미생물과 감염관리

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지수 천
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1 감염관리를위한진단검사 가톨릭관동의대진단검사의학교실 부교수이혁민

2 검사실의원내감염관리에서역할 ( 병원 ) 감염질환진단을위한검사 지속적인감염관리자료보고 보균자및병원환경의감시배양 역학검사

3 Table 1. 집단감염발생조사단계및검사실의역할 번호조사단계검사실의역할 1 문제인식 2 감염정의 (Definition) 감시및조기경보 ( 검사정보시스템 ) 드문내성형또는환자간전파 조사대상감염에대한정의를결정할때검사실진단에대한자문및조언 3 감염확진 조사대상감염의확인진단 4 사례발굴완료 5 감염률설정 6 집단감염특성조사 7 가설설정 원인파악및실험 대상균주특성조사 무균검체분리주및중요검체보관 사례발굴을위한검사정보시스템검색 Baseline 및의심되는 epidemic 구역별검체별감염률 역학적연관성조사 (Typing) 기존의감염균주와비교 추가적인실험또는배양시행 8 감염관리수행 필요한경우검사실수시변경 9 감염관리효과평가 지속적인감시및조기경보

4 감염의상호관계 병원균 세 균 기회감염균 비병원균 X 숙 주 환 경

5 병원균과기회감염균 병원균 : 분리되면대부분의경우감염균으로간주 비병원균 : 다수분리되어도병원균인경우는거의없음 기회감염균 : 미생물, 숙주, 환경의역학관계에따라감염 정상균무리 ( 상재균, Normal flora) 체표또는체내에서무리를이루어증식 ( 입속의사슬알균, 장속의대장균 ) 면역력과병독소가균형을이루는미생물 집락화 (Colonization) 정상균무리와유사 해부학적또는미생물학적으로관계없는부위에존재

6 감염질환의진단

7 임상미생물검사의종류 검사종류 민감도 특이도 TAT 비용 직접검사법 L (>10 5 ) L H L or M Gram stain AFB stain Antigen test M H H M Antibody test M M L M 특수장비인력 X X X 배양법 선택배지 / 비선택배지 (Plate) 증균배지 (Broth) H (> ) (< ) H L M O 분자유전학적검사법 PCR PCR-Hybridization H (> ) H H H O Abbreviations: L, Low; M, Middle; H, High.

8 미생물검사별결과보고시간 검사종류 Minutes Hours Days Months 그람염색 10 AFB 염색 2 항원검사 60 세균배양 2-3 혈액배양 5 결핵배양 2 PCR 3-6

9 미생물감염질환의진단 검사종류세균결핵균 Mycoplasma Chlamydia 진균 바이러스 그람염색 O X X O X 특수염색 O O O X 항원검사 O O O 항체검사 O X O X O 일반배양 O X X O X 특수배양 O O X O O 분자진단 O O O O

10 세균질환의진단 병원균의감염진단 : 특정균의존재여부로진단가능 항원검사 항체검사 ( 최근 2-4주간의항체가상승 ) 배양검사 분자진단검사 기회감염균의감염진단 항체검사 ( 최근 2-4주간의항체가상승 ) 배양검사 상재균이없는부위감염 상재균이있는부위감염 ( 균의존재만으로진단불가 )

11 그람염색 검체에서가장빨리세균확인 균종추정가능 : 그람양성및음성 염증반응판정 : 백혈구종류와수 검체의질평가 : 상피세포갯수 해석어려움 항균제, 증식이덜된또는오래된세균 그람양성이음성으로 간균이아주길어지거나공모양으로

12 임상적으로중요한세균의분류 Aerobes Anaerobes Cocci Bacilli Cocci Bacilli Bacillus Propionibactrium Gram + Staphylococcus Streptococcus Enterococcus Corynebacterium Listeria Erysipelothrix Peptostreptococcus Peptococcus Eubacterium Lactobacillus Antinomyces Mycobacterium Clostrium Campylobacter Enterobacteriaceae Bacteroides Gram - Neisseria Moraxella Pseudomonas Acinetobacter Veillonella (Porphyromonas, Prevotella) Vibrio Fusobacterium Hemophilus

13 직접검사에의한감염병진단 I 감염증및감염부위피부감염창상감염피부, 손발톱및모발감염 검사소견 그람양성구균 (GPC) 포도송이 (cluster) 사슬모양 (chain) 10% KOH 표본에서균사와포자관찰 (Hyphae, Spore) 추정미생물 Staphylococcus Streptococcus 피부사상균 위염, 위궤양 그람음성만곡된간균 (Gram-negative curved rod) Helicobacter

14 직접검사에의한감염병진단 II 감염증및감염부위생식기감염 검사소견 백혈구내의그람음성쌍구균 (Gram-negative diplococci) 추정미생물 임균 (gonococcus) 질염 Wet smear, 그람염색 : 가균사, 효모 (Pseuohyphae, yeast) Wet smear: 운동성있는편모충 그람염색 : 작은그람음성간균으로덮힌상피세포 (Clue cell) Candida Trichomonas Gardenella

15 항원 / 항체검사 I

16 항원 / 항체검사 II

17 세균배양 세균배양시고려사항 검체접종배지의선택 배양조건의결정 : 온도, 시간, 환경 동정방법의결정 항균제감수성시험의필요성및방법 세균배양실패원인 모든세균이증식할수있는배지없음 원인균에적합한배지사용필요 항균제의사용

18 검체채취 검체접수 검체접종 1 일 결과보고 3-4 일 균종동정 감수성시험 집락관찰 2-3 일

19 배양결과의해석 상재균이없는검체 혈액, 뇌척수액, 관절액을포함한각종체액등 증식하는모든세균 : 채취시오염균배제 상재균이있는검체 객담, 요, 변및생식기검체등 상재균또는다른세균보다우세한세균의분리 동일세균의반복분리 병원균의분리

20 혈액배양 (Blood culture)

21 혈액배양의필요성 적절한항균제선택의지침제공 감염세균의종류를알고환자의예후예측 적절한감염관리지침의기초제공

22 채혈량 혈액배양양성율에가장중요한영향인자 균혈증환자의혈액에는소수의세균이존재 채혈량이많을수록양성율증가 2 ml 채혈과 20 ml채혈을비교 양성율이 20-50% 증가 성인 : 10 ml, 소아 : 1-5 ml를채혈하여혈액양의 10배이상되는액체배지에접종

24 채혈회수 3회채혈이원칙 간헐적균혈증에서 24시간내에 20 ml씩 3번배양 한검체의양성율 80% 두검체의양성율 90% 세검체의양성율 99% 연쇄구균성심내막염환자에서는두번의혈액배양을시행하면 98% 의환자가양성

26 채혈시기 항균제를사용하기전 간헐적균혈증 열이나기직전, 열이나기시작할때 5분간격또는서로다른부위에서동시에채혈 지속적균혈증 ( 감염성심내막염 ) 급성심내막염 : 병원성이강한세균, 즉시채혈 아급성심내막염 : 30분 1시간간격으로채혈

28 채혈방법 혈액배양에는다량의액체배지를사용 소량의오염세균이들어가도증식 철저한피부소독필요 (Betadine 2분 ) shunt나 catheter에서는채혈금지 체내에삽입된인공장치에는정착된세균 주사부위위쪽혈액은희석 아래쪽혈관채혈 혈액은채혈즉시배지에접종 : 호기성배양병, 혐기성배양병

29 혈액분리세균의임상적의의 Microorganism True Contaminant Unknown S. aureus CNS S. pneumoniae Viridans Streptococcus Enterococcus species E. coli K pneumoniae E. cloacae P. aeruginosa C. albicans

30 S. epidermidis 의임상적의의 No. of sets % of positive obtained Significant Contaminant Unknown PPV (%)

31 Central line-associated bloodstream infection (CLABSI)

33 제거가어려운카테터연관혈류감염 중심정맥관또는 Venous access ports 진단방법 2회의혈액배양시행 1회의말초혈액배양, 1회의 catheter 무균채혈 해석 2회의혈액배양에서동일균주증식 Catheter 배양이 2시간먼저검출또는 5배이상증식

34 제거가능한카테터연관혈류감염 일반적인 catheter: aterial catheter, etc 진단방법 2회의혈액배양 제거한 catheter로정량또는반정량배양 해석 1회이상의혈액배양양성 Catheter 에서혈액배양동일균주가 15 집락이상증식

35 호흡기검체배양 (Sputum culture)

36 하부호흡기감염의원인균 원외감염 2개월 5세 : virus (m/c) 30세이하 : M. pneumoniae 노년층 : S. pneumoniae, H. influenzae Aspiration pneumonia: 구강내혐기성세균, S. aureus, Enterobacteriaceae, P. aeruginosa 원내감염 P. aeruginosa, S. aureus, Enterobacteriaceae

37 폐렴감염의진단 감염의종류지역사회폐렴원내폐렴 연령 5 세미만 5-30 세 >60 세전연령전연령 병원체바이러스 Mycoplasma 검사종류 세균 (SPN, HIN, MCA) Chlamydia 결핵균세균 특수염색 X X O X O O 항체검사 O O O O X O 일반배양 X X O X X O 특수배양 O O O O O O (LG) 분자진단 O O O O O O

39 Normal flora in respiratory system Bacterial load in pneumonia CFU/1mL of alveoli secretion Oral normal flora Total bacterial count: CFU/mL of saliva Aerobe:Anaerobe=1:10 Aerobic bacterial load: CFU/mL of saliva Lung secretion 1mL:Saliva 1mL =Pathogen 10 6 CFU/Normal flora CFU =Pathogen 1 CFU/Normal flora CFU

40 검체의채취 폐렴의원인균을찾기객담배양 : 폐렴진단 X 상재균이많은상부기도를통과한검체채취 상부기도오염최소화 ( 상피세포 ) 감염부위검체채취 ( 백혈구 ) 객담배양 : 낮은특이도 채취방법 침이섞이지않게깊은기침으로객담 1-3 ml를채취 여러번모은검체는부적절 ( 상재균의증식 )

41 객담의그람염색 객담의농부분을선택 그람염색후관찰

42 객담배양의해석원칙 상부기도상재균은무시 α/γ-streptococcus Enterococcus species Yeast Non-pathogenic Neisseria species Diphtheroides (Gram-positive rod) 상재균보다우세하게증식 / 반복분리세균 병원균 (M. tuberculosis)

43 객담배양의결과해석 I Gram stain WBC Many Epithelial cell Few Sputum group 5 Culture & ID Predominant Pseudomonas aeruginosa Many α-streptococcus Some Staphylococcus aureus

44 객담배양의결과해석 II Gram stain WBC Many Epithelial cell Few Sputum group 5 Culture & ID Predominant α-streptococcus Many Staphylococcus aureus Some Pseudomonas aeruginosa

45 객담배양의결과해석 III Gram stain WBC Many Epithelial cell Many Sputum group 3 Culture & ID Predominant α-streptococcus Some Pseudomonas aeruginosa Some Staphylococcus aureus

46 Ventilator-associated pneumonia

47 PNU2 폐렴진단기준 (revised) 검체채집방법 폐실질 (Lung parenchyma) 배양결과역치값 10 4 CFU/g tissue 기관지경 (B) 으로얻은검체 Bronchoalveolar lavage(b-bal) Protected BAL(B-PBAL) Protected specimen brushing(b-psb) 10 4 CFU/ml 10 4 CFU/ml 10 3 CFU/ml 기관지경외방법으로얻은 (NB) 검체 NB-BAL NB-PSB 10 4 CFU/ml 10 3 CFU/ml

48 요배양 (Urine culture)

49 요로감염 (Urinary tract infection) 가장흔한감염중의하나 요도, 방광, 신장및전립선등의감염 요배양으로진단 상부요로감염과하부요로감염 위험인자 : 여성, 비뇨기계이상, 기전질환

50 요로감염의종류 카테터관련요로감염 (Catheter-associated UTI) 증상이있는요로감염 (Symptomatic UTI) 무증상균혈증요로감염 (Asymptomatic bacteremic UTI) 기타요로감염 (OUTI) Kidney, ureter, bladder, urethra, 주변조직

51 요로감염의원인균 균종 외래환자 (%) 입원환자 (%) 첫감염재발내과병동중환자실 E. coli P. mirabilis Klebsiella-Enterobacter spp Enterococcus spp Coagulase-negative Staphylococci P. aeruginosa 0 < S. marcescens Others

52 Catheter-associated UTI 진단전 48시간이내에유치도뇨관을가지고있던환자에서발생한 UTI 퇴원후 48시간이내발생한 UTI는이전입원한곳에서발생한감염으로집계

53 요검체채취원칙 정상인의방광안에있는요는무균 채취할때요도의상재균에의해오염 중간뇨채취 가능하면아침첫요를채취 위음성감소 요를본후, 적어도 4시간이지난후채취 과도한수분섭취주의 요를희석하여정량배양의해석이어려움

54 요검체채취방법 검체용기에직접채취 개인용소변기나공용변기채취금지 소아의경우기저귀에뭍은검체채취금지 검체의오염을최소화 방광안의요는무균검체 배뇨중오염 : 요도, 전립선, 피부등

55 Clean-voided midstream urine collection Females 멸균된거즈를이용하여 labia를양옆으로위치 두개의소독스폰지로앞에서뒤로외음부소독 Urethral meatus 오염주의 Circumcised males 특별한준비과정이필요없음 Uncircumcised males 2 개의스폰지로 glans penis 소독 다시 1개의생리식염수스폰지로소독

56 Catheter urine Straight catheter (Nelaton) 무균적방법 (Aseptic technique) 으로시행 첫 15-30mL는버리고다음요를채취 Foley catheter 캘리등으로 catheter tube 차단 70% alcohol ball 등으로 catheter port 부위소독 주사기이용하여요채취 Catheter bag에들어있는요는배양금지

57 유치도뇨관에서요배양시검체를채취해야하는곳은?

58 요검체의보관및운송 요검체용채취즉시운송및접종 접종지연시 2시간까지실온보관 24시간까지냉장보관 냉동 (freeze) 금지 E. coli doubling time: 20min 2 시간 : 6 번의 doubling time 2 6 증가 (64 배 )

59 요배양의결과해석 요검체 환자 감염균가능성 (+) PP (CFU/mL) LE 감염균가능성 (-) 감염균가능성추정소견 여자, 방광염 > PP < PC 중간뇨 여자, 신우신염 > PP < PC PP in neutrophils 남자, 요로감염 > PC > PP >10 3 PP in neutrophils 무증상균뇨증 > PP <10 5 & PP < PC 새검체로재검 Straight 카테터모든환자 >10 2 +, Sx (+) PP <10 2, LE (-) PP in neutrophils 유치카테터 모든환자 >10 3 ( 여러균종분리가능 ) Sx (-) 증상없으면배양가치없음

60 창상및농배양 (Wound & pus culture)

61 창상감염의원인균 수술이나부상으로인한피부또는점막의손상 감염, 농양 병원체의종류는감염원인또는부위에따라다름 S. aureus, S. pyogenes, Enterobacteriaceae ( 개방성궤양 ), P. aeruginosa, Anaerobes Vibrio vulnificus (Bulla), Clostridium spp. (Myositis)

65 분자진단 (Molecular diagnostics)

66 Polymerase Chain Reaction PCR 의용도 특정유전자의증폭 증폭효율 이론적 : 2 n (10 9, 30 cycle) 실제적 : (1+e) n (10 6 ) PCR 의장점 미량의 DNA 요구 신속한결과 PCR 의문제점 매우큰 DNA 는분석이어려움 알려진염기서열만가능 오염에민감 엄격한정도관리

67 감염질환의분자유전학적진단 임상검체에서세균의직접검출 중증감염질환 : 균혈증, 수막염 항균제투여후원인균의검출 배양이어렵거나불가능한세균의검출 성매개감염질환 : N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. pallidum, etc 폐렴 : L. pneumophila, C. pneumoniae, M. pneumoniae, etc 감시배양검체에서직접항균제내성균검출 단일유전자에의한내성기전검출에유용 MRSA (meca gene), VRE (vana gene)

68 분자진단결과의제한점 분자진단양성이모두감염질환은아님 죽은세균검출 ( 현재감염과과거의감염 ) C. trachomatis: 완치후 3 주뒤까지 PCR 양성 오염, 정착균의검출 위양성과위음성 위양성 : DNA/RNA 오염, 시발체의잘못된디자인 위음성 : 검체에존재하는억제제 내부정도관리물질필수

69 항균제감수성시험 (Antimicrobial susceptibility test)

70 항균제감수성검사의필요성 항균제내성 나라, 지역및시기 내성균주의확산및항균제선택압력 내성양상이상이 감염균에가장효과적인항균제를선택 Resistant or less-susceptible bacteria are associated with a reduced possibility of clinical favorable outcome: rule (Baquero F ECCMID)

71 Rex, J.H., et al. Clin Infect Dis 2002

72 항균제의분류 Class 같은계열의항균제 Spectrum과항균력이거의동일 검사결과를동일 class내의다른항균제에적용가능 Cluster 시험결과의해석이거의같고임상효과도유사 Related group Spectrum과결과해석이거의동일 거의완전한교차감수성및교차내성을보임

73 Table 1. Antibacterial susceptibility results that may be extrapolated Test Drugs Organisms Drugs for which result can be extrapolated Penicillin G Staphylococcus spp. Neisseria gonorrhoeae Ampicillin, amoxicillin, carbenicillin, mezlocillin, ticarcillin, piperacillin, etc Ampicillin All Amoxicillin, bacampicillin, etc Ampicillin Enterococcus spp. Penicillin Oxacillin Staphylococcus spp. All β-lactam antibiotics Cephalothin Erythromycin Enterobacteriaceae Gram-positive cocci Cephapirin, cephradine, cephalexin, cefaclor, and cefadroxil but not other cephalosporins Azithromycin, clarithromycin, dirithromycin, roxithromycin Clindamycin All Lincomycin Tetracycline All (Except Staphylococcus, ENT, and Acc spp. Doxycycline, minocycline, chlortetracycline, demeclocycline, oxytetracycline, methacycline Sulfisoxazole All All sulfonamide Cephalothin or cefazolin Enterobacteriaceae Susceptibility to broad-spectrum cephalosporins From Manual of Clinical Microbiology 9 th. Ed.

74 MIC & MBC 최소억제농도 (Minimum Inhibitory Concentration) 육안으로균의증식을억제하는최소농도 최소살균농도 (Minimum Bactericidal Concentration) 균의 99.9% 를살균하는최소농도

75 항균제감수성검사의진행 항균제 MIC Breakpoint 세균 MIC > BP Resistant 환자 MIC < BP Susceptible

76 감수성결과의해석 Breakpoint > MIC 감수성 (Susceptible) 감염이권장되는용량의항균제로치료될수있음 Breakpoint < MIC 내성 (Resistant) 일반적인용량으로는치료되지않음 중간 (Intermediate) 시험균주에대한항균제의 MIC 가혈중이나조직농도와비슷, 치료효과가감수성인균주에비해낮음 요등항균제가농축되는부위의감염이나다량으로투여가가능한항균제에의해치료효과있음 감수성시험시의기술적인과오를피하기위한완충대

77 E. coli 감수성결과해석 Ampicillin Cefazolin Cefotaxime Cefepime Meropenem Gentamicin Levofloxacin S S S S S R I 일반적인용량으로치료되지않음 권장되는용량의항균제로치료 시험균주의 MIC 가혈중농도와비슷치료효과가감수성균주에비해낮음항균제가농축되는부위의감염이나고용량항균제에치료효과있음

78 Single oral dose adminstration: Ofloxacin 400mg and Gemifloxacin 320mg CLSI Breakpoint in Enterobacteriaceae Ofloxacin: Susceptible 2 µg/ml, Resistant 8 µg/ml Intermediate 2 µg/ml, 8 µg/ml Gemifloxacin: Susceptible 0.25 µg/ml, Resistant 1 µg/ml Intermediate 0.5 µg/ml Naber C.K., et al. Antimicrob Agents Chemother 2001

79 E. coli 감수성결과해석 Ampicillin S Cefazolin S CSF??? 일반적인용량으로치료되지않음 Cefotaxime S Cefepime S 권장되는용량의항균제로치료 Meropenem S Gentamicin Levofloxacin R I 시험균주의 MIC 가혈중농도와비슷치료효과가감수성균주에비해낮음항균제가농축되는부위의감염이나고용량항균제에치료효과있음

80 Table 5. Comparison of antibiotics concentrations in serum and CSF Antibiotics Dose Concentrations (µg/ml) in Serum Ampicillin 15mg/Kg, IM Cefazolin 6g/Day, IV Cefotaxime g/Day, IV Imipenem 4g, IV Meropenem 40mg/Kg, IV Ciprofloxacin 0.2g, IV Doxycycline 400mg/Day, PO Warning Should not be reported for CSF isolates Agents Administered by oral route only 1 st and 2 nd generation cephalosporins (Except Cefuroxime parenteral) Macrolides and clindamycin Tetracyclines Fluoroquinolones CSF From Antibiotics in Laboratory Medicine, 4 th Ed.

81 감염관리 (Infection Control)

82 Microbiological and Clinical alerts 중요한항균제내성균주경보 (Expert rule) 200여개의내성균주전문정보입력 ( 추가입력가능 ) 주요내성균주 : MRSA, VRE, MRPA, MRAB 새로운내성균주 (Emerging resistance): VRSA, CRE 경보의종류 경보의종류 : 주요균주또는주요내성균주 균주보관및 reference lab 균주의뢰 감염관리팀경보전달 Therapy comment 우선순위설정가능

83 주요감염관리균주또는내성균주여부 우선순위또는위험도정도 분리균주수및병동

84 원내감염의전파 매개체 =?

85 Genotyping Biotyping Table 3. Characteristics of epidemiological typing systems Typing system Proportions of strains typeable Reproducibility Discrimimatory power Ease of interpretation Ease of Performance Biotyping All Poor Poor Excellent Excellent Antimicrobial susceptibility All Fair Poor Excellent Excellent Serotyping Most Good Fair Good Fair Bacteriophage typing Most Fair Fair Fair Poor MLEE All Excellent Good Excellent Good Plasmid resistriction digests Most Good Good Good Excellent REA All Good Good Poor Excellent Ribotyping All Excellent Fair Good Good PFGE All Excellent Excellent Excellent Good PCR based on repeated sequences All Excellent Good Excellent Good AP-PCR All Good Good Good Good Restriction digests of PCR products All Fair Good Fair Good Nucleotide sequence analysis All Excellent Excellent Excellent Fair

86 Biotyping and AST profile Biotyping 균종동정 : 세균의생화학적반응 동일균종내에서도일부반응다름 자동화장비 : 수십가지의생화학적반응사용 AST profile: 동일한항균제감수성양상 Disk diffusion Minor discrepancy: Intermediate S or R Microbroth dilution Minor discrepancy MIC: 1단계이내의차이는실험실오차범위이내

87 자동동정장비 (Vitek 2 & MicroScan) Panel 세균동정검사 (27) 세균동정검사 (27) 항균제감수성감사 (MIC 법 )

88 Galar A., et al. PLoS One 2013

89 Molecular typing Molecular typing 세균의유전자를분석하여역학적연관성을규명 Molecular typing법의분류 : 분석대상유전자 Clonal spread Genome 또는특정유전자 Horizontal spread 내성유전자 Plasmid

90 병원균의원내전파 매개체 =?

91 Table 4. Commonly used epidemiological typing systems in VRE Typing system Target Interpretation Application PFGE Whole chromosome Bacterial isolates Clonal spread (Short term) MLST Multiple housekeeping genes Bacterial isolates Clonal spread (Long term) Tn1546 typing Tn1546 Resistant gene Horizontal spread Tn1546 analysis Tn1546 Resistant gene Horizontal spread PFGE: Pulsed-field gel electrophoresis MLST: Multilocus sequence typing

Microsoft PowerPoint - 3.이혁민

Microsoft PowerPoint - 3.이혁민 감염관리를위한진단검사 관동의대진단검사의학교실 부교수이혁민 검사실의원내감염관리에서역할 ( 병원 ) 감염질환진단을위한검사 지속적인감염관리자료보고 보균자및병원환경의감시배양 역학검사 세균의분류및명칭 계 (kingdom) 문 (division) 강 (class) 목 (oder) 과 (family) 속 (genus) 종 (species) 균종 주 (strain) 균주