을 만든다. 가. 공병에 조제하고자 하는 양의 증류수를 가한 후 배지병 표면 label에 표기된 해당량의 시험용배지 (TA)를 평량하여 넣고 가열판 (hot plate)에 놓아 배지를 끓인다. 나. 고압증기멸균기 (autoclave)를 사용하여 배지를 고압증기멸균 (121, 15분간)한 다음 항온수조 혹은 배양기 (약 50 )에서 약 2시간 둔다

26 다. 해당 배지 100 ml당 시험균액 0.5 ml (배지량의 0.5 %) 첨가하여 시험균액이 고르게 혼합되도록 약 1분간 잘 혼합한다. 라. 10 ml용 멸균피펫으로 시험균액 혼합 배지 8 ml씩을 취하여 해당 petri dish에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 약 10분간 방치하여 배지를 굳힌다. 곧바로 시험용 평판을 사용하지 않을 경우 랩으로 싸서 4 냉장고에 보관한다. 조제한 시험용 평판은 4 냉장보관하면서 2~3 일내 사용한다. 5. 시료의 검사 외과용 메스를 이용하여 근육(살코기 부분)을 절개한 후 핀셋으로 지육검사용 디스크(직경 10 mm) 1 개를 삽입하여 30~60분간 육즙을 흡수시킨다. 이후 디스크를 꺼내어 시험용 평판에 올려 가볍게 눌러 고착시켜 30 배양기에 넣어 16시간 배양한 후 퀴놀론계 항균물질의 잔류여부를 판정한다. 6. 시험결과 판정 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용하여 시험균의 발육 억제대를 측정한 결과, 디스크의 직경 10 mm를 포함하여 억제대가 12 mm 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정한다. 억제대 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다. E. coli 균주에 의한 퀴놀론계 항균물질의 검출감도 (μg ml -1 ) 항균물질 검출감도 항균물질 검출감도 Ciprofloxacin 0.01 Norfloxacin 0.1 Danofloxacin 0.05 Ofloxacin 0.05 Enrofloxacin Pefloxacin

27 II-1-3. 식품공전의 항균물질 간이검사법 1. 원리 식품공전의 간이검사법은 과거 항균물질 간이검사법과 합성항균제 (설파제) 간이 검사법 으로 구분되었었으나 식품의 기준 및 규격의 개정(식약청고시 제 호)으로 하나의 시험법 으로 통합되었다. 이 방법은 B. subtilis 등 4 가지 종류의 균주와 각각의 배지를 조합하여 4종의 시험용 평판을 만들고 식육을 일정 크기로 잘라 직접 시험용 평판위에 올려 검사하거나 식육내 잔류하는 항균물질을 2 가지 종류의 추출완충액으로 추출한 다음 추출액에 디스크를 침지하여 해당 시험용 평판에 올려 배양한 후 일정 크기 이상의 억제대의 형성 여부로 잔류여부를 판정한다. 2. 시험재료 가. 시험균 1) B. megaterium ATCC ) B. subtilis ATCC ) B. cereus var. mycoides ATCC ) B. stearothermophilus ATCC 나. 배지 1) 계대, 증식용:Nutrient agar 2) 시험용:Antibiotic medium No. 2 (ph 6.55±0.05, AM #2), AM #5 (ph 7.9±0.1), AM #8 (ph 5.85±0.05), Mueller Hinton medium (ph 7.3±0.1, MH) 3) 아포 조제용 : AK #2 sporulating agar (BBL) 다. 페트리접시 : 안지름 85±1 mm, 높이 20 mm의 밑면이 평평한 것 라. 디스크 : 직경 10 mm, 펄프디스크 (흡수량 0.07~0.08 ml) 마. 시험용평판 검사용 감수성 디스크: Streptomycin (직경 6 mm, 10 μg) 바. 원통 (spider):바깥지름 6.5 mm, 안지름 5 mm인 스테인레스스틸제 사. 기타 : 배양병 (Roux bottle)

28 3. 시험균액의 조제 가. B. megaterium 아포액 조제 보통배지에 계대보관되어 온 시험균을 37 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37 에서 1일간 배양 후 실온에서 6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균한 후65 에서 30분간 가열한 후 분당 r / min으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을 3회 이상 반복 하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 65 에서 30분간 재가열한다. 이를 멸균증류수로 10 단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를 CFU/mL가 되도록 희석하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 나. B. subtilis 및 B. cereus 의 아포액 조제 Nutrient agar에 계대보관되어 온 시험균을 멸균생리식염수 5 ml에 현탁시킨 후Nutrient agar 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여37 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37 에서 1일간 배양한 후 실온에서6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균하여 65 에서 30분간 가열한 후 분당 r / min으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균수에 부유시켜 세척을 반복하고 잔사를 멸균수에 부유시켜 65 에서 30분간 재가열한다. 이 아포액은 MacFaland No. 1 정도 되게 멸균수로 희석 소분하여 냉장 보관하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 다. B. stearothermophilus 의 아포액 조제 Nutrient agar에 계대, 보관되어온 균주를 멸균생리식염수 5 ml에 현탁시킨 후 Nutrient agar 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 시험균을 55 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 55 에서 1주일간 배양한다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균한 후 85 에서 15분간 가열한 후 분당 r/min으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을3회 이상 반복하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 85 에서 15분간 가열한 후 아포액의 농도를 MacFaland No. 2 정도 되도록 희석 소분하여 냉장 보관한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 4. 시험용액 및 추출완충액의 조제 가. Trimethoprim (TMP) 용액 TMP 10 mg을 용량플라스크에 달아 methanol 10 ml에 녹이고 멸균증류수를 가하여 100 ml로 한 후 다시15 μg ml -1 용액이 되도록 희석하여 B. megaterium 평판 조제시 사용한다

29 나. 추출완충액 1) 구연산 아세톤용액 0.2 M 구연산용액 (citric acid 4.2 g을 증류수에 녹여 100 ml가 되게 만든 용액)과 0.5 M KOH (KOH 2.8 g을 증류수에 녹여 100 ml가 되게 만든 용액)를 동량으로 혼합 한다 (A용액). 이미 조제한 A 용액, 아세톤과 멸균증류수의 비율이 35:35:30 (v/v/v)되게 혼합하여 추출완충액으로 한다. 2) 0.2 M phosphate buffer (ph 8.0) K 2 HPO g과 KH 2 PO g을 물에 녹여 ml까지 채운다. 5. 시험용 평판의 조제 가. B. megaterium 평판 멸균 후 약 50 로 보존된 MH 배지 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml와 TMP용액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후perti-dish에 8 ml씩 분주하여 수평으로 유지하여 응고시킨다. 나. B. subtilis 평판 멸균 후 약 50 로 보존된 AM #5 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 위의 가. 와 같이 시험용 평판을 만든다. 다. B. cereus 평판 멸균 후 약 50 로 보존된 AM #8 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 시험용 평판을 만든다. 라. B. stearothermophilus 평판 멸균 후 약 50 로 보존된 AM #2 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 시험용 평판을 만든다. 6. 시험용 평판의 검사 시험할 때마다 스트렙토마이신 감수성 디스크 (10 μg)를 이용하여 각 시험용 평판의 감도를 확인한다. 즉, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis 및 B. stearothermophilus 평판에서 스트렙토 마이신 감수성 디스크의 저지환의 직경이 각각 20 mm 이상 되는 평판을 사용한다. 7. 시험조작 가. 직접법 시료를 가능한 한 무균적으로 사방 1 cm, 두께 2 mm 정도로 잘라 검사용 평판에 놓는다. 이것을 약 1시간 냉장으로 방치한 후perti-dish를 도치하지 않고 B. megaterium는 45, B. subtilis는 30, B. cereus는 30, B. stearothermophilus는 55 에서 16~18시간 배양한다

30 나. 디스크법 시료 10 g씩 2 개를 달아 하나에는 구연산 아세톤용액 10 ml, 다른 하나에는 0.2 M phosphate buffer (ph 8.0) 10 ml를 가하여 균질기로 균질화한 후85 에서 15분간 가열한 후 냉각하여 그 액을시험용액으로 한다. 이 시험용액에 디스크를침지한 후 검사용 평판에 놓는다. 구연산 아세톤 완충액으로 추출한 시험용액에 침지한 디스크는 B. subtilis, B. cereus 및 B. stearothermophilus 평판에 올려놓고, 0.2 M phosphate buffer로 추출한 시험 용액에 침지한 디스크는 B. megaterium 평판에 올려놓는다. 이때 구연산 아세톤 완충액과 0.2 M phosphate buffer에 침지한 디스크를 각각의 음성대조구로 한다. 각 시험균은 직접법과 동일하게 배양한다. 다. 원통 (spider)법 위의 디스크법과 동일하게 2 개의 시료에 각각의 추출완충액으로 추출하여 시험용액으로 한다. 미리 준비한 4 가지 종류의 시험용 평판 위에 원통(spider)를 올려놓고 디스크법과 같이 해당 시험용 평판의 원통에 시험용액 각각200 μl를 넣어 직접과 동일하게 각 시험용 평판을 배양한다. 8. 판정 직접법의 경우 주변 억제대 폭이 1 mm 이상인 것, 디스크법과 원통법의 경우 저지환의 직경이 각각 12 mm, 9 mm 이상인 것을 양성으로 판정한다. 양성으로 판정된 검체는 아래 표에 따라 항균물질 또는 합성항균제의 계통을 추정할 수 있다. 식품공전 간이시험법에 의한 항균물질 검출양상 B. cereus (AM #8) B. subtilis (AM #5) B. megaterium (MH) B. stearothermophilus (AM #2) 추정 물질 계통 ++ + ± ± Tetracycline계 ± Macrolide계 - ± + ++ Penicillin계 - + ± - Aminoglycoside계 ± Polyether계 ± Peptide계 - - ± - Chloramphenicol ± - ± ± Novobiocin Sulfonamide계

31 Ⅱ-2 우유의 잔류 항균물질 간이검사법 II-2-1. TTC-II 법 1. 원리 시험균주인 Streptococcus thermophilus에 의해 무색의2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)가 산화환원반응 결과 적색의 triphenyl formazan이 형성되는지를 확인하는 것으로 유 중 잔류 항균물질을 비롯한 세균발육억제물질의 간이검사법이다. 이 시험법은 잔류 설파제의 검출 감도를 높이기 위해 배지내 trimethoprim (TMP)이 첨가되며, 시료가 양성일 경우 p-aminobenzoc acid (PABA)와 penicillinase를 첨가하여 설파제와 페니실린계 항균물질의 확인이 가능하도록 개량된 방법이다. 2. 시험재료 가. 시험균 Streptococcus thermophilus ATCC 나. 배지 항균물질이 없는 10 % 멸균 탈지유 배지(skim milk : Difco 등 동등품)를 공시균주 배양용 배지로 사용한다. 다. 시약 1) Trimethoprim (TMP): Sigma 등 시약 특급 2) p-aminobenzoic acid (PABA): Sigma 등 시약 특급 3) 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC): Sigma 등 시약 특급 4) Penicillinase (1 000 unit): Sigma P0389 등 시약 특급 라. 시험기구 항온수조 혹은 배양기 (37 ), 항온수조 (82 ), 마개 있는 시험관( mm), 혼합기 (MultII-vortex mixer), 마이크로피펫 (100 μl 및 μl), 피펫 (1 ml 및 10 ml) 등 3. 시험균액의 조제 가. Streptococcus thermophilus 균주를 10 % 탈지유배지에 접종하여 37 에서 12시간 배양한다

32 나. 10 % 멸균탈지유배지를 따로 준비한다. 다. 위의 가와 나를 1:1 (v/v)의 비율로 혼합한다. 이와 같이 준비된 시험용 배양균액은 즉시 사용한다. 4. 시험 용액의 조제 가. TTC 용액 1) TTC와 멸균증류수를 1:25의 비율로 섞는다 (4 % TTC 용액). 2) TTC 용액은 7 이하의 냉암소에서 보존한다. 3) 발색되거나 시일이 너무 경과한 용액은 사용하지 않는다. 나. TMP 용액 1) 50 mg의 TMP를 100 ml 용량플라스크에 취해 methanol 10 ml에 녹이고 멸균증류수로 눈금 표시선까지 맞춘다 (500 μg ml -1 ). 2) 위의 1)을 멸균증류수로 1:9의 비율로 희석한50 μg ml -1 용액을 시험용액으로 사용한다. 3) 위의 1)을 냉장보관하면서 위의 2)의 농도로 희석하여 사용하되 2 주 이내에 사용한다. 다. PABA 용액 1) 500 mg의 PABA를 100 ml 용량플라스크에 취해 멸균증류수 약50 ml를 가하여 가온하여 녹인 다음 멸균증류수로 표시선까지 맞춘다 (5 mg ml -1 ). 2) 위의 1)를 멸균증류수로 1:9의 비율로 희석한 500 μg ml -1 용액을 시험용액으로 사용한다. 3) 위의 1)를 실온에 보관하면서 위의2)의 농도로 희석하여 사용하되2 주 이내에 사용한다. 라. Pencillinase 용액 Penicillinase (1 000 units)를 멸균증류수 1 ml로 녹여 시험용액으로 사용한다. 이 용액은 penicillin G 및 cloxacillin 10 μg ml -1 농도 이상을 불활화한다. 5. 시료의 검사 가. 스크리닝법 1) 마개 있는 멸균시험관 2 개에 유성펜으로 Zero control 및 TMP control이라 표기하고 검사할 시료 당 1 개의 시험관에 시료번호를 기입한다. 2) 검사할 시료의 멸균시험관에 우유시료를 각각 8 ml씩 취한다. 이때 대조용으로 사용할 Zero 및 TMP control 시험관에는 항균물질이 들어 있지 않는 우유 각 8 ml를 취한다. 대조용 원유시료는 사료첨가제 혹은 치료약제 등 세균발육억제물질을 투여하지 않은 원유를 채취하여 4 냉장보관하면서 사용하며 2 3 일내 사용하지 못할 경우 -20 혹은

33 -80 에 보관하고 필요시 해동하여 사용한다. 탈지우유를 검사할 경우 대조용 시료로는 항균물질이 들어 있지 않은 10 % 멸균탈지우유를 사용한다. 3) Zero control에는 멸균증류수 1 ml를 첨가하고, TMP control 및 검사할 시료의 시험관에는 용액 1 ml를 첨가하여 혼합한다. 4) (82 ± 2) 의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 즉시 수돗물에 담구어 (약 1분간) 37 이하로 급냉시킨다. 5) 시험용 배양균액 (1:1 희석균액)을 무균적으로 각 1 ml씩 접종하여 혼합하고 (37±0.5) 의 항온수조에서 2시간 동안 배양한다. 6) 0.3 ml의 TTC 용액을 첨가한 후 (37±0.5) 에서 30~60 분 동안 반응시킨다. TMP control 시료의 색상이 음성대조 시료의 색상과 거의 같은 시점을 반응 종료시간으로 한다. 나. 설파제 및 페니실린계 항균물질 확인시험 1) 마개 있는 멸균시험관 3 개에 유성펜으로 양성시료의 시료번호와 TMP tube, PABA tube 및 Penase tube로 기입한다. 2) 표기한 3개의 시험관에 양성시료 각 8 ml를 취한다. 이때 대조용 시료는 스크리닝법 2)와 동일하게 만들어 사용한다. 3) TMP tube (TMP 용액첨가 시험관)와 Penase tube (TMP 용액 및 pencillinase 용액첨가 시험관)에는 TMP 용액 (50 μg ml -1 )을 각각 1 ml씩 첨가하고, PABA tube (PABA 용액 첨가시험관)에는 PABA 용액 (500 μg ml -1 ) 1 ml를 첨가하여 혼합한다. 4) Penase tube에만 penicillinase 용액 100 μl를 첨가하여 혼합한다. 5) (82 ± 2) 의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 즉시 수돗물에(약 1분간) 담궈 37 이하로 냉각 시킨다. 6) 시험용 배양균액 (1:1 희석균액)을 무균적으로 각각 1 ml씩 접종하여 혼합하고 (37±0.5) 의 항온수조에서 2시간 동안 배양한다. 7) 300 μl의 TTC 용액을 첨가한 후 (37±0.5) 에서 30~60 분 동안 반응시킨다. TMP control 시료의 색상이 음성대조시료의 색상과 거의 같은 시점을 반응 종료시간으로 한다. 6. 시험 결과 판정 가. 스크리닝법 TMP control의 색상을 기준으로 하여 시료의 색상이 TMP control 시료의 연분홍색보다 현저히 옅을 경우 양성으로 판정하고 같거나 진하면 음성으로 판정한다. 이 때, 시료가 양성인 경우 아래의 나 의 확인시험법으로 설파제 및 페니실린계 항균물질을 확인할 수 있다

34 나. 설파제 및 페니실린계 항균물질 확인시험 TMP control의 색상을 기준으로 하여 상기 스크리닝법과 같이 판정하고 아래 표와 같이 결과를 추정할 수 있다. 페니실린계 및 설파제 양성으로 판정된 시료는 HPLC 등의 기기분석을 통하여 확인 정량한다. TTC-II 법에 의한 검사결과 판정방법 TMP tube Penase tube PABA tube 결과판정 음 성 음성 음성 음성 양 성 양성 음성 양성 (설파제) 양 성 음성 양성 양성 (페니실린계) 양 성 양성 양성 양성* * 페니실린계 및 설파제 이외의 항균물질로 추정할 수 있으나 항균물질이 복합적으로 잔류될 경우 설파제나 페니실린계 항균물질도 동시에 검출될 수 있다. II-2-2. 식품공전의 디스크법 이 시험방법은 식품공전의 식육 중 항균물질 간이검사법의 디스크법과 동일하나1차 양성 추정시료에 대하여 살균과정을 거친 후 재시험을 하는 점이 다르다. 우유시료를 충분히 혼합하여 사용하되, 분유류는 14 % 수용액으로 조제하여 사용한다. 우유시료에 디스크를 침지한 후 시험용 평판에 올려 각 시험균주별 동일한 배양조건으로 배양한 후 시험용 평판에서 디스크 주변에 발육억제대가 형성된 시료에 대하여 재시험하여 결과를 판정한다. 우유시료를 82 로 2분간 가열한 후 신속히 식혀 재시험을 실시한 결과 시험용 평판 중 발육억제대의 직경이 12 mm 이상 형성되었을 경우 항균물질 양성 으로 판정한다. 항균물질 양성인 시료는 필요에 따라 미생물수용체법, HPLC, GC 등의 기기분석을 통하여 확인, 정량을 실시한다

35 Ⅱ-3 식용란의 잔류 항균물질 간이검사법 II-3-1. Four-plate법 1. 원리 테트라싸이클린계 등 항생제와 플루오로퀴놀론계 항균물질의 간이검사를 위하여 식품 공전의 방법을 변형한 미생물학적 방법이다. Bacillus subtilis 등 시험균주 4종과 Antibiotic medium No. 8 등 각각의 배지를 조합하여 만든 4 가지 종류의 시험용 평판을 사용하여 검사한다. 식용란으로부터 항균물질을 추출하여 가열 냉각한 후 시험용액을 디스크 (직경 10 mm paper disc)에 침지시켜 시험용 평판에 올려 검사한다. 2. 시험재료 가. 시험균 1) Bacillus megaterium ATCC 9885 (이하 B. megaterium 이라 한다) 2) Bacillus subtilis ATCC 6633 (이하 B. subtilis 라 한다.) 3) Bacillus cereus. var. mycoides ATCC (이하 B. cereus 라 한다.) 4) Escherichia coli ATCC (이하 E. coli 라 한다) 나. 배지 1) 계대, 증식용:Nutrient agar 2) 시험용:Antibiotic medium No. 5 (ph 7.9±0.1, 이하 AM #5 라 한다.) Antibiotic medium No. 8 (ph 5.85±0.05, 이하 AM #8 라 한다.) Mueller Hinton medium (ph 7.3±0.1, 이하 MH 라 한다.) Test agar (ph 6.0±0.1, 이하 TA 라고 한다; Merck사, 독일) 또는 동등 규격품 3) 아포 조제용 : AK #2 sporulating agar (BBL) 다. 페트리접시 : 87x15 mm (녹십자 또는 이와 동등 규격품) 라. 디스크 : (직경 10 mm, 흡수량 0.07~0.08 ml) 또는 원통 (spider:바깥지름 6.5 mm, 안지름 5 mm인 스테인레스스틸제) 마. 시험용 평판 검사용 감수성 디스크:스트렙토마이신 감수성 디스크 (직경 6 mm, 10 μg)

36 3. 시험균액의 조제 가. B. megaterium 아포액 조제 Nutrient agar에 계대보관되어 온 시험균을 37 C에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37 C에서 1일간 배양 후 실온에서 6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균한 후 65 C에서 30분간 가열하고 분당 r/min으로 20분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을3 회 이상 반복하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 65 C에서 30분간 재가열한다. 이를 멸균 증류수로 10 단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를 CFU/mL가 되도록 희석하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 나. B. subtilis 및 B. cereus 의 아포액 조제 Nutrient agar에 계대보관되어 온 시험균을 멸균생리식염수 5 ml에 현탁시킨 후Nutrient agar 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여37 C에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시키고 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37 C 에서 1일간 배양한 후 실온에서6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균하여 65 C에서 30분간 가열한 후 분당 r/min으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균수에 부유시켜 세척을 반복하고 잔사를 멸균수에 부유시켜 65 C에서 30분간 재가열한다. 이 아포액은 MacFaland No. 1 정도 되게 멸균수로 희석 소분하여 냉장 보관하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 다. E. coli 시험균액 조제 20 ml nutrient broth에 계대보존 균주를 직경1 mm 백금이로 1 회 접종하여 30 배양기에서 16~18시간 배양한 후 균배양액을 시험균액으로 사용한다. 4. 시험용액 및 추출완충액의 조제 가. Trimethoprim (TMP) 용액 TMP 10 mg을 용량플라스크에 달아 methanol 10 ml에 녹이고 멸균증류수를 넣어 100 ml로 한 후 15 μg ml -1 용액이 되도록 희석하여 B. megaterium 평판 조제시 사용한다. 나. 추출완충액 0.2 M 구연산용액 (구연산 4.2 g을 물로 용해하여 100 ml이 되도록 만든 용액, 즉, 0.2 M citric acid)과 0.5 M KOH (KOH 2.8 g을 물로 용해하여 100 ml이 되도록 만든 용액)를 동량으로 혼합한다 (A용액). 이미 조제한 A용액, 아세톤과 멸균증류수의 비율이 35:35:30 (v/v/v)되게 혼합한 구연산 아세톤용액을 추출완충액으로 사용한다

37 5. 시험용 평판의 조제 가. B. megaterium 평판 멸균 후 약 50 C로 가온 보존된 MH 배지 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml와 TMP 용액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 perti-dish에 8 ml씩 분주하여 수평으로 유지하여 응고시킨다. 나. B. subtilis 평판 멸균 후 약 50 C로 가온 보존된 AM #5 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 다. B. cereus 평판 멸균 후 약 50 C로 가온 보존된 AM #8 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 라. E. coli 평판 멸균 후 약 50 로 가온 보존된 TA 배지에 100 ml 당 조제된 시험균액 0.5 ml (배지량의 0.5 %)를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 6. 시험용 평판 및 시료의 검사 가. 시험용 평판의 검사 스트렙토마이신 감수성 디스크 (10 μg)를 이용하여 각 시험용 평판의 감도를 확인한다. B. megaterium, B. cereus, B. subtilis 평판에서 스트렙토마이신 감수성 디스크의 저지환의 직경이 각각 20 mm 이상인지를 확인한다. 나. 시료의 검사 검체 10 g (식용란의 경우 5개를 혼합한 전란액 10 g)을 시료균질백 (stomacher bag)에 취하여 구연산 아세톤완충액 10 ml를 가한다. 시료균질백 4~6 개를 포개어 균질기 (stomacher)에 고정한 후 2분간 균질화한다. 85 항온수조에서 15분간 가열하여 얼음에 냉각한 후 형성되는 맑은 추출액을 시험용액으로 한다. 이 시험용액에 디스크를 침지한 후 검사용 평판에 놓는다. 시험용 평판위에 시료추출액을 흡수시킨 디스크를 올려 가볍게 눌러 고착시킨 후 B. subtilis, B. cereus 및 E. coli 평판은 30 배양기에서, B. megaterium 평판은 45 배양기에서 16~18시간 배양한 후 항균물질의 잔류여부를 판정한다. 7. 시험결과 판정 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용하여 시험균의 발육억제대를 측정한 결과, 디스크의 직경 10 mm를 포함하여 억제대가 12 mm 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정한다. 억제대

38 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다. II-3-2. 퀴놀론계 항균물질 간이검사법 1. 시험재료 가. 시험균: E. coli ATCC 나. 배지: 1) 계대용: Nutrient agar 2) 증균용: Nutrient broth 3) 시험용: Test agar (이하 TA 라고 한다), ph 6.0±0.1 (Merck사, 독일) 또는 동등 규격품 다. 시약 1) Acetone: HPLC grade 2) Citric acid (C 6 H 8 O 7, MW ): 시약 특급 3) Potasium hydroxide (KOH, MW 56.11): 시약 특급 라. 지육검사용 디스크: 직경 10 mm 마. 페트리디쉬: 87x15 mm 바. 기타 기구 균질기 (stomacher), 캘리퍼스 또는 눈금자, 원심분리 시험관 (50 ml), 항온수조 (50 ), 배양기 (30 ), 멸균 피펫 (10 ml) 등 2. 시험균액의 조제 시험균액은 20 ml nutrient broth에 계대보존 균주를 직경 1 mm 백금이로 1 회 접종하여 30 배양기에서 16~18시간 배양한 후 균배양액을 시험균액으로 사용한다. 3. 추출완충용액 조제 0.2 M 구연산용액 (구연산 4.2 g을 증류수로 용해하여 100 ml로 만든 용액)과 0.5 M KOH 2.8 g을 증류수로 용해하여 100 ml로 만든 용액)을 동량으로 혼합한 용액, 아세톤 (acetone)과 증류수의 비율이 35:35:30 (v/v/v)되게 혼합하여 만든 구연산 아세톤용액을 추출완충액으로 한다

39 4. 시험용 평판의 조제 검사시료수를 고려하여 소요될 시험용 평판의 수를 산출하고 필요한 배지량을 결정한 후 다음과 같이 시험용 평판을 만든다. 가. 공병에 조제하고자 하는 량의 증류수를 가한 후 해당량의 시험용 배지 (TA)를 평량하여 넣고 가열판 (hot plate) 위에 놓아 배지를 끓이면서, 주기적으로 흔들어 준다. 나. 고압증기멸균기 (autoclave)를 사용하여 배지를 고압증기멸균 (121, 15분간)한 다음 약 50 항온수조 혹은 배양기에서 약 2시간 둔다. 다. 해당 배지 100 ml 당 시험균액 0.5 ml (배지량의 0.5 %) 첨가하여 시험균액이 고르게 혼합되도록 약 1분간 잘 혼합한다. 라. 10 ml용 멸균피펫으로 시험균액 혼합 배지 8 ml씩을 취하여 해당 petrii- dish에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 약 10분간 방치하여 배지를 굳힌다. 마. 이것을 시험용 평판으로 사용하며, 곧바로 시험용 평판을 사용하지 않을 경우 랩으로 싸서 4 냉장고에 보관한다. 조제한 시험용 평판은 4 냉장보관하면서 2~3 일내 사용한다. 5. 시료의 전처리 및 검사 가. 시료의 전처리 시료균질백 (stomacher bag)에 전란액 시료10 g씩 취한 후 구연산 아세톤용액 10 ml씩 가한다. 시료균질백 4~6개를 포개어 균질기 (stomacher)에 고정한 후 2분간 균질화 한다. 85 항온수조에서 15분간 가열하여 얼음물에 식힌 후 형성되는 맑은 추출액을 시험 용액으로 한다. 나. 시료의 검사 시험용평판위에 시료추출액을 흡수시킨 디스크를 올려 가볍게 눌러 고착시켜 30 배양기에 넣어 16~18시간 배양한 후 플루오로퀴놀론계 항균물질의 잔류여부를 판정한다. 6. 시험결과 판정 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용하여 시험균의 발육억제대를 측정한 결과, 디스크의 직경 10 mm를 포함하여 억제대가 12 mm 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정한다. 억제대 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다

40 Ⅱ-4 혈청 등 체액시료의 잔류 항균물질 간이검사법 가축의 혈청, 뇨, 담즙 등 체액시료에서 항균물질을 검출하기 위한 간이검사법으로서 식육 중 잔류물질 검사요령 (농식품부고시)에 의거하여 축주가 잔류의심축군의 시료를 채취하여 의뢰할 경우 검사하는 출하 전 생체잔류검사시 사용한다. 설파제 간이검사를 위하여 TLC법 (Su1fa On-Site, SOS), 항균물질의 간이검사를 위하여 미생물학적 방법 (BmDA법, EEC 4-plate법), 형광면역분석법, 미생물수용체법 등을 이용할 수 있다. II-4-1. 박층크로마토그래피 (SOS 검사) 박층크로마토그라프법 (TLC)은 paper chromatography에서 한 단계 발전한 방법으로 일반적 으로 Silica gel G, alumina 등을 흡착시킨 TLC plate를 사용하여 표준용액과 전처리한 시료를 점적하여 이동상용매에 전개시킨 후 형광을 띄도록 발색시켜 자외선등(ultraviolet lamp)하에서 잔류물질의 검출여부를 검사하는 방법이다. TLC법을 이용한 대표적인 검사키트가 SOS (Sulfa On Sites) 로서 돼지의 혈청을 포함해 오줌 및 사료에서 sulfamethazine을 검사하도록 개발된 방법으로 저농도 0.4 μg ml -1 과 고농도 1.3 μg ml -1 의 sulfamethazine 농도를 대조로 사용하여 결과를 판정한다. 측정원리는 시료를 점적하여 건조시킨 후 이동상 용매가 들어있는 전개조에 TLC plate를 담가두면 이동상 용매가 lane의 흡착제를 따라 위쪽으로 이동하면서 이동상에 용해성이 있는 점적된 화합물도 동시에 이동상을 따라 위쪽으로 이동하게 된다. 일반적으로 동일한 화합물의 경우 이동거리는 같지만 각각의 화합물마다 이동상에 대한 용해도(solubility)가 다르기 때문에 각각의 화합물마다 이동거리가 달라진다. 이동상이 plate상의 적절한 위치까지 이동하였을 때 plate를 이동상에서 꺼내고 온풍으로 이동상용매를 증발시킨 다음lane에 남아있는 화합물과 결합하는 발색제를 plate에 분무하면 자외선등하에서 형광을 관찰할 수 있게 된다. 형광강도는 lane에 남아있는 fluorescing 화합물의 양에 의해서 결정된다. 시료의 검사결과는 분석물질의 이동거리 (Rf값)와 표준용액의 형광강도 (밝기정도)와 비교 하여 판정한다. 시료의 형광띠가 sulfamethazine 표준품의 것보다 높거나 낮은 위치에 형성되면 sulfamethazine이 아닌 다른 설파제일 수 있다. 형광강도는 시료가 표준용액과 같은 화합물 이면서 더 높은 농도라면 표준용액의 band와 같은 높이에서 보다 밝은 형광을 띠게 된다. SOS 검사키트는 본래 sulfamethazine의 검사 목적으로 판매되고 있지만sulfamethazine 이외에 대부분 설파제도 이 키트에서 검출된다. Sulfamethazine과 이동상에 대한 용해도가 비슷한 설파제인 경우 거의 동일선상에 위치하게 된다. 특히, sulfamerazine, sulfamonomethoxine,

41 sulfadiazine, sulfamethoxpyridazine 등의 경우 sulfamethazine의 Rf값과 거의 일치하며, sulfadi -methoxine, sulfaquinoxaline, sulfachlorpyridazine, sulfamethoxazole 등은 sulfamethazine에 비해 형광띠가 높게 위치하는 반면sulfathiazole과 sulfisomidine 등은 훨씬 낮게 위치한다. 형광강도에 있어서는 sulfamethazine과 동일한 농도일 경우 거의 유사한 형광강도를 나타낸다. 출하전 생체잔류검사나 규제검사 혹은 수출돈육의 원료돈 (예비)검사시 SOS 검사키트를 이용하여 설파제를 검사할 경우 근육 중 설파제의잔류위반을 막기 위해서는sulfamethazine의 체내동태학인 체조직간의 잔류비율을 고려할 때 뇨에서는 1.3 μg ml -1 미만, 혈청에서는 0.4 μg ml -1 미만 수준이어야 한다. 1. 시료의 준비 오줌시료는 전처리 없이 그대로 사용하며, 혈청시료는 혈청 1 ml에 methanol 2 ml를 가하여 가볍게 혼합하여 r/min에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 사용한다. 2. 시험방법 가. 전개조의 준비 1) 1차 전개조 (methanol 용액)에 바닥에서 약 0.6 cm 되도록 methanol을 채우고 뚜껑을 덮는다. 2) 2차 전개조 (ethyl acetate 용액)에도 바닥에서 약 0.6 cm 되도록 ethyl acetate를 채우고 뚜껑을 덮는다. 나. TLC plate의 준비 1) TLC plate를 깨끗한 작업대에 평평하게 장치한다. TLC plate의 넓이에 맞게 만들어 나온 라벨을 spotting area의 반대쪽 가장자리에 붙인다. 2) 연필로 X자 칸을 제외한 1~3, 4~7 lane에 시료번호를 기입한다. 3) 눈금자를 사용해 spotting area 상단으로부터 2 cm가 되는 부위에 연필로 표시를 한다. 다. 시료 및 표준용액의 점적 1) Micropipette 또는 capillary pipette를 사용하여 오줌시료 20 μl 또는 혈청시료 20 μl (3 회)를 취한다. 2) TLC plate 각 lane의 spotting area 중앙부위에 피펫을 약간 비스듬히 위치시킨 후 서서히 시험용액을 점적한다. 3) LS lane에는 저농도 설파메타진 표준용액 (LS sufametazine 0.4 ppm) 20 μl를 점적하고 HS lane에는 고농도 설파메타진 표준용액(HS sulfametazine 1.3 ppm) 20 μl를 점적한다

42 4) TLC plate에 라벨이 붙은 부위를 잡고 45 로 기울인 후 blow dryer로 모든 시료와 표준용액의 점적이 마를 때까지 건조시킨다. 라. TLC plate의 전개 1) 1차 전개조 (methanol 용매)내 전개 (1) Methanol 전개조의 뚜껑을 열고 TLC plate를 조심스럽게 전개조 안에 장치한 후 뚜껑을 덮는다. 이때 이동상용매인 methanol은 spotting area의 시료와 표준용액이 점적된 부위에 닿지 않아야 한다. (2) 이동상 용매에 적셔진 부위가 spotting area의 상단에 닿자마자 전개조의 뚜껑을 열고 라벨된 윗부분을 잡고 TLC plate를 꺼낸 후 뚜껑을 덮는다. (3) TLC plate를 45 각도로 기울이고 blow dryer로 spotting area가 마를 때까지 건조시킨다. 2) 2차 전개조 (ethyl acetate 용매)내 전개 (1) Ethyl acetate 전개조의 뚜껑을 열고 TLC plate를 조심스럽게 전개조 안에 장치한 후 뚜껑을 덮는다. (2) Spotting area의 상단에서 2 cm 표시 부분까지 전개되면 TLC plate 상단부위를 잡고 TLC plate를 꺼낸다. (3) TLC plate를 45 각도로 기울이고 blow dryer로 모든 lanes이 마를 때까지 건조시킨다. (4) 가능한 한 fume hood하에서 fluorescamine 용액 (acetone에 0.03~0.05 %의 농도로 녹인 용액) 시약병의 뚜껑을 제거하고 spray pump를 장치한 후 TLC plate의 라벨부위를 잡아 약 10~15 cm 정도 떨어지게 위치시켜 45 각도로 기울여 TLC plate 전개부위의 평판 표면에 조심스럽게 3~4회 균일하게 분무한다. (5) TLC plate를 developing process가 일어나도록 하기 위해 어두운 곳에 10~15분간 방치한다. (6) UV light을 켜고 viewing port를 통해 주의 깊게 TLC plate를 관찰한다. 형광띠는 약간 곡선 또는 타원형으로 HS띠가 LS띠보다 현저하게 밝게 나타난다. 3. 판 정 SOS 검사법에 의한 결과 판정은 전개한 후 발색시킨 TLC plate를 UV하에서 형광강도와 Rf값을 구하여 판정한다. 형광띠 (band)의 위치가 Rf 값으로 0.80~0.95 범위이고 형광강도 (밝기정도)가 설파메타진을 기준으로 뇨 중 1.3 ppm (고농도) 이상이거나 혈청 중 0.4 ppm (저농도)이상일 때 양성으로 판정한다

43 SOS 킷트에 의한 설파제의 검출양상 (Rf값 기준) Rf value 설 파 제 0.8 미만 Sulfisomidine (0.68~0.71), Sulfathiazole (0.73~0.74) 0.8~0.95 Sulfamethizole (0.81~0.83), Sulfadiazine (0.84~0.86), Sulfamethoxipyridazine (0.85~0.86), Sulfapyridine (0.87~0.89), Sulfamethazine (0.86~0.89), Sulfamerazine (0.87~0.89), Sulfamonomethoxine (0.87~0.91), Sulfadimethoxine & Sulfaquinoxaline (0.89~0.92), Sulfachlorpyridazine (0.92~0.94), Sulfamethoxazole & Sulfisoxazole (0.92~0.94) II-4-2. 미생물학적 방법 (BmDA 법) 1. 시험재료 가. 시험균: Bacillus megaterium ATCC 9885 나. 배지 1) 계대보존용: Tryptic soy agar (TSA, Difco) 2) 증균 및 아포 조제용: AK #2 sporulating agar (BBL) 3) 시험용: PM indicator agar (Difco) 4) 아포조제 첨가용: Agar (Difco) 5) 균수측정용: Plate count agar (Difco) 다. 시험용 기구 1) Filter paper disc - 시험평판 검사용: 감수성시험용 neomycin disc (5 mcg, Difco) - 지육검사용: 직경 10 mm (Adventec No ) 2) perti-dish (87 15 mm, 녹십자 등 규격품) 3) 캘리퍼스 또는 플라스틱 눈금자 4) Roux bottle, 멸균유리구슬 (4 mm), 멸균원심분리관 (50 ml), 원심분리기 ( r/min 및 swinging bucket head용), 균질기, 혼합기, 항온수조, 배양기 (45 ), 초음파세척기 등

44 2. 시험균액 조제 가. 아포액 조제 증균 및 아포조제용 사면배지에 계대보존한 시험균을37 에서 2일간 배양한 후 멸균유리 구슬과 2 3 ml 멸균증류수를 넣고 사면배지의 균을 집균한다. 미리 증균 및 아포조제용 배지에 agar를 0.5 % 추가하여 만든 배지를 roux bottle에 250~300 ml씩 분주하여 고압 증기멸균한 후 굳힌 평판에 시험균 부유액을 접종하여 고르게 편 다음37 에서 18~24시간 배양하고 배양기에서 roux bottle을 꺼내 실온에 6일간 방치한다. Roux bottle에 멸균유리 구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣고 조심스럽게 흔들어 집균하여 멸균원침관에 옮긴 후 65 항온수조에서 30분간 가열한다 r/min으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 침전물에 다시 일정량의 멸균증류수로 부유시켜 원심분리하여 상층액을 버리는 과정을 3회 반복한 후 침전물을 멸균증류수 20 ml에 재부유시킨다. 나. 아포액의 정제 멸균한 200~300 ml 공병에 3 M 인산염완충액 (ph 7.1, KH 2 PO g과 K 2 HPO g을 증류수로 녹여 1 L가 되도록 한 후 여과 멸균한 완충액: A용액) 34.1 ml와 polyethyleneglycol (B 용액) 11.8 g를 합하여 혼합하고 멸균증류수로 100 ml가 되도록 하여 멸균균질기통에 넣고 r/min, 5분간 균질화하여 혼합액을 버린 후 이 과정을 동일한 방법으로 한 번 더 반복한다. 멸균한 100 ml 실린더에 동량의 A용액과 B를 합하고 25 ml의 아포액을 넣어 멸균증류수로 100 ml가 되도록 하여 혼합한 다음 전량을 멸균 균질기통에 넣어 r/min으로 5분간 균질화 한다. 4 개의 멸균 원심분리관에 동량으로 분주하여 swinging bucket head로 구성된 원심분리기를 사용하여 실온에서 r/min (1 500 g)으로 2분간 원심분리한다. 멸균된 10 ml용 피펫으로 원심분리관 윗부분의 아포액층을 주의깊게 취한 다음 5, ~ r/min으로 20분간 원심분리한다. 원심분리 후 상층액을 제거한 다음 멸균유리구슬과 멸균증류수를 가하여 하부의 butt (아포층)를 부유시킨다. 아포부유액을 멸균 원심분리관에 취하여 동일한 원심분리조건 으로 총 5회 세척한다. 최종 원심세척한 다음 침전된 각 butt를 여과멸균한 50 % ethanol 20 ml에 재 부유시켜 모든 아포정제액을 합한 후 plate count agar로 균수를 측정한다. 정제한 아포액을 50 % ethanol로 CFU/mL 농도가 되도록 희석하여 냉장보관하면서 6 개월 정도 사용한다. 3. 시험용 평판의 조제 및 균주 도말 가. 시험용 평판 하나의 시험용 배지를 만들어 약 50 로 식힌 후 perti-dish에 8 ml씩 분주하여 평판을 만들어 사용한다

45 나. 시험균액 도말 멸균면봉으로 시험균액을 흡수시켜 바이알벽에 한 번 비틀어 여분의 아포액을 제거한 후 왼손으로 시험용 평판을 45 각도로 잡고 오른손으로 면봉을 시험용 평판의 중앙 부위에서 측면쪽으로 아포를 도말한다. 시계반대방향으로 시험용 평판을 90 각도로 돌려 동일하게 도말하고 동일한 방법으로 돌리면서 2회 더 도말한다. 이렇게 하면 시험용 평판은 한바퀴 돌려진 상태가 되며 각 표면에는 두 번씩 도말된 상태가 된다. 한번 사용한 면봉은 버리고 새로운 면봉을 사용한다. 4. 시험용 평판 및 시료 검사 가. 시험용 평판 검사 하나의 평판에4~6개의 시료를 검사함과 아울러 항생제 감수성시험용 네오마이신 디스크를 평판의 중심부에 올려 시험용 평판의검출능을 비롯한 시험조건이 적절한지의 여부를 점검한다. PM indicator agar를 시험용배지로 하는 이 방법의 경우 감수성시험용 네오마이신 디스크의 발육 억제대 직경은 14~20 mm 수준이어야 적합하다. 나. 시료 검사 핀셋으로 디스크를 취하여 오줌 또는 혈청시료에 디스크의 약1/3이 잠기게 하여 흡수시킨 후 시험용 평판 위에 올려놓고 가볍게 눌러 부착시킨다. 시험용 평판을 거꾸로 도치시켜 (44~45) 에서 3.5~4시간 배양한 후 결과를 판정한다. 이 때 배양기에는 비이커에 물을 담아두어 시험용 평판의 건조를 방지한다. 5. 시험 결과 판정 시험결과 시험균 발육억제대가 형성되지 않으면 음성으로 판정하고 직경 12 mm 이상의 발육억제대가 형성되면 항균물질 양성으로 판정한다. 식육 중 잔류물질 검사요령(농식품부고시)에 의거 규제검사를 실시하는 경우 이 시험법이나 TLC법 등의 간이검사법에 의해 양성시료에 대해서는 근육시료에서 미생물 수용체 분석법, HPLC 등으로 확인 정량분석을 실시한다

46 BmDA법에 의한 항균물질의 검출감도 항균물질 검출한계 (LOD, μg ml -1 ) 항균물질 검출한계 (LOD, μg ml -1 ) Sulfamethazine 1.0 Spiramycin 0.1 Sulfamerazine 1.0 Tylosin 0.25 Sulfadiazine 1.0 Chlortetracycline 0.5 Sulfamonomethoxine 0.5 Oxytetracycline 1.0 Sulfaquinoxaline 0.5 Tetracycline 1.0 Sulfathiazole 1.0 Bacitracin 0.5 Sulfisoxazole 1.0 Virginiamycin 0.25 Sulfisomidine 1.0 Monensin 10.0 Sulfadimethoxine 0.5 Salinomycin 10.0 Sulfachlorpyridazine 1.0 Novobiocin 2.5 Sulfamethoxypyridazine 0.5 Chloramphenicol 2.5 Penicillin G 0.05 Furazolidone 0.5 Ampicillin 0.05 Oxolinic acid 2.5 Amoxicillin 0.05 Enrofloxacin 0.5 Cloxacillin 0.25 Carbadox 10.0 Gentamicin 1.0 Olaquindox >100 Neomycin 2.5 Ormethoprim 2.5 Streptomycin 1.0 Trimethoprim 0.25 Hygromycin B 5.0 Thiamphenicol 10.0 Erythromycin 0.05 Amprolium >1000 Oleandomycin 0.25 Clopidol >

47 Ⅱ-5 신속간이검사킷트 소개 아래에 소개된 신속간이검사킷트는 농림수산검역검사본부에서 검증이 완료된 공인 킷트가 아니며, 국내에서 판매중인 킷트를 소개한 것이다. 검사물질별로 잔류허용기준 이하를 검출할 수 있는 방법을 적용하고, 킷트별 결과 판정은 제조회사의 결과판정 요령에 따른다. 만약 결과에 대하여 의문이 있다고 인정될 때에는 규정한 방법에 의하여 시험하고 판정하여야 한다. II-5-1. Premi Test kit 1. 원리 네덜란드 DSM사에서 개발한 미생물학적 간이검사킷트로서 고온균인 B. stearothermophilus 균주를 이용하여 이 균의 성장억제 여부를 확인함으로써 근육, 신장 등의 축산물에서 항생제 등의 잔류 여부를 검사할 수 있다. 결과 판독까지 4시간 정도 소요되며, 색깔 변화만으로 양성/음성 반응을 판단할 수 있다. 동물에 사용되는 여러 종류의 항균물질을 축산물에서 광범위하게 검출할 수 있으나, 엔로플록사신을 비롯한 퀴놀론계 항균물질에는 검출감도가 떨어지는 경향이 있다. 이 킷트는 우리나라에서 잔류위반 발생률이 높은 설파제, 테트라싸이 클린계 등 잔류항생제의 검출을 위하여 적용할 수 있다. 2. 시험재료 1) Premi Test Kit (Test ampoule) : 25 ampoules/box 2) Starter Kit (간이 Incubator) 3. 시험방법 1) 2 cm 3 정도 근육을 채취하여 식육압착기 (meat press)에 넣고 250 μl 정도 육즙을 낸다. 2) 검사용 킷트에 육즙 100 μl를 정확히 주입한다. 3) 앰플을 실온에서 20 분 정도 둔다. 신장즙의 경우, 80 에서 약 10분간 inactivation 시킨다

48 4) 육즙을 증류수로 두번 정도 세척하고 남은 물을 튜브에서 조심스럽게 빼낸다. 5) 앰플을 호일로 덮고, starter kit (간이 Incubator)를 이용하여 64 에서 약 3시간 배양한다. 6) 음성대조의 색상과 비교 하여 결과 판독한다 (노랑색-녹색 음성, 파랑색-보라색 양성). Premi Test kit를 이용한 항균물질 신속간이검사법 양 성 음 성 제조사 (DSM, 네덜란드)가 제시하는 Premi kit의 검출능 (단위 : ng/g)

49 II-5-2. KIS (Kidney Inhibition Swab) Test kit 1. 원리 미국 Charm Sciences사에서 개발한 미생물학적 간이검사킷트로서B. stearothermophilus 균주를 이용하여 냉장 또는 냉동상태의 신장에서 항생제 등 잔류물질을 간이검사할 수 있다. 조직을 절개하여 면봉으로 swab한 후 incubator에서 배양하여 색의 변화로 음성과 양성을 판별한다. 항균물질이 잔류하는 경우 배지내 미생물 증식이 억제되어 처음의 보라색이 그대로 유지되는 반면, 항균물질이 잔류하지 않는 경우 미생물이 증식하면서 배지의 색이 노란색으로 바뀐다. 2. 시험재료 1) Kidney Inhibition Swab : 100 tests/box 2) KIS Test Incubator : 4, 8, 또는 20 tests/incubator 3. 시험방법 1) 신장 부위에 면봉을 삽입한 후, 15 분 정도 방치하여 신장액이 충분히 스며들도록 한다. 소와 돼지 신장의 경우1-2 cm 깊이로 원형으로 절개하여 신장피질 부위에서 면봉팁을 돌리고 움직여 30 초간 흡수시킨다 (80 μl이상). 2) 몸통부위 (Swab device)를 위아래로 움직여 vial 상층부위 희석완충액 (dilution buffer)가 담겨진 부위 윗부분에 면봉이 약 1/3정도 잠기도록 한 후, 2분간 정치한다. 3) 2 분후, 몸통부위를 약 5회 위아래로 움직여 면봉 끝부분이vial 바닥부분으로 관통하여 희석완충액이 들어가도록 밀어 넣은 후 후진시킨다. 4) 65 에서 약 2시간 45분간 배양한 후, 결과를 판독한다. 5) 노랑색이나 녹색이면 음성, 파랑색이나 보라색이면 양성으로 판정한다. 제조사가 제시하는 KIS 킷트의 검출능 Antibiotics 검출감도 (ppm) MRL* (ppm) Antibiotics 검출감도 (ppm) MRL (ppm) Tetacyclines CTC/OTC/TC β-lactams Oxytertracycline 2.0 합으로 1.2 Penicillin G Sulfonamides Macrolides 총설파제 Sulfamethazine Tylosin Sulfadimethoxine 0.1 * 국내 닭고기의 잔류허용기준

50 KIS TM Test kit를 이용한 신장내 항균물질 신속간이검사법 신장 부위에 면봉을 삽입한 후, 15 분정도 방치하여 신장액이 충분히 스며들도록 한다. 몸통부위를 위아래로 움직여 vial 상층부위 배지가 담겨진 부위에 닿도록한 후, 2분간 정치한다. 2 분후, 몸통부위를 위아래로 움직이는 작업을 반복한 후, vial 바닥까지 면봉이 닿도록한다. 65 에서 약 3시간 배양한 후, 결과를 판독한다

51 II-5-3. ROSA (Rapid One Step Assay) kit 1. 원리 면역크로마토그래피법을 이용한 잔류물질 검사방법으로 항원으로 작용하는 잔류 물질과 이들에 대한 항체, 즉, 항원 항체 반응을 이용하여 표지물질로서 색깔을 지닌 작은 입자(40 nm 정도의 collidal gold particle)를 사용하여 항원항체반응 결과를 판정한다. 지금까지 면역크로마토그래피법을 이용한 검사법은 주로 사람의 질병 및 임신진단 목적으로 개발되어 왔으나 1996년에 우유내 progesterone을 반정량적으로 측정할 수 있는 신속검사법이 개발되었으며, 소의 오줌에서 sulfamethazine을 검출할 수 있는 방법도 개발되었다. 면역크로마토그래피 키트의 각 구성에 대한 모식도 면역크로마토그래피 키트는 모든 구성성분이 이미 작은 킷트 내에 포함되어 있어 시료를 킷트에 적용하는 것만이 검사자가 해야 할 유일한 과정으로, 사용이 간편하고 검사 소요시간이 10 분 이내로 매우 신속하게 검사할 수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 특징으로 목장 및 도축장에서도 다양한 검사 목적으로 사용할 수 있으며 발색체를 이용하므로 스크리닝 검사는 물론 반정량 검사에도 응용할 수 있다. 면역크로마토그래피법은 개개의 잔류 항균물질을 검출할 경우 특이성이나 검출 감도가 높고 신속하게 다량의 시료를 검사할 수 있는 장점 때문에 검사 킷트 형태로 이용되고 있다. 2. 시험재료 1) ROSA Enroflox Kit : 식육 100 tests/box 2) ROSA Incubator : 2, 4, 또는 8 tests/incubator 3) ROSA Reader : Optional

52 3. 시험방법 가. 시료 전처리 1) 50 ml 원심관에 20 ml 눈금까지 MSU buffer를 넣은 후 30 ml 눈금까지 근육조직 조각 (10 g)을 가한다. 추출완충액은 킷트에 포함된 추출완충액 조제용 1병을 1 L의 water에 녹인다. 조제한 추출완충액은 (0~7) 에서 2 개월간 보관하면서 사용할 수 있다. 2) Maxim food processor 안으로 근육조직과 MSU buffer를 부어 45 초간 균질화 한다. 1)과 2)과정 대신에 15 ml 시험관에 MSU 추출완충액 (extraction buffer) 2 ml를 첨가한 후 식육압착기 (meat press)에 근육 시료 약 (1-2) g을 넣고 압축하여 눈금 3 ml까지 맞추면 같은 결과가 된다. 3) 처음 사용한 50 ml 원심관에 균질화한 시료를 옮겨 r/min (1700 G)으로 10분간 원심분리한다. 4) 상층액 0.3 ml와 Enroflox 희석완충액 (dilution buffer) 0.3 ml를 가하여 혼합한다. 5) 조제한 추출완충액은 (0~7) 에서 보관한다. 나. 시험조작 미리 ROSA Strip incubator에 전원을 연결하여 온도를 (56±1) 로 맞추어 놓는다. 온도가 55 가 되면 녹색으로 나타난다. 1) 검사용 킷트 (test strip)의 평평한 면이 위쪽으로 향하도록 Strip incubator에 올려 놓고 라벨의 가장자리 시료패드 (sample pad) 부분의 tape를 벗긴다. 2) 시료패드 (sample pad)의 스펀지에 스며들도록 시료 희석용액300 μl를 수직으로 서서히 주입한다. 3) Sample pad 부분의 라벨을 눌러서 다시 밀봉하고 Strip incubator의 뚜껑을 닫고 잠근 후 적어도 8분간 배양후 strip을 꺼낸다. 8 분 후에 노란불이 깜박이기 시작하며 이후 2 분 이내에 꺼낸다. 4. 결과 판정 가. 육안으로 판정할 때 1) Incubator에서 sample pad 부분을 닿지 않도록 주의하여 strip을 꺼낸다. 2) Test line (T)과 control line (C)을 비교하기 위하여 수직을 잡는다. 3) T line이 C line보다 같거나 더 어두울 때는 음성으로 판정한다. 4) T line이 없거나 C line보다 밝을 때는 양성으로 판정한다

53 나. ROSA reader로 판독할 때 1) Reader 안에 test strip을 넣는다. 약 10 초 후에 Reader의 MRL channel에서 결과가 표시된다. 2) 음성 판정일 때 reader의 수치는 zero 또는 음성 수치가 표시되며, 결과는 Neg 또는 Not found 로 명시된다. 3) 양성 판정일 때 reader의 수치는 positive 수치가 표시되며, 결과는 positive 로 명시된다. 다. 양성으로 의심되는 시료의 확인 실험 양성으로 의심되는 시료의 경우에는 음성과 양성을 다시 한번 수행한다. 1) Negative control을 검사한 결과 negative의 결과가 나와야 한다. 2) Positive control을 결과한 결과 positive의 결과가 나와야 한다. 3) 실험을 재수행하여 시료가 양성으로 판정되면 시료는 양성으로 판정한다. CSI ROSA READER Version 1.07 Unit Serial Number 1299 Date: 17 OCT2003 Time: 13:59:29 Operator: 1 Channel: SLBL Lot: 063 Sample: 46-1 Limit: < 0 Strip Reading: Result: NEGATIVE II-5-4. SMART kit 1. 원리 3M에서 생산하고 있는 간이검사킷트로 면역크로마토그래피법을 이용한 잔류물질 검사 방법으로 항원으로 작용하는 잔류 물질과 이들에 대한 항체, 즉, 항원 항체 반응을 결과를 판정한여 식육내 잔류항균물질을 각 항생제 계열별로 10분 이내 신속 검사할수 있는 킷트이다. 식육에서 퀴놀론계 항생제를 검출할수 있는 2 Quinolones kit와 퀴놀론계, 설파제, 테트라싸이클린계, 베타-락탐계 4종의 항생제를 동시에 검출할 수 있는 Combination kit가 있다. 현재는 혈액이 많이 함유되지 않은 닭고기에서만 적용이 가능하다

54 면역크로마토그래피 키트의 각 구성에 대한 모식도 2. 시험재료 1) 2 Quinolone Kit : 100 tests/box 2) Combination Kit : 100 tests/box 3) Incubator (Heating block) : 3 tests/incubator 4) 3M Smart kit Reader : Optional 3. 시험방법 시료 전처리

55 500 μl r/min 150μL 150 μl 4. 결과 판정 가. 육안으로 판정할 때 1) Test line이 Control line보다 같거나 더 어두울 때는 음성으로 판정한다. 2) Test line이 없거나 Control line보다 밝을 때는 양성으로 판정한다

56 나. Reader로 판독할 때 1) Reader 안에 test strip을 넣는다. 약 10 초 후에 Reader의 MRL channel에서 결과가 표시된다. 2) 음성 판정일 때 reader의 수치는 zero 또는 음성 수치가 표시되며, 결과는 Neg 또는 Not found 로 명시된다. 3) 양성 판정일 때 reader의 수치는 positive 수치가 표시되며, 결과는 positive 로 명시된다. 다. 양성으로 의심되는 시료의 확인 실험 양성으로 의심되는 시료의 경우에는 음성과 양성을 다시 한번 수행한다. 1) Negative control을 검사한 결과 negative의 결과가 나와야 한다. 2) Positive control을 결과한 결과 positive의 결과가 나와야 한다. 3) 실험을 재수행하여 시료가 양성으로 판정되면 시료는 양성으로 판정한다

57 제조사가 제시하는 SMART Quinolones Kit의 검출능 Quinolone Detection level (ng/g) 1 Norfloxacin 50 2 Enrofloxacin 50 3 Danofloxacin 50 4 Oxolinic acid Ciprofloxacin 50 6 Flumequine Nalidixic acid 70 8 Ofloxacin 70 9 Lomefloxacin Sparfloxacin Enoxacin Orbifloxacin Marbofloxacin Pefloxacin 50 제조사가 제시하는 SMART Combination Kit의 검출능 Beta-lactam β-lactam Detection level (ng/g) 1 Amoxicillin 30 2 Ampicillin 20 3 Penicillin G 20 4 Cloxacillin 170 Sulfonamides Sulfa Detection level (ng/g) 1 Sulfathiazole Sulfachlopyridazine Sulfamethoxypyridazine Sulfamethoxazole Sulfamonomethoxine Sulfachlopyrazine Sulfadimethoxine Sulfadiazine Sulfamerazine Sulfamethazine Sulfaquinoxaline Sulfadoxine Sulfisoxazole Sulfapenazole

58 Quinolones Quinolone Detection level (ng/g) 1 Norfloxacin 50 2 Enrofloxacin 50 3 Danofloxacin Oxolinic acid Ciprofloxacin 50 6 Lomefloxacin 50 7 Enoxacin 60 8 Pefloxacin 50 Tetracyclines Tetra Detection level (ng/g) 1 Tetracycline Oxytetracycline Chlotetracycline methacycline Doxycycline Rolitetracycline 100 II-5-5. SensiCheck kit 1. 원리 국내 IR Lab에서 생산하고 있는 면역크로마토그래피법을 이용한 간이검사킷트로 식육, 유, 알 및 물고기내 퀴놀론계, 테트라싸이클린계, 베타-락탐계 항생제를 계열별로 검출할 수 있다. 2. 시험방법 가. 시료 전처리 1) 식육 (1) 식육 시료 (냉장, 냉동)를 3 ~ 5 g 준비한다 (냉동시료의 경우, 미리 해동하여 진행한다). (2) 마늘다지기를 이용하여 200 μl 이상 압착 추출한다. (3) 육즙 100 μl를 취하여 1.5 ml Micro tube에 옮기고, 제공된 Meat Dilution Buffer 100 μl를 추가한다. (4) Vortex Mixer를 이용하여 20초간 혼합한 후, 검사 시료로 사용한다

59 2) 우유 원유, 균질유, 액상화한 분유는 전처리 없이 시험에 바로 사용한다. 3) 식용란 (1) 검사할 계란의 난백과 난황을 믹서기를 사용하여30초간 잘 혼합한다(계란 5개 정도를 사용하여 용기의 50 % 정도가 되게 한다). (2) 전란액 300 μl를 취하여 1.5 ml Micro tube에 옮기고, 제공된 Egg Dilution Buffer 600 μl를 추가한다. (3) Vortex Mixer를 이용하여 20초간 혼합한 후, 검사 시료로 사용한다. 4) 수산물 (1) 수산물 시료를 3~5 g 준비한다 (2) 마늘다지기를 이용하여 200 μl 이상 압착 추출한다. 추출액 100 μl를 취하여 1.5 ml Micro tube에 옮기고, 제공된 Meat Dilution Buffer 200 μl를 추가한다. (3) Vortex Mixer를 이용하여 20초간 혼합한 후, 검사 시료로 사용한다. 나. 시험 조작 모든 반응은 실온에서 진행한다. 1) 준비된 시료 150 μl를 Test kit의 시료 부위에 떨어뜨린 후 5분간 상온에서 반응한다. 2) 만약 5분 후 결과가 나오지 않는다면 추가 반응시간을 5분 가량 늘린다 3. 결과 판정 검출선 (T)과 대조선 (C)의 진하기 정도를 비교하여 결과를 판단한다. 가. 육안으로 판정할 때 1) T line을 C line과 비교하여 검출선의 진하기가 대조선과 유사하거나 진한 경우에는 음성으로 판정한다

60 2) T line의 진하기가 C line의 1/2 이하일 경우 의양성으로 판정한다. 나. SensiCheck reader로 판독할 때 1) 반응 후, 리더기에 스캔하여 측정값을 기록한다. 2) 음양성 표준 시료의 측정값을 기준으로 의양성 여부를 판정한다. 다. 의양성 시료의 확인실험 의양성 시료의 경우에는 음성과 양성을 다시 한 번 수행한다. 1) Negative Control을 검사한 결과 Negative의 결과가 나와야 한다. 2) Positive Control을 검사한 결과 Positive의 결과가 나와야 한다. 3) 실험을 재수행하여 시료가 양성으로 판정되면 시료는 양성으로 판정한다. 제조사가 제시하는 SensiCheck Kit Quinolones 검출능

61 제조사가 제시하는 SensiCheck Kit β-lactams 검출능 제조사가 제시하는 SensiCheck Kit Tetracyclines 검출능

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63 Ⅲ 미생물수용체법

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65 III. 미생물수용체법 (Charm II Receptor Assay) 1. 원리 미생물수용체법의 측정원리는 효소면역분석법과 동일한 형태로 항균물질의 수용체를 지니고 있는 미생물세포 또는 미생물세포에 결합하는 특이항체와 시료 중의 항균물질이 결합하는 원리를 이용한다. 시판 킷트로는 미국 charm sciences사에서 개발한 charm II assay와 국내 (주)인투젠에서 개발한 TAB (Test for AntiBiotics)이 있다. 방사성동위원소인 [ 14 C] 또는 [ 3 H]로 표지된 항균물질(tracer)이 이용되며, 미생물의 수용체나 항체에[ 14 C] 또는 [ 3 H]이 표지된 항균물질을 연속적으로 혹은 경쟁적으로 반응시켜 결합된 표지항균물질의 방사능을 측정하여 시료 중의 잔류 항균물질을 계열별로 정성 혹은 정량적으로 분석한다. 즉 항균물질의 수용체를 지니고 있는 미생물세포 또는 특이항체에 잔류물질이 들어있는 시료가 첨가되면 시료내 잔류 항균물질은 미생물 세포에 존재하는 수용체와 결합하게 되며, 시료에 항균물질이 잔류되어 이미 결합되면 [ 14 C] 또는 [ 3 H]가 표지된 항균물질이 첨가되더라도 수용체에 결합을 방해하는 결과가 된다. 따라서 [ 14 C] 또는 [ 3 H]로 표지된 항균물질이 수용체에 적게 결합하면 할수록 시료 중에는 항균물질이 많이 잔류하는 결과가 된다. 이러한 세포 수용체와 결합된 [ 14 C] 또는 [ 3 H] 량을 방사성동위원소 측정장치 (scintillation counter)로 측정하며, 일정수준까지 시료에 항균물질이 많이 잔류되어 있을수록 측정값(count per minute, cpm)은 적어진다. 미생물수용체법을 이용해 식육에서 검사 가능한 항균물질은 베타-락탐계, 마크로 라이드계, 설파제, 아미노글라이코사이드계, 테트라사이클린계, 클로람페니콜 등이며, 특정 항균 단일물질을 검사하는 것이 아니라 계열별 항균물질을 검사할 수 있다. 적용범위는 쇠고기, 돼지고기, 닭고기 및 어육(연어) 등의 근육 조직 뿐만 아니라 신장, 간 등과 같은 다른 조직에도 이용될 수 있다. 2. 시험재료 1) Charm II kit tablet reagents: Aminoglycosides, Amphenicols, β-lactams, Macrolides, Sulfonamides, Tetracyclines 등 2) Zero & Positive control standard 3) Scintillation fluid : Optifluor r 또는 동등품 4) Analyzer (Scintillation counter)

66 5) Borosilicate glass test tube 6) Heating block : 35, 65, 80 7) Centrifuge : G 8) Centrifuge tube : 50 ml 9) Micropipette & Pipette tip : 100 μl, 1000 μl 10) Cotton swab 등 3. 첨가시료 조제 및 control point 설정 가. 항균물질 첨가시료 (fortified sample)의 조제 이 항균물질 첨가시료는 설파제, 베타-락탐계 및 테트라싸이클린계 항균물질을 제외한 마크로라이드계, 아미노글리코사이드계 항균물질 및 클로람페니콜의 control point를 설정하기 위하여 조제한다. 1) 항균물질이 오염되지 않은 시료를 확보하여 축종별6개의 작은 크기로 자른 식육시료 10 g씩을 50 ml 원심분리관에 취한다. 2) 냉장 보관중인 복합 항균물질 표준품 1 개를 꺼내 실온이 되도록 한 후 증류수 10 ml를 가하여 잘 녹인 다음 얼음이나 냉장고에 15분간 방치한다. 3) 축종별 6개의 식육시료에 10 ml로 녹인 복합항균 물질 표준품 0.5 ml를 첨가한 후 실온에서 약 30분간 방치한다. 설파메타진 첨가시료 조제시 1 ml를 사용한다. 4) MSU extraction buffer를 원심분리관의 40 ml 눈금 표시선까지 채운다. 이하 4. 전처리 방법 가. 2) 라) 단계부터는 검사시료와 동일하게 처리하여 항균물질 계열별 시험방법에 따라 cpm 값을 구한다. 나. Control point 설정 Control point란 시료 중에 당해 계열 항균물질의 잔류여부를 판정하는 기준값으로서 음성시료 (negative)인지 양성추정시료 (suspect)인지를 결정하는 기준이 된다. 시료의 검사 결과 control point보다 수치가 크면 검사시료는 음성임을 의미하며, control point의 수치와 같거나 적으면 검사시료는 양성추정시료를 의미한다. 양성추정시료는 가능한 positive control 및 negative control과 함께 재시험할 것을 권장한다. Control point는 설파제, 베타-락탐계 및 테트라싸이클린계 항균물질을 제외하고 나머지 계열의 항균물질은 항균물질 계열별 6개의 항균물질 음성시료를 택하여 복합 항균물질 표준품을 첨가하여 설정한다. 이들 세가지 계열의 항균물질은 6개의 음성대조 (negative control)를 사용하여 측정한 cpm의 평균값에서 항균물질 계열별 일정비율을 감하여 설정하고, 베타-락탐계 항균물질 등 나머지 계열의 항균물질은 첨가시료를 만들어 설정 한다

67 1) 설파제, 베타 - 락탐계 및 테트라싸이클린계 항균물질 (1) 6개의 음성대조시료 (negative control)를 조제하여 이들 계열의 항균물질 시험 방법에 따라 cpm값을 측정한다. 음성대조시료는 tissue performance negative concentrate 2 ml과 MSU extraction buffer 6 ml로 희석하여 사용한다. (2) 항균물질 계열별 cpm 값의 평균을 구한다. (3) 평균값에서 평균의 40 % (베타-락탐계는 30 %)를 감하여 control point를 설정한다. 2) 마크로라이드계, 아미노글리코사이드계 항균물질 및 클로람페니콜 (1) 6개의 첨가시료에 대한 cpm 값의 평균을 구한다. (2) 평균값에 평균의 20 % (마크로라이드계는 40 %)를 더하여 control point를 설정한다. 복합 항균물질 표준품 (MultII-antimicrobial concentrate standard)의 농도 구 분 조직내 첨가 농도 Performance monitoring 항균물질 증류수 10 ml로 녹인 표준품의 농도 (ng/ml) 조직내 농도 (ng/g) 추출액내 농도 (ng/ml) 용액내 농도 (ng/ml) Penicillin G Erythromycin Sulfamethazine * Streptomycin Chloretracycline Chloramphenicol 전처리 방법 - Food Processor 가. 식육 1) 전처리시 주의사항 (1) 식육 중 지방층은 방해물질로 작용할 수 있으므로 추출과정에 들어가기 전에 과도한 지방층은 제거한다. (2) 시료는 가능한 당일에 추출하도록 하고 추출액은 측정과정에 들어가기 직전에 바로 실온에 도달될 수 있도록 유지한다. (3) 시료는 가급적 신선육을 사용하고 냉동시료는 추출 직전까지 냉동 보관된 것을 사용 한다